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Method Article
Um procedimento simples de vibratome seccionando o órgão de Corti, seguido por microscopia confocal e imuno-histoquímica é descrito. Este procedimento permite uma melhor preservação da citoarquitetura fino do órgão de Corti de mamíferos e, conseqüentemente, permite a quantificação precisa dos tipos de células.
O órgão de mamíferos de Corti é um mosaico altamente ordenada celular de cabelo e não-sensorial mecanosensorial células de suporte
(Revisto em 1,2). Visualização deste mosaico celulares freqüentemente requer que o órgão de Corti é transversa. Em particular, o pilar não-sensorial e células Deiters ', cujos núcleos estão localizados basally com relação às células ciliadas, não pode ser visualizada sem cross-seccionando o órgão de Corti. No entanto, a citoarquitetura delicada do órgão de Corti de mamíferos, incluindo os processos de multa citoplasmática do pilar e células Deiters ', é difícil de preservar pela rotina de procedimentos histológicos, tais como parafina e crio-seccionamento, que são compatíveis com as técnicas de coloração imuno-histoquímica.
Aqui eu descrevo um procedimento simples e robusta consistindo de vibratome seccionamento da cóclea, coloração imuno-histoquímica destas seções vibratome no monte todo, seguido por microscopia confocal. Este procedimento tem sido utilizado amplamente para a análise immunhistochemical de múltiplos órgãos, incluindo o broto de membro mouse, gut zebrafish, fígado, pâncreas e coração (ver 3-6 para exemplos seleccionados). Além disso, este procedimento foi bem sucedida para ambos imagem e quantitificaton do número de células em órgãos pilar mutante e controle de Corti em ambos os embriões e camundongos adultos 7. Este método, no entanto, atualmente não é amplamente usado para examinar o órgão de mamíferos de Corti. O potencial para este procedimento para tanto proporcionar a preservação do maior bem citoarquitetura do órgão de Corti e adultos permitem a quantificação de vários tipos celulares é descrito.
1. Isolamento e fixação do ouvido interno
2. Corte de secções vibratome
3. Anticorpo seções vibratome coloração
Prosseguir com anticorpos mancha. Secções de processo em todo o monte, de livre flutuação em solução. Abaixo está um exemplo protocolo de coloração de anticorpos para o marcador S100 das células pilar do órgão de Corti, mas o protocolo pode ser usado para qualquer anticorpo. Todas as lavagens são realizadas à temperatura ambiente salvo indicação em contrário.
4. Seções de montagem em lâminas e microscopia confocal
Para evitar o esmagamento de espessura com a lamínula, ao montar seções individuais, um espaçador deve ser inserido entre a lâmina de microscópio e as lamelas. Abaixo estão dois métodos alternativos de montagem seções vibratome grossa:
5. Resultados representativos:
A confocal representante z pilha através de uma seção vibratome, manchado para a proteína S100, que está presente na coluna e células Deiters "e contrastado com um corante nuclear (Fig. 3A-F). Cada painel é a imagem confocal tomada em 3 m-passos, com o painel A da imagem confocal obtido mais próximo à superfície da seção vibratome e painel de F a imagem confocal obtido mais internamente dentro da seção vibratome. A morfologia do órgão de Corti parece minimamente perturbado. Em particular, as extensões citoplasmáticas das células pilar não estão quebrados. Observando o aparecimento e desaparecimento de núcleos de células pilar através do z-stack (Fig. 3A a 3F), tanto o número de células interiores e exteriores pilar podem ser contadas (ver numeração, Fig. 3A -. F). Devido ao pequeno número de cada tipo de célula por imagem confocal, esta abordagem pode ser usada para contar a maioria dos tipos celulares dentro do órgão de Corti.
Figura 1. Intactas, 15 semanas de idade, adultos ouvidos internos encerrado na cápsula ótica. (A) A cápsula ótica direita (entre colchetes) encerrado no crânio, visto de um ponto de vista de dentro da cabeça, após a remoção do cérebro. Anterior é para a direita. (B) intactas, 15 semanas de idade ouvidos internos após a dissecção do crânio. Superfície lateral da orelha esquerda interior é visível; face medial da orelha direita interior é visível. Etiquetas indicam os locais da anterior canal semi-circular (asc), co (cóclea), e ow (janela oval).
Figura 2. (A) da orelha interna inteiro de um adulto de 15 semanas de idade, embutido em agarose no centro de um molde de Peel-Away. Plano destina de seção é indicado. (B) imagem Close-up of a 15 semanas de idade, a orelha todo interior antes de incorporação. Uma parte do osso circundante foi dissecada de modo que o labirinto membranoso poderia um visto mais claramente. O canal semi-circular lateral (LSC), canal semi-circular anterior (asc), e cóclea (co) são traçados (curvas de branco). O giro basal da cóclea (seta) eo plano da seção destina (linha tracejada) são indicados. (C) Representante cross-section através da cóclea. Em uma seção transversal através do ducto coclear, o órgão de Corti (oC) é em caixa, da estria vascular (sv) está entre colchetes, e membrana de Reissner (Rm) é indicado.
Figura 3. O órgão de Corti em um rato do tipo selvagem em P21. (AF) da série Sequential confocal, a um passo células 3 mm de tamanho, através de um órgão S100-anticorpo manchada de Corti para visualizar as células pilar e Deiters '. Contagens de células pilares internas e externas desde o início até o fim da série são contados. Abreviaturas: IHC (células ciliadas), aIHC (células ciliadas adjacentes interior), OHC (células ciliadas externas), PC (células pilar), DC (células Deiters ').
O procedimento de corte vibratome, seguido por imagem imunohistoquímica e confocal permite a visualização do órgão de Corti com dano tecidual mínimo. Claramente, as imagens tiradas de confocal regiões do interior da seção vibratome mostram excelente preservação da morfologia celular, que é limitada apenas por artefatos de fixação. Confocal imagens tomadas perto das duas superfícies de corte de uma seção vibratome são muitas vezes indistinguíveis a partir de imagens de regiões internas, embora ocasion...
O autor gostaria de reconhecer o uso de Investigação de Crianças Núcleo de Imagem Instituto de microscopia confocal e Jian Zhang para a sugestão de montar seções usando pérolas de agarose. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder DC010387.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
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Leica VT1000S vibratório Lâmina micrótomo | Leica | ||
Zeiss LSM510 laser de microscópio de varredura confocal | Zeiss | ||
Estudante Dumont # 5 Pinça | Multa Ferramentas Ciência | 91150-20 | |
UltraPure baixo ponto de fusão Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
Peel-A-Way molde incorporação | Polysciences | 18.986 ou 18646A | |
albumina de soro bovino | ImmunoResearch Jackson | 001-000-162 | |
O soro de cabra | Invitrogen | 16210-064 | |
S100 | Dako | Z0311 | |
Alexa Fluor 568 cabra anti-IgG de coelho | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 diluição |
Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
graxa de vácuo | Pescador | S41718 | |
Affi-Gel Gel Azul | Bio-Rad | 153-7301 |
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