A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
הליך פשוט של vibratome חתך את האיבר של קורטי, ואחריו מיקרוסקופיה אימונוהיסטוכימיה ו confocal מתואר. הליך זה מאפשר שימור משופר של cytoarchitecture את הקנס של האיבר של קורטי יונקים, וכתוצאה מכך מאפשר כימות מדויק של סוגי תאים.
האיבר של קורטי יונקים הוא פסיפס הסלולר הורה מאוד של שיער mechanosensory ותאים תומכים nonsensory
(הנסקרת ב 1,2). ויזואליזציה של הפסיפס הזה הסלולר לעתים קרובות מחייב את האיבר של קורטי הוא בחתך רוחב. בפרט, עמוד nonsensory ותאי "Deiters, שאת הגרעינים נמצאים basally ביחס לתאי שיער, לא יכול להיות דמיינו מבלי לחצות חתך את האיבר של קורטי. עם זאת, cytoarchitecture עדין של האיבר של קורטי היונקים, כולל תהליכים cytoplasmic קנס של העמוד ותאי "Deiters, קשה לשמור על נהלים היסטולוגית שגרתיות כגון פרפין cryo-חתך, אשר תואם תקן טכניקות צביעה immunohistochemical.
הנה אני מתארת תהליך פשוט וחזק המורכב vibratome חתך של שבלול, מכתים immunohistochemical מהסעיפים האלה vibratome בהר שלמה, ואחריו מיקרוסקופיה confocal. הליך זה כבר בשימוש נרחב לניתוח immunhistochemical של איברים מרובים, לרבות ניצן העכבר איבר, בטן דג הזברה, כבד, לבלב, לב (ראו 3-6 דוגמאות נבחרות). בנוסף, הליך זה היה sucessful הדמיה והן quantitificaton של מספר העמוד תא באיברים מוטציה ובקרה של קורטי בשני עוברי עכברים בוגרים ו 7. שיטה זו, עם זאת, כרגע לא בשימוש נרחב לבחון את איבר יונקים של קורטי. הפוטנציאל עבור הליך זה הן לספק שימור משופר של cytoarchitecture את הקנס של איבר הבוגרת של קורטי לאפשר כימות של סוגי תאים שונים מתואר.
1. בידוד קיבוע פנימי של האוזניים
2. חיתוך חלקים vibratome
3. מכתים נוגדן vibratome בסעיפים
המשך עם נוגדן הכתם. תהליך מקטעים שלמים הר, ריחוף ללא פתרון. להלן נוגדן למשל מכתים פרוטוקול סמן S100 של תאים מעמודי התווך של האיבר של קורטי, אבל הפרוטוקול יכול לשמש נוגדן כלשהו. שוטף כל נערכות בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.
4. חלקים הרכבה על שקופיות מיקרוסקופיה confocal
כדי למנוע ריסוק בסעיפים עבה עם coverslip, כאשר גובר חלקים בודדים, spacer חייב להיות מוכנס בין שקופיות מיקרוסקופ ואת coverslip. להלן שתי שיטות חלופיות של חלקים הרכבה vibratome עבה:
5. נציג תוצאות:
Confocal נציג Z-מחסנית באמצעות קטע vibratome, מוכתם עבור חלבון S100, אשר שוהה עמוד ותאי "Deiters, ו counterstained עם צבע גרעיני (איור 3A-F). פאנל כל התמונה confocal נלקחה ב 3 מיקרומטר, צעדים, עם פאנל התמונה confocal שהושגו הקרובים אל פני השטח של סעיף הפאנל vibratome ו-F התמונה confocal השיג רוב פנימי בתוך הקטע vibratome. מורפולוגיה של האיבר של קורטי מופיע שיבשו מינימלית. בפרט, שלוחות cytoplasmic של תאים עמוד אינם שבורים. לפי לציין את המראה ואת היעלמותו של גרעיני תאים באמצעות עמוד מחסנית-z (איור 3A ל 3F), תא פנימי וחיצוני כאחד מספר העמוד ניתן לספור (ראה מספור, איור 3A -. F). בשל המספר הקטן של כל סוג תא לכל תמונה confocal, גישה זו ניתן להשתמש כדי לספור תאים מסוגים ביותר בתוך האיבר של קורטי.
באיור 1. אינטקט, 15 בן שבועיים, האוזניים הפנימי מבוגר עטוף הקפסולה otic. (א) קפסולה otic ימינה (בסוגריים) עטוף הגולגולת, שנצפו מנקודת מבט של בתוך הראש, לאחר ההסרה של המוח. Anterior נמצאת מימין. (ב) שלמים, 15 שבועות בן באוזן הפנימית לאחר דיסקציה מהגולגולת. משטח הרוחב של האוזן הפנימית שמאל גלוי; השטח המדיאלי של האוזן הפנימית זכות גלוי. תוויות לציין את מיקומם של הקדמי חצי עגול תעלה (עולה), שיתוף (שבלול), ו ow (חלון סגלגל).
איור 2. (א) האוזן הפנימית שלמים מן מבוגר 15 בן שבוע, מוטבע agarose במרכז עובש פיל פרידה. המטוס מיועד סעיף מצוין. (ב) תקריב תמונה של אוזן, 15 בן שבועיים פנימי שלם לפני ההטבעה. חלק מן העצם שמסביב כבר גזור משם כך מבוך קרומי יכול לראות בצורה ברורה יותר. התעלה לרוחב חצי עגול (LSC), תעלה קדמית חצי עגול (עולה), וכן שבלול (במשותף) הם לייחס (עקומות לבן). להפוך את הבסיס של שבלול (ראש חץ) והמטוס נועד סעיף (קו מקווקו) מצוינים. (ג) נציג CROss-קטע דרך שבלול. בחתך אחד דרך צינור שבלול, האיבר של קורטי (OC) הוא התאגרף, vascularis stria (ד"ה) הוא בסוגריים, ואת הממברנה של Reissner (RM) מצוין.
איור 3. איבר קורטי בעכבר wild-type ב p21. (AF) סדרה confocal סדרתית, על תאים 3 מיקרומטר צעד בגודל, דרך איבר S100 נוגדן מוכתם של קורטי לדמיין את התאים העמוד Deiters ". ספירת התאים עמוד הפנימיים והחיצוניים מההתחלה עד הסוף של הסדרה ממוספרים. קיצורים: IHC (תא השיער הפנימי), aIHC (שיער סמוך התאים הפנימית), OHC (תא השיער החיצונית), מחשב (תא העמוד), DC (תא 'Deiters).
ההליך של חתך vibratome, ואחריו הדמיה אימונוהיסטוכימיה ו confocal מאפשר להדמיה של האיבר של קורטי עם נזק לרקמות מינימלית. ברור confocal תמונות שנלקחו האזורים הפנימיים בסעיף vibratome להראות שימור מעולה של מורפולוגיה תאית מוגבל רק על ידי חפצים קיבעון. תמונות שצולמו Confocal קרוב לשני משטחי...
המחבר מבקש להודות השימוש המחקר Core הילדים הדמיה המכון מיקרוסקופיה confocal ד"ר ג'אנג ג'יאן על ההצעה לעלות חלקים באמצעות חרוזים agarose. עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH DC010387.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | הערות (אופציונלי) |
---|---|---|---|
לייקה VT1000S רטט Blade Microtome | לייקה | ||
Zeiss LSM510 סריקת לייזר confocal מיקרוסקופ | Zeiss | ||
סטודנט דומון # 5 מלקחיים | המדע כלים פיין | 91150-20 | |
טמפ 'התכה נמוכה ultrapure agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
פיל-A-Way הטבעה עובש | Polysciences | 18986 או 18646A | |
שור בסרום אלבומין | ג'קסון ImmunoResearch | 001-000-162 | |
עיזים סרום | Invitrogen | 16210-064 | |
S100 | Dako | Z0311 | |
אלקסה פלואוריד 568 עיזים נגד ארנב IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 דילול |
Vectashield | וקטור Labs | H-1000 | |
YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
ואקום גריז | דיג | S41718 | |
Affi-Gel ג'ל כחול | Bio-Rad | 153-7301 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved