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Method Article
Une procédure simple de vibratome sectionner l'organe de Corti, suivie par microscopie confocale immunohistochimie et est décrit. Cette procédure permet une meilleure conservation de l'cytoarchitecture amende de l'organe de Corti des mammifères, et permet par conséquent d'une quantification précise des types de cellules.
L'organe de Corti des mammifères est une mosaïque très ordonné cellulaires de cheveux et de mécano nonsensory cellules de soutien
(Examiné en 1,2). Visualisation de cette mosaïque cellulaires exige souvent que l'organe de Corti est à section. En particulier, le pilier nonsensory et les cellules de Deiters, dont les noyaux sont situés basale à l'égard des cellules ciliées, ne peuvent être visualisées sans coupes transversales de l'organe de Corti. Toutefois, la cytoarchitecture délicat de l'organe de Corti des mammifères, y compris les processus cytoplasmiques fines du pilier et les cellules de Deiters, est difficile à conserver par la routine des procédures histologiques telles que la paraffine et cryo-coupe, qui sont compatibles avec les techniques standards de coloration immunohistochimique.
Je décris ici une procédure simple et robuste composé de vibratome sectionnement de la cochlée, la coloration immunohistochimique de ces sections vibratome dans la montagne entière, suivie par microscopie confocale. Cette procédure a été largement utilisée pour l'analyse immunohistochimique de multiples organes, y compris le bourgeon de membre de la souris, le poisson-zèbre intestins, le foie, le pancréas et le cœur (voir 3-6 pour des exemples choisis). En outre, cette procédure a été réussie pour les deux imagerie et quantitificaton du nombre de cellules dans les organes des piliers de mutants et de contrôle de Corti à la fois dans les embryons et des souris adultes 7. Cette méthode, cependant, n'est pas largement utilisée pour examiner l'organe de Corti des mammifères. Le potentiel de cette procédure à la fois à assurer la préservation accrue de la cytoarchitecture amende de l'organe de Corti et les adultes permettent de quantifier les différents types de cellules est décrite.
1. L'isolement et la fixation de l'oreille interne
2. Découpage des sections vibratome
3. Anticorps sections coloration vibratome
Procéder à des anticorps tache. Sections de processus dans l'ensemble du montage, flottant dans la solution. Ci-dessous un exemple de protocole de coloration d'anticorps pour le marqueur des cellules S100 pilier de l'organe de Corti, mais le protocole peut être utilisé pour n'importe quel anticorps. Tous les lavages sont effectués à température ambiante, sauf indication contraire.
4. Sections de montage sur des lames et la microscopie confocale
Pour éviter l'écrasement des sections d'épaisseur avec la lamelle, lors du montage des sections individuelles, une entretoise doit être inséré entre la lame de microscope et de la lamelle. Voici deux méthodes alternatives de montage sections vibratome épaisse:
5. Les résultats représentatifs:
Un représentant confocale z-stack à travers une section vibratome, colorées pour la protéine S100, qui est présent dans les cellules et les piliers de Deiters, et contre-colorées avec un colorant nucléaire (Fig. 3A-F). Chaque panneau est l'image confocale prise à 3 um-étapes, avec le panneau A l'image confocale obtenu le plus proche de la surface de la section vibratome et le panneau F l'image confocale obtenu la plus interne au sein de la section vibratome. La morphologie de l'organe de Corti apparaît peu perturbé. En particulier, les extensions cytoplasmiques des cellules piliers ne sont pas brisés. En notant l'apparition et la disparition des noyaux de cellules à travers le pilier z-stack (Fig. 3A à 3F), tant en nombre piliers intérieurs et extérieurs de cellules peuvent être comptés (voir la numérotation, la figure 3A -. F). En raison du petit nombre de chaque type cellulaire par image confocale, cette approche peut être utilisée pour compter la plupart des types de cellules au sein de l'organe de Corti.
Figure 1. Intact, 15-week-vieux, adulte oreille interne enfermé dans la capsule otique. (A) La capsule otique droite (entre crochets) enfermé dans le crâne, vu d'un point de vue de l'intérieur de la tête, après le retrait du cerveau. Antérieure est à la droite. (B) Intact, 15 semaines d'âge oreille interne après dissection du crâne. Surface latérale de l'oreille interne gauche est visible; face médiale de l'oreille droite interne est visible. Les étiquettes indiquent les emplacements de la partie antérieure du canal semi-circulaire (asc), co (cochlée), et OW (fenêtre ovale).
Figure 2 (A). Oreille intérieure entier d'un adulte de 15 semaines, a embarqué dans l'agarose dans le centre d'un moule de Peel-Away. Destiné avion de la section est indiquée. (B) Close-up image d'un 15-semaines-vieille, l'oreille interne entière avant l'enrobage. Une partie de l'os environnant a été disséqué de sorte que le labyrinthe membraneux pourrait une vue plus claire. Le latéraux du canal semi-circulaire (LSC), semi-circulaire antérieure du canal (ASC), et la cochlée (co) sont tracés (courbes blanches). Le tour basal de la cochlée (tête de flèche) et l'avion de la section destinée (ligne pointillée) sont indiqués. (C) représentant Cross-section à travers la cochlée. Dans une section transversale du canal cochléaire, l'organe de Corti (OC) est en boîte, la strie vasculaire (sv) est entre crochets, et la membrane de la Reissner (Rm) est indiquée.
Figure 3. L'organe de Corti dans une souris de type sauvage au P21. (AF) série séquentielle confocale, lors d'une étape cellules 3 microns de taille, grâce à un anticorps S100 teinté organe de Corti de visualiser les cellules pilier et de Deiters. Comtes de cellules piliers intérieurs et extérieurs du début à la fin de la série sont numérotés. Abréviations: IHC (cellules ciliées internes), AIHC (adjacent cellules ciliées internes), ACT (cellules ciliées externes), PC (cellule pilier), DC (cellules de Deiters).
La procédure de sectionnement vibratome, suivi par imagerie confocale immunohistochimie et permet la visualisation de l'organe de Corti à une lésion tissulaire minime. De toute évidence, les images prises à partir confocale régions internes dans la section vibratome montrent une excellente conservation de la morphologie cellulaire qui n'est limitée que par des artefacts de fixation. Images prises confocale à proximité des deux coupe-surfaces d'une section vibratome sont souvent impossibles à distin...
L'auteur tient à remercier l'utilisation de Core pour enfants de l'Institut de recherche pour l'imagerie de microscopie confocale et le Dr. Jian Zhang pour la suggestion de monter des sections en utilisant des billes d'agarose. Ce travail a été financé par le NIH octroi DC010387.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
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Leica VT1000S lame vibrante microtome | Leica | ||
Zeiss LSM510 microscope confocal à balayage laser | Zeiss | ||
Étudiant Dumont # 5 forceps | Outils Fine Science | 91150-20 | |
UltraPure bas point de fusion d'agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
Moisissures intégration Peel-A-Way | Polysciences | 18986 ou 18646A | |
l'albumine sérique bovine | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
Sérum de chèvre | Invitrogen | 16210-064 | |
S100 | Dako | Z0311 | |
Alexa Fluor 568 de chèvre anti-IgG de lapin | Invitrogen | A-11036 | Dilution de 1:1000 |
Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
graisse à vide | Fisher | S41718 | |
Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
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