في الإلتقام الكبد المجراة تلاه تنقية خلايا الكبد الكبد الإرواء

Summary

يجب إجراء دراسة خلايا الكبد البطانية الجيبية (ثانية) مع الخلايا الأولية التي تم الحصول عليها من الحيوان كما لا توجد خطوط الخلايا. هذا الأسلوب يعتمد على الهضم والكبد الطرد المركزي المغاير لتنقية ثانية لزراعة اللاحقة والتجريب.

Abstract

الكبد هو مركز الأيضية للجسم الثدييات وبمثابة تصفية الدم. ويتضح في البنية الأساسية للكبد في الشكل (1) الذي يتكون أكثر من 85 ٪ من كتلة الكبد من خلايا الكبد ، وتتكون النسبة المتبقية البالغة 15 ٪ من الكتلة الخلوية لخلايا كوبفر (KCS) ، والخلايا النجمية (HSCs) ، و الخلايا البطانية الجيبية (ثانية). SECS تشكل جدران الأوعية الدموية داخل الكبد وتحتوي على التشكل داخل متخصصة تسمى نافذي في السيتوبلازم. نوفذة من السيتوبلازم هو مظهر من الثقوب (~ 100 ميكرون) داخل الخلايا بحيث الفعل SECS بمثابة غربال فيه معظم كيلومكرونات ، وبقايا الكيلومكرونات والجزيئات ، ولكن ليس الخلايا ، بالمرور إلى خلايا الكبد وHSCs ¹ (الشكل 1). نظرا لعدم وجود الغشاء القاعدي ، والفجوة بين SECS وتشكيل خلايا الكبد من Disse الفضاء. HSCs تشغل هذه المساحة وتلعب دورا بارزا في التنظيم وردا على طnjury ، وتخزين حمض الريتينويك ومناعي ^لل2 الكبد.

SECS هي من بين الأكثر نشاطا endocytically خلايا الجسم تعرض فيها مجموعة من المستقبلات زبال في كل خلية ³ السطح. وتشمل هذه SR - A ، وStabilin 1 - 2 - Stabilin. عموما ، يتم أخذ الجسيمات الغروية صغيرة أقل من 230 نانومتر ، والجزيئات في المرحلة العازلة بنسبة SECS ، بينما هو endocytosed الجزيئات الكبيرة والحطام الخلوية (phagocytosed) بواسطة KCS ^4. وبالتالي ، فإن إزالة القسم الأكبر من المواد خارج الخلية مثل الجليكوزامينوجليكان من الدم يعتمد بشكل كبير على صحة وظائف التقامي SECS من ^5،6. على سبيل المثال ، زيادة في مستويات hyaluronan الدم يدل على مرض الكبد تتراوح ما بين خفيفة إلى أشكال أكثر خطورة ^7.

باستثناء تقرير واحد ⁸ ، لا توجد خطوط الخلية SEC خلدت في الوجود. حتى هذا الخط هو خلد الخلية دي التفاضليةated في أنه لا يعبر عن مستقبلات زبال التي موجودة على SECS الابتدائية (البيانات المتوفرة لدينا ، لا يظهر). يجب إجراء جميع الدراسات الخلية البيولوجية على الخلايا الأولية التي تم الحصول عليها حديثا من الحيوان. للأسف ، في ظل ظروف SECS dedifferentiate ثقافة موحدة ويجب أن تستخدم في غضون أيام 1 أو 2 على بمعزل عن الحيوان. ويتميز تمايز SECS عن طريق التعبير عن Stabilin - 2 أو مستقبلات هير ⁹ ، CD31 ، ووجود نوفذة حشوية ^1. ويمكن تمديد تمايز SECS بإضافة عامل نمو بطانة الاوعية في وسائل الإعلام أو الثقافة أو عن طريق زرع الخلايا الكبدية في المتوسط ^​​10،11 مكيفة.

في هذا التقرير ، سوف ندلل من النشاط التقامي SECS في الجهاز سليمة باستخدام الراديو المسمى الهيبارين لhyaluronan لمستقبلات Stabilin SEC - 2 - محددة. ثم سنقوم تنقية الكبد وSECS من الكبد perfused لقياس الإلتقام.

Protocol

1. استئصال الكبد (المعتمد من Seglen ص ¹² و ¹³ ر Blomhoff مع تعديلات ^14،15)

1. إضافة 10 مل من 30 ٪ في isoflurane البولي ايثيلين جلايكول إلى طبق بتري في غرفة مغلقة L 5.5. فمن الأمثل للانتظار 10-15 دقيقة بعد إضافة isoflurane لخلق جو استقرت داخل الغرفة.
2. وضع فأر في غرفة مغلقة والسماح لها بأن تصبح تخدير. الآثار الكاملة للتخدير واضحة عندما يصبح الحيوان يعرج ، لا تستجيب ، والمعارض التنفس العميق.
3. 2 مل من مكان isoflurane في البولي ايثيلين جلايكول في بعض الكرات القطنية في الجزء السفلي من أنبوب محقنة 30 مل.
4. وضع فأر على ظهرها على علبة حفاضات المغطاة ووضع أنبوب حقنة على مدى الخطم.
5. تأكيد على الفور من قبل التخدير العميق ترطيب البطن مع الايثانول 70 ٪. لا تدع هذا الحيوان يموت جرعة زائدة isoflurane.
6. باستخدام مقص وملقط ضمادة ، تعرض عبد بأكملهominal تجويف.
7. موقع باب والوريد ، وذلك باستخدام ملقط ، واستخلاص نوعين من الحرير أو خيط البوليستر الجراحية (ربطة) تحت باب الوريد مباشرة فوق فرع المساريقي.
8. سحب ملقط وربطة عنق عقدة الذراع فضفاضة.
9. باستخدام ملقط تحت باب الوريد وسحب بلطف مرة أخرى إلى تصويب هذا السياق ، يقني ؛ يدخل القنية في الوريد مع القسطرة Autoguard Insyte (18 GA ، 1.3 × 300 ملم ، والعلوم البيولوجية دينار بحريني) القسطرة أو ما شابه ذلك. ينبغي أن تذهب القسطرة ملم عدة خارج الحلقة التي شكلتها في الموضوع.
10. سحب وإزالة الإبرة عن طريق الإفراج عن الزناد ربيع تحميلها على القسطرة. وينبغي بدء يتسرب الدم تصل الى القسطرة التنسيب المناسب مشيرا إلى ربطة.
11. تشديد أسفل عقدة الذراع وثبته مع آخر عقدة الذراع.
12. إما قطع الوريد الأجوف السفلي أو الشريان الأورطي النازل (الأبهر البطني) للسماح لاستنزاف الدم من الجهاز الدوري.
13. يبدأ التنظيف في الكبد مع الاوكسيجينTBS في 37 درجة مئوية لإزالة الدم (ابيضاض) بمعدل تدفق قدره 20 مل / دقيقة. ينبغي أن تتحول من الكبد الأرجواني المحمر إلى اللون الطفال.
14. في حين أن الكبد هو بيغ ، استئصال الكبد عن طريق خفض بعيدا الجهاز الهضمي والنسيج الضام. فمن المهم ألا الممزقة الكبد أو ثقب كبسولة من Glisson ل.
15. الكبد مكان على شبكة بلاستيكية على مدى القمع الذي يسمح بجمع المخازن وتعميمها. لا ينبغي أن مخازن عند هذه النقطة يمكن تعميمها ، ولكن تصب في دورق النفايات. وينبغي أن لا بيغ مشاركة أكثر من 10 دقيقة. (الشكل 2A). إعداد الحل المطلوب في الإلتقام 2.1 الخطوة.

2. استيعاب ¹²⁵ I - SA - B - التهاب الكبد (أو مناسبة أخرى يجند المسمى)

1. وسائل الاعلام الى 50 مل RPMI في كوب صغير ، إضافة إلى التركيز النهائي BSA 0.05 ٪ و 0.01 MCI ¹²⁵ I - SA - B - التهاب الكبد أو غيره من يجند المسمى بشكل مناسب لالإلتقام.
2. نعلق هذه الكأس إلى apparatuق للسماح للتهوية.
3. إيقاف المضخة ، تبديل أنابيب مدخل ، ثم تشغيل المضخة في 20 مل / دقيقة.
4. كما RPMI المسمى تقترب من الكبد ، وإيقاف ضخ السوائل الزائدة والسماح في قمع واستنزاف الأنابيب.
5. وضع أنابيب تصب في دورق وسائل الإعلام للسماح للتدوير وسائل الإعلام وصفت وثم إعادة تشغيل المضخة.
6. تسمح إعادة توزيع السوائل من خلال الكبد ليست أكثر من 1 ساعة.
7. خلال هذه الخطوة استيعاب ، تأكد من أن درجة الحرارة في الكبد هو مستقر عليه من خلال تغطية وإعداد كولاجيناز للهضم.

3. هضم الكبد عن طريق الهضم كولاجيناز

1. حل طازجة وتصفيتها (0.45 ميكرون) وينبغي كولاجيناز (100 وزن الفئران ملغ / كلغ) يمكن ان تضاف الى الاحتياطي 2 في إجمالي حجم لا يتجاوز 60 مل عند 37 درجة مئوية. حجم يعتمد على طول / الحجم الداخلي للأنابيب ، وينبغي تبعا لذلك.
2. وقف ضخ وتبادلمدخل أنابيب من الدورق وسائل الإعلام إلى TBS.
3. مسح الكبد لمدة 2 دقيقة في 50 مل / دقيقة والذي يسمح للتخفيف من التقاطعات التي هي الخلية desmosomal الكالسيوم التابعة.
4. في حين أن الكبد هو بيغ ، وتبادل وسائل الاعلام مع الكأس الكأس التي تحتوي على كولاجيناز على الجهاز.
5. مباشرة بعد التنظيف ، وتبدأ عملية الهضم مع كولاجيناز في حلقة الدورة الدموية بمعدل تدفق قدره 20 مل / دقيقة لمدة تصل إلى 15 دقيقة. منذ دفعات كولاجيناز تختلف من عدد كبير ، والتغيرات في كمية ووقت الهضم تحتاج إلى أقصى حد من أجل كل قطعة جديدة من كولاجيناز. كولاجيناز تعتمد أيضا الكالسيوم. إيقاف المضخة وتبديل العازلة وخطوط الغاز من قارورة من ألف إلى باء قارورة نقل خط مياه المجاري من حاوية النفايات باء قارورة (الشكل 2B).
6. وقف ضخ ، إزالة القسطرة ونقل الكبد لصحن يحتوي على 20-30 مل الاحتياطي 1.
7. قشر ظهر محفظة غليسون الكبد ويهز الخليةق في السائل.
8. كما السائل عتامة مع المواد الخلوية ، ونقل الخلايا من خلال شبكة 100 ميكرون تليها الترشيح من خلال شبكة 30 ميكرون ثم الى 50 مل المخروطية على الجليد.
9. إضافة مزيد من الاحتياطي 1 الى الكبد والخلايا من مواصلة هز المصفوفة الكبد ، ونقل السائل إلى شبكة المرشحات والمخروطية.
10. كرر الخطوات 3،7-3،9 حتى يمكن فكها لا أكثر مع اهتزاز خلايا الكبد معقولة.

4. الكبدية وتنقية SEC

1. الطرد المركزي في conicals 50 مل تحتوي على خلايا في 150 x ج لمدة 3 دقائق. لخلايا الكبد وبيليه.
2. نقل جزء غير السائلة التي تحتوي على خلايا لمتني conicals 50 مل جديدة على الجليد.
3. تغسل الكبد تكون إعادة التعليق على بيليه في مخزن 3 و بتكرار الخطوات 4.1 و 4.2 مرات أكثر الثلاثة.
4. في نهاية يغسل ، والكريات هي خلايا الكبد نقية ≥ 97 ٪. للحصول على SECS ، الطرد المركزي كل من ج أنابيبطاف ontaining المجمعة (يحتوي على HSCs ، SECS ، وبعض خلايا الكبد وKCS الصغيرة) في 200 x ج لمدة 10 دقيقة. في 4 درجات مئوية.
5. نضح في العازلة وresuspend جميع الكريات في RPMI 5 مل / جيش صرب البوسنة في 4 درجات مئوية.
6. تجمع الخلايا معا في 2 الأنابيب وإضافة RPMI / جيش صرب البوسنة تصل الى حجم 35 مل.
7. الطرد المركزي في conicals عند 100 x ج لمدة 3 دقائق.
8. جمع أفضل 25 مل من السائل ، ونقل إلى المخروطية نظيفة سعة 50 مل.
9. Resuspend على بيليه في وسائل الإعلام المتبقية 10 مل و 25 مل إضافة مرة أخرى من البرد RPMI / جيش صرب البوسنة والطرد المركزي عند 100 x ج لمدة 3 دقائق.
10. كرر الخطوات من 3.8 و 3.9 مرة أخرى ، تجاهل الخلية بيليه وسائل الاعلام وانخفاض 10 مل.
11. الطرد المركزي في supernatents لSECS بيليه ، KCS وHSCs في 200 x ج لمدة 10 دقيقة. في 4 درجات مئوية.
12. إعداد ثلاث أنابيب 50 مل تحتوي على 20 مل Percoll 25 ٪ في برنامج تلفزيوني على الجليد. الأساس الذي تقوم عليه مع Percoll مل 15 50 ٪ في كل أنبوب.
13. Resuspend الكريات خلية في الحجم الكلي للRPMI 30 مل / جيش صرب البوسنة.
14. تراكب بعناية EACح التدرج مع 10 مل من الخلايا والطرد المركزي عند 900 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
15. ولقد SECS KCS قريبة جدا كثافة طافية ويتم في واجهة ٪ 25/50. HSCs عادة على 25 ٪ / وسائل الإعلام واجهة بسبب ارتفاع الطفو على شكل خلايا الدهون تخزينها. أي خلايا الكبد وخلايا الدم المتبقية لديها أقل buoyancies ومكعبات. نضح من الأعلى إلى الأسفل بالقرب من واجهة ٪ 25/50 وتجاهل هذه المواد.
16. جمع الخلايا في واجهة ٪ 25/50 ونقل إلى المخروطية جديدة مع RPMI الباردة. ينبغي أن يكون الحجم النهائي ~ 40 مل لتخفيف خارج Percoll.
17. الطرد المركزي والمخروطية في 350 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 إلى خلايا بيليه درجة مئوية.
18. Resuspend الخلايا في ~ 10 مل قبل تحسنت RPMI تحتوي على 100 يو / مل Penicillin/100 ز / مل الخلايا الستربتوميسين ومكان في صحن الزجاج بيتري حمض غسلها أو بلورة الطبق.
19. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة. في 37 درجة مئوية في نسيج حاضنة الثقافة.
20. صخرة أو دوامة لوحة قليلاوجمع ثم طاف في SECS. وKCS التمسك الزجاج بسرعة أكبر بكثير من ثانية. بدلا من ذلك ، قد يتم فصلها بواسطة SECS من KCS immunopurification باستخدام أضداد CD31 أو anti-Stabilin2/HARE مترافق إلى حبات المغناطيسي.
21. ويمكن تقييم جدوى والأرقام عن طريق استبعاد الخلية الزرقاء التريبان باستخدام عدادة الكريات أو باستخدام عداد الخلية الآلي.
22. ثقافة SECS على فبرونيكتين المغلفة الصحون البلاستيكية عند 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO ₂ ، BSA RPMI/0.25 ٪ مع 40 نانوغرام / مل VEGF ، 100 U / مل البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين أو مكيفة مع وسائل الاعلام الكبدية.
23. قد خلايا الكبد ، KCS وSECS يكون تقييم لاستيعاب المواد المسمى باستخدام عداد غاما وتطبيع للبروتين الكلي الخلوية أو من خلال الفحص المجهري (إذا fluorescently المسمى) باستخدام هذه الأساليب زراعة.

5. ممثل النتائج :

تنقية الكبدية هو ≥ 97 ٪ والمجلس الأعلى للتعليم هو تنقية typicحليف ≥ 95 ٪ باستخدام هذا الأسلوب. الختان من تجويف البطن ، إقناء ؛ إدخال القنية في الوريد البابي ، وابيضاض الكبد ينبغي أن يحدث كل ذلك في اللحظة الأخيرة للحصول على أفضل النتائج. HARE/Stabilin-2 هي مستقبلات معينة على SECS الكبد وليس في غيرها من أنواع أعرب خلايا الكبد. في هذه العينة ، تم فصل lysates خلية من خلايا الكبد على حد سواء وSECS بنسبة 5 ٪ SDS - PAGE وبحث مع ريتوكسيماب ضد كل من الأشكال الإسوية Stabilin - 2 (الشكل 3).

يتم مسح الهيبارين غير المجزأ حقنها في مجرى الدم في الكبد ^16. تتم إجازته في المقام الأول SECS الكبد على النقيض من خلايا الكبد وKCS ^17. مستقبلات مستقبلات Stabilin-2/HARE هو إزالة الرئيسي الذي يربط وinternalizes الهيبارين في SECS ^18. في مثالنا هنا ، وصفت لنا الهيبارين مع علامة البيوتين على مجموعة من الكاربوكسيلات GlcNAc / NS. كان مترافق مع البيوتين streptavidin ميودن للكشف عن البروتوكول الاضافي الهيبارين المنضويةeoglycan. ثم حقن الهيبارين التي بلورها استنزاف 30 دقيقة بعد الحقن يتيح لنا مراقبة الأجهزة التي تستوعب هذا النوع من الهيبارين. في هذا الفاصل الزمني القصير ، والكبد هو تخليص الجهاز الأساسي (الشكل 4).

لفهم أكثر وضوحا مما هو نوع من الخلايا المسؤولة عن إزالة الألغام ، واضاف نحن I - ¹²⁵ - B - SA التهاب الكبد إلى وسائل الإعلام RPMI تستكمل مع جيش صرب البوسنة 0.05 ٪ وسمح لها أن تعمم عن طريق الكبد لمدة 20 دقيقة. بعد الهضم وتنقية كولاجيناز الخلوية ، والمنضوية في الأغلبية الساحقة من الهيبارين التي بلورها SECS خلافا لخلايا الكبد (الشكل 5).

الشكل 1. الهندسة المعمارية الأساسية الكبد. SECS تشكل جدران sinusoids ومنوفذة عادة (مجموعات صغيرة من الدوائر). تم العثور على الخلايا النجمية (HSCs) في الفضاء Disse على النقيض من ج كوبفرells (KCS) التي توجد عادة في microvasculature من sinusoids. خلايا الكبد تحتل الجانب الآخر من الفضاء Disse.

الشكل 2. تخطيطي للجهاز نضح. أ) تعيين المتابعة من خلال جهاز التنظيف / غسل sinusoids الكبد. TBS في قارورة 1 لتر. ب) استخدمت قارورة تحتوي على 125 مل ~ الاحتياطي مل مع 60 2 كولاجيناز للهضم الكبد في دائرة مغلقة. كما يتم تغيير خط الصرف من حاوية النفايات إلى B القارورة من خلال خفض درجة في سدادة مطاطية. غير المغمورة خط الأكسجين في المنطقة العازلة التي تحتوي على كولاجيناز (B القارورة) لتجنب الرغوة. وسدادات على كل قارورة وحقق للسماح للنقل فعالة من خط مياه الصرف ومنع الضغوط المتزايدة من غاز الأكسجين.

الشكل 3. الكبدية مع الاستعدادات ثانية. تم فصل كميات متساوية من lysates خلية من خلايا الكبد من دفعات المنقى (حارة 1) وSECS (حارة 2) بنسبة 5 ٪ SDS - PAGE ونشف لالنيتروسليلوز. كان يستخدم ريتوكسيماب # 30 الذي هو ضد كل الأشكال الإسوية محددة (315 كيلو دالتون وكيلو دالتون 190) من HARE/Stabilin-2 للتحقيق في lysates.

الشكل 4. توزيع الهيبارين المسمى في الهيئات. تم حقن الفئران عن طريق الوريد مع الذيل الأفقي الانتظار I - SA - B - ¹²⁵ التهاب الكبد لمدة 30 دقائق ، وexsanguinated ذلك الحين. وقد تم جمع الدم وذلك لعدم إعطاء أي أجهزة مصطنع قراءات عالية. تم تطبيع التهم في الدقيقة (CPM) ضد كل جهاز من أجهزة وزن الجهاز في غرام.

الشكل 5. المبلغ الهيبارين المسمى في خلايا الكبد وثانية. RPMأنا وسائل الإعلام التي تحتوي على ¹²⁵ وسمح لي - SA - B - التهاب الكبد عن طريق تعميم الكبد سليمة لمدة 20 دقيقة تليها كولاجيناز الهضم وتنقية الخلوية. وتم قياس كمية كميات متساوية من lysates الكبدية والمجلس الأعلى للتعليم بروتين الخلية مع الفحص برادفورد وعدها بواسطة عداد غاما.

يتم فصل الشكل 6. خلايا كوبفر من SECS بواسطة التصاق على الزجاج. تم وضع الخلايا في صحن الزجاج حمض غسلها بلورة وسمح للانضمام لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO _2. وكان برفق supernatent تحتوي على خلايا غير انضمت ملتف ووضعها في أنبوب الطرد المركزي. تم فصل الخلايا من كلا Lysates الالتزام على الزجاج (حارة 1) من الخلايا وعدم التقيد (حارة 2) بنسبة 8 ٪ SDS - PAGE ، نشف ، وبحث مع جسم مضاد ضد CD163 الذي محددة للخلايا كوبفر.

الرقم 7. SECS مطلية على البلاستيك المغلفة فبرونيكتين وحضنت 6 الأطباق جيدا بين عشية وضحاها في RPMI تستكمل مع جيش صرب البوسنة 0.1 ٪. وعلى النقيض من الصور التي اتخذت في المرحلة (أ) 100X و (ب) التكبير 200X.

Discussion

التخدير من الفئران من خلال طريقة قطرة شنقا في اللاوعي التي isoflurane يدفع البخار هو الأسلوب المفضل لدراستنا. ويمكن أيضا أن تستخدم المرذاذ بدلا من الحقنة مع القطن للحفاظ على الحيوانات خارج الغرفة ، ولكن العمليات الجراحية يتم ذلك بسرعة ، ليست مطلوبة. إضافة إلى البولي ايثيلين جلايكول isoflurane لخفض ضغط البخار ومعدل التبخر. كثيرا جدا سوف بخار isoflurane لحث الموت بسرعة كبيرة جدا. إذا مات الحيوان قبل مقنى الكبد ومتبيض مع TBS ، وتجميع تجلط الدم قد في الكبد ومنع غسل الفعال للsinusoids والهضم مع كولاجيناز. بالإضافة إلى ذلك قد يكون من المفيد الهيبارين كمضاد للتخثر ولكنه لا يستخدم في هذه الدراسات منذ نستخدم الهيبارين وصفت بأنها التحقيق لدينا.

غالبا ما يتم استبدال حل Gey مخزنة في المياه المالحة (GBSS) من قبل مختبرات أخرى لتنقية ثانية. في حين أنه مفيد لتنقية المجلس الأعلى للتعليم ، التهاب الكبدatocytes لا تتسامح مع GBSS فضلا عن المخازن 1-3 و viabilities لا يصل تقريبا. عند قياس الإلتقام ، فمن الممارسة السليمة لقياس مستويات الخلفية في الجهاز وتنقيته في خلايا الكبد.

هذا الأسلوب هو واحد من اثنين لتنقية كفاءة SECS بعد نضح الكبد مع كولاجيناز. الأسلوب الآخر يفصل الخلايا غير متني بواسطة الطرد المركزي تصويل ¹⁹ بدلا من التدرج Percoll. مزايا لاستخدام أكثر من التدرجات تصويل Percoll viabilities هي الخلية أعلى قليلا والأرقام. الجانب السلبي هو أن الطرد المركزي تصويل يتطلب الدوار المتخصصة ، وأجهزة الطرد المركزي المخصصة ، ومضخة تمعجية معا والتي تكلف عشرات الآلاف من الدولارات. هذا الأسلوب يتطلب سوى استخدام جهاز طرد مركزي طاولة المبردة ومضخة تمعجية الذي هو المعيار في مختبرات عديدة.

فصل SECS وKCS بواسطة التصاق الانتقائي هو أسلوب قياسي20-22. ولئن كان صحيحا أن SECS ستلتزم الزجاج والبلاستيك ، والنقطة الرئيسية هي استخدام حمض غسل الزجاج نظيفة مع عدم وجود أكثر من 15 دقيقة الحضانة عند 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO _2. KCS سوف تلتزم دائما أسرع من SECS ويستحسن أن يغسل بلطف KCS مع وسائل الإعلام لاستخراج أي SECS المتبقية التي أصبحت فضفاضة يعلق. كما يتم حذف Pronase البروتياز وغيرها من الخطوات الهضم كولاجيناز في هذا البروتوكول لزيادة viabilities الخلايا. البروتياز هضم مستقبلات خارج الخلية ، وربما تحول دون التصاق الخلوية في الخطوات تنقية النهائي.

الطريقة المعروضة هنا لديها تشكيلة واسعة من التطبيقات. على الرغم من أننا تظهر النتيجة النهائية التي اتخذت في البداية للحصول على الهيبارين التروية ، وإزالة الكبد للحصول على خلايا الكبد الأولية ، قد KC ، SECS ، وHSCs يكون مفيدا لعدد من الدراسات التي تنطوي على المسارات الأيضية ، مناعي ، والأنشطة زبال ، وغيرها الفسيولوجية ستوديوفاق. أصعب جزء من هذا الإجراء هو جيد إقناء ؛ إدخال القنية ، والهضم للكبد ، والتعامل مع الكبد دون الحاجة لقسطرة زلة من الوريد البابي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم	شركة	نموذج / كتالوج #	تعليق
20L ماء الحمام	ThermoFisher	2231	المياه حوالي 45 درجة مئوية للتعويض عن التبريد
			داخل الأنابيب.
مضخة تمعجية	الغمد Parmer	7553-70	سلسلة Masterflex
المبردة الطرد المركزي	Sorvall	أسطورة XTR
القسطرة	العلوم البيولوجية دينار بحريني	381444
Dessicator الغرفة	الصياد	08595E	استخدام لوحة داخلية
Percoll	سيغما	P4937
مصل بقري الزلال	SeraCare	AP - 4510-01
شبكة 100 ميكرون	مختبرات الطيف	146488
30 ميكرومتر شبكة	مختبرات الطيف	146506
RPMI 1640	Invitrogen	21870
البولي ايثيلين جلايكول	معمل الطيفق	PO107