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immunohistochemistry과 공촛점 현미경 다음 Corti의 기관을 sectioning vibratome의 간단한 절차 설명합니다. 이 절차는 Corti의 포유 동물 장기의 벌금 cytoarchitecture 개선 보존을 허용하고, 결과적으로 세포 유형의 정확한 양을 정함을 허용합니다.
Corti의 포유류의 기관은 mechanosensory 머리 nonsensory 지원 세포의 높은 주문한 세포 모자이크입니다
(1,2에서 검토)이 세포 모자이크. 시각화는 종종 Corti의 기관 간 sectioned되어 있어야합니다. 특히, 그의 핵 세포와 관련하여 basally 있습니다 nonsensory 기둥과 Deiters '세포는, Corti의 오르간을 교차 sectioning없이 시각 수 없습니다. 그러나, 기둥 및 Deiters '세포의 미세 세포질 프로세스를 포함 Corti의 포유류의 기관의 섬세한 cytoarchitecture는, 표준 immunohistochemical 얼룩 기술과 호환되는 이러한 파라핀과 cryo - sectioning 같은 일상 histological 절차에 의해 보존하기가 어렵습니다.
난 여기 공촛점 현미경 다음 달팽이관 전체 마운트 이러한 vibratome 섹션 immunohistochemical 얼룩의 sectioning vibratome 구성된 단순하고 강력한 절차를 설명합니다. 이 절차는 마우스 사지 봉오리, zebrafish 굿, 간, 췌장, 그리고 마음 (선택한 예제 3-6 참조)를 포함하여 여러 기관의 immunhistochemical 분석 널리 사용되고 있습니다. 또한이 절차는 배아와 성인 생쥐 일곱 모두 Corti의 돌연변이 및 제어 장기 기둥 휴대폰 번호의 이미징 및 quantitificaton 모두 sucessful했다. 이 방법은 그러나, 현재 널리 Corti의 포유 동물 장기를 검사하는 데 사용되지 않습니다. Corti의 성인용 기관의 벌금 cytoarchitecture의 향상된 보존을 제공하고 다양한 세포 유형의 부량 수 있도록 모두이 절차에 대한 가능성을 설명합니다.
1. 내부의 귀를 분리 및 고정
2. vibratome 섹션을 절단
3. 항체 얼룩의 vibratome 섹션
항체는 얼룩 진행합니다. 솔루션에 무료 부동 전체 - 마운트의 프로세스 섹션. 아래 Corti의 기관의 기둥 세포의 S100 표시에 대한 예제 항체 얼룩 프로토콜이지만, 프로토콜은 모든 항체에 대해 사용할 수 있습니다. 별도의 언급이없는 한 모든 세척은 상온에서 실시하고 있습니다.
4. 슬라이드 및 공촛점 현미경에 장착 섹션
coverslip으로 두꺼운 부분을 깔아 뭉 갠다고 방지하기 위해, 각각의 섹션을 장착하면, 공백은 현미경 슬라이드와 coverslip 사이에 삽입해야합니다. 아래 두꺼운 vibratome 섹션을 장착 두 가지 다른 방법은 다음과 같습니다
5. 대표 결과 :
기둥과 Deiters '세포에 존재하고, 핵 염색 (그림 3A - F)와 counterstained S100 단백질에 대한 스테인드 vibratome 섹션을 통해 대표 공촛점 Z - 스택. 각 패널은 패널, 3 μm의 - 단계에서 촬영한 공촛점 이미지 공촛점 이미지 vibratome 섹션 패널 F vibratome 섹션 내에서 가장 내부 얻은 공촛점 이미지의 표면에 가까운 얻을. Corti의 기관의 형태는 최소한 방해가 나타납니다. 특히, 기둥 세포의 세포질 확장이 깨진되지 않습니다. Z - 스택 (그림의 3A 층)를 통해 기둥 세포 핵의 모양과 실종 사건을 지적하여 모두 내부와 외부 기둥의 휴대폰 번호는 (. - F 번호, 그림 3A 참조) 계산하실 수 있습니다. 공촛점 이미지마다 각각의 셀 타입의 소수으로 인해,이 접근법은 Corti의 기관 내에서 가장 셀 유형을 계산하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1. 손대지 15 주 된, 어른 내부 귀는 귀의 캡슐으로 쌌다. (A) 오른쪽 귀의 캡슐 (괄호)는 두뇌의 제거 후, 머리 내부의 밴티지 포인트에서 조회, 두개골으로 쌌다. 앞쪽에는 오른쪽에 있습니다. (B) 손상, 15 주 된 내부 귀 두개골의 절개 후. 왼쪽 내이 (内耳)의 측면 표면은 표시되며 오른쪽 내이 (内耳)의 중간 표면은 볼 수 있습니다. 레이블은 앞쪽에 반 원형 운하 (ASC), 공동 (달팽이관), 그리고 아야 (난원 창)의 위치를 나타냅니다.
그림 2. 필 - 어웨이 금형의 중심에 아가로 오스에 포함된 15 주 된 성인에서 (A) 전체 내이 (内耳). 섹션의 대상 비행기가 표시됩니다. 전에 삽입하기 15 주 된, 전체 내이 (内耳)의 (B) 클로즈업 이미지. 막의 미로 더 명확하게 본 수 있도록 주위의 뼈 부분은 거리를 해부했습니다. 측면 세미 원형 운하 (LSC), 앞쪽에 세미 원형 운하 (ASC), 그리고 달팽이관 (공동) (화이트 곡선) 추적하고 있습니다. 달팽이관 (화살촉)의 기초 설정 및 섹션 (점선)의 목적으로 비행기가 표시됩니다. (C) 대표 크로스달팽이관을 통해 S - 절을 참조하십시오. 달팽이 덕트 관통 단면에서 Corti (OC)의 기관이 박스는, 자국 vascularis (SV)는 괄호이며, Reissner의 막은 (RM) 표시됩니다.
그림 3. P21에서 야생 타입 마우스 Corti의 기관. 기둥 세포와 Deiters을 시각화하기 위해 Corti의 S100 항체 묻은 기관을 통해 3 μm의 스텝 크기를 '세포에서 (AF) 선형 공촛점 시리즈. 시리즈의 마지막에 처음부터 내부 및 외부 기둥 세포의 카운트 번호가 있습니다. 약어 : IHC (내부 머리 세포), aIHC (인접 내부 머리 세포), OHC (외부 머리카락 세포), PC (기둥 세포), DC (Deiters '셀).
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immunohistochemistry와 공촛점 이미징 다음 vibratome sectioning의 절차는 최소한의 조직 손상 Corti의 기관의 시각화를위한 수 있습니다. 분명 vibratome 섹션에서 내부 지역에서 가져온 공촛점 이미지는 고정 아티팩트에 의해 제한됩니다 세포 형태 우수 보전을 보여줍니다. 이러한 기둥 세포의 세포질 확장 나누기로 가끔 세포 중단이 (표시되지 않음) 관찰 되었으나 vibratome 섹션의 두 컷 - 표면에 가까운 촬영 ...
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저자는 아가로 오스 비즈를 사용하여 섹션을 탑재하는 제안에 대한 공촛점 현미경 박사 지앤 장을위한 어린이 연구소 이미징 코어의 사용을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 NIH에 의해 투자 DC010387 부여했다.
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시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
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Leica 블레이드 마이크로톰 진동 VT1000S | Leica | ||
자이스 혈구 LSM510 레이저 스캐닝 공촛점 현미경 | 자이스 혈구 | ||
학생 더몬트 # 5 포셉 | 파인 과학 도구 | 91150-20 | |
UltraPure 낮은 녹는 포인트 아가로 오스 | Invitrogen | 16520-050 | |
필 - A - 웨이 포함 금형 | Polysciences | 18986 또는 18646A | |
소 혈청 알부민 | 잭슨 ImmunoResearch | 001-000-162 | |
염소 혈청 | Invitrogen | 16210-064 | |
S100 | Dako | Z0311 | |
알렉사 플루어 568 염소 안티 - 토끼 IgG | Invitrogen | A - 11036 | 1:1000 희석 |
Vectashield | 벡터 실험실 | H - 1000 | |
YO - PRO - 1 | Invitrogen | Y3603 | |
진공 그리스 | 어부 | S41718 | |
Affi - 젤 블루 젤 | 바이오 래드 | 153-7301 |
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