Dans l'endocytose hépatique in vivo suivie d'une purification des cellules du foie par perfusion du foie

Résumé

L'étude des cellules endothéliales sinusoïdales du foie (secs) doit être effectuée avec des cellules primaires provenant de l'animal car aucune des lignées de cellules existent. Cette méthode repose sur la digestion du foie et centrifugation différentielle pour la purification de la SEC pour la culture subséquente et l'expérimentation.

Résumé

Le foie est le centre métabolique de l'organisme des mammifères et sert de filtre pour le sang. L'architecture de base du foie est illustré dans la figure 1, dans lequel plus de 85% de la masse du foie est composé d'hépatocytes et les 15% restants de la masse cellulaire est composé de cellules de Kupffer (KCS), les cellules étoilées (CSH), et cellules endothéliales sinusoïdales (secs). SECs forment les parois des vaisseaux sanguins dans le foie et contiennent la morphologie spécialisées appelées fenestrae sein dans le cytoplasme. Fenestration du cytoplasme est l'apparition de trous (~ 100 um) dans les cellules de sorte que l'acte SECs comme un tamis dont la plupart des chylomicrons, résidus de chylomicrons et des macromolécules, mais pas les cellules, passent à travers les hépatocytes et les CSH ¹ (Fig. 1). En raison de l'absence d'une membrane basale, l'écart entre les secondes et les hépatocytes forment l'espace de Disse. CSH occuper cet espace et de jouer un rôle important dans la régulation et la réponse à injury, le stockage de l'acide rétinoïque et l'immunorégulation des ² foie.

SECs sont parmi les cellules les plus actives endocytically du corps affichant une gamme de récepteurs scavenger sur leur surface de la cellule ^3. Il s'agit notamment de SR-A, Stabilin-1 et Stabilin-2. Généralement, les petites particules colloïdales moins de 230 nm et de macromolécules en phase tampon sont repris par SECS, alors, les grosses particules et les débris cellulaires est endocytosée (phagocytés) par KCs ^4. Ainsi, le jeu en vrac de matériaux extracellulaires tels que les glycosaminoglycanes du sang est largement tributaire de la santé et des fonctions d'endocytose SECs ^5,6. Par exemple, une augmentation des niveaux sanguins hyaluronane est révélatrice de la maladie hépatique variant de légère à des formes plus sévères ^7.

Avec l'exception d'un rapport de ^8, il n'ya pas de lignées immortalisées de cellules SEC dans l'existence. Même cette lignée cellulaire immortalisée est dé-différenciationATED en ce qu'elle n'exprime pas les récepteurs scavenger qui sont présents sur SECs primaires (nos données, non présentées). Toutes les études de biologie cellulaire doit être effectuée sur des cellules primaires obtenues fraîchement de l'animal. Malheureusement, secs dédifférencier dans des conditions standard de culture et doit être utilisé dans 1 ou 2 jours après l'isolement de l'animal. Différenciation des SEC est marquée par l'expression de Stabilin-2 ou d'un récepteur HARE ^9, CD31, et la présence de fenestration cytoplasmique ^1. Différenciation des SEC peut être étendue par l'ajout de VEGF dans les milieux de culture ou par culture de cellules dans le milieu conditionné des hépatocytes ^10,11.

Dans ce rapport, nous allons démontrer l'activité endocytaire des SEC de l'organe intactes en utilisant la radio-étiquetés héparine pour hyaluronane pour la SEC spécifiques Stabilin-2 du récepteur. Nous allons ensuite purifier les hépatocytes et secondes à partir du foie perfusé pour mesurer l'endocytose.

Protocole

1. L'excision du foie (adoptée par BP Seglen ¹² et R. ¹³ Blomhoff avec des modifications ^14,15)

1. Ajouter 10 ml 30% d'isoflurane dans le polyéthylène glycol à une boîte de Pétri dans une chambre de 5,5 L fermés. Il est optimal d'attendre 10-15 minutes après l'addition de l'isoflurane à créer une atmosphère stabilisée dans la chambre.
2. Placer un rat dans la chambre étanche et lui permettre de devenir anesthésiés. Plein effet de l'anesthésie sont apparentes lorsque l'animal devient mou, insensible, et expose la respiration profonde.
3. Placer 2 mL d'isoflurane dans le polyéthylène glycol dans certains des boules de coton au fond d'un tube de la seringue 30 ml.
4. Placez le rat sur le dos sur un plateau recouvert de couches et placer le tube seringue sur le museau.
5. Confirmer immédiatement une anesthésie profonde en mouillant l'abdomen avec de l'éthanol à 70%. Ne pas laisser l'animal mourir par overdose isoflurane.
6. Avec des ciseaux et des pinces à pansement, exposer l'ensemble de abdcavité ominal.
7. Localisez la veine porte et, en utilisant une pince, tirer deux fils de soie ou de fil de polyester chirurgicale (ligature) sous la veine porte immédiatement au-dessus de la branche mésentérique.
8. Retirer les pinces et faites un nœud simple en vrac.
9. En utilisant des pinces sous la veine porte et en tirant doucement en arrière pour redresser la veine, cathétériser la veine avec un cathéter Autoguard Insyte (18 GA, 1,3 x 300 mm, BD Biosciences) cathéter ou similaire. Le cathéter doit aller au-delà de quelques mm de la boucle formée par le fil.
10. Rétracter et retirer l'aiguille en relâchant le déclencheur à ressort sur le cathéter. Le sang doit commencer à s'infiltrer dans le cathéter jusqu'à indiquant le placement de ligature correcte.
11. Serrer l'nœud simple et sécurisé avec un autre nœud simple.
12. Sever soit la veine cave inférieure ou de l'aorte descendante (aorte abdominale) pour permettre au sang de s'écouler dans le système circulatoire.
13. Commencez rinçage du foie avec oxygénéesSCT à 37 ° C pour éliminer le sang (blanchiment) à un débit de 20 ml / min. Le foie doit tourner à partir d'un violet rougeâtre à une couleur argile.
14. Alors que le foie est le rinçage, le foie d'accise en coupant le tube digestif et du tissu conjonctif. Il est important de ne pas lacérer le foie ou la perforation de la capsule de Glisson.
15. Placez le foie sur un filet de plastique sur un entonnoir qui permet tampons d'être collectée et recyclée. Tampons à ce point ne devrait pas être remis en circulation, mais le débit dans le bécher de déchets. Flushing ne devrait pas durer plus de 10 min. (Figure 2A). Préparer la solution endocytose requises au point 2.1 étape.

2. Internalisation de ¹²⁵ I-SA-b-Hep (ou un autre ligand adapté et étiqueté)

1. Pour 50 ml de RPMI des médias dans un petit bécher, ajouter à une concentration finale de BSA 0,05% et 0,01 mCi ¹²⁵ I-SA-b-Hep ou un autre ligand convenablement étiqueté pour l'endocytose.
2. Fixez ce bécher à l'apparatus pour permettre l'oxygénation.
3. Eteignez la pompe, passer la tubulure d'entrée, puis tourner sur la pompe à 20 ml / min.
4. Comme le RPMI étiquetés s'approche du foie, éteindre la pompe et permettre excès de liquide dans l'entonnoir et vidange tube.
5. Placez le tuyau de vidange dans le bécher médias pour permettre la recirculation des supports étiquetés, puis redémarrer la pompe.
6. Laisser faire recirculer les fluides à travers le foie pour pas plus de 1 heure.
7. Pendant cette étape d'internalisation, assurez-vous que la température dans le foie est stable en le couvrant et préparer la collagénase pour la digestion.

3. Digestion du foie par digestion à la collagénase

1. Fraîchement dissous et filtrés (0,45 um) collagénase (100 rats de poids mg / kg) doit être ajouté au tampon 2 dans un volume total ne doit pas dépasser 60 ml à 37 ° C. Le volume dépend de la longueur / volume intérieur du tube et doit être ajustée en conséquence.
2. Arrêter la pompe et d'échanger lestuyauterie d'entrée du bécher médias à la SCT.
3. Rincez le foie pendant 2 min à 50 mL / min ce qui permet de desserrer des jonctions cellulaires desmosomales qui sont dépendante du calcium.
4. Alors que le foie est le rinçage, l'échange le bécher les médias avec le gobelet contenant de la collagénase sur l'appareil.
5. Immédiatement après le rinçage, commencer la digestion par la collagénase dans une boucle de circulation à un débit de 20 ml / min jusqu'à 15 min. Depuis lots varient collagénase par numéro de lot, les variations dans la quantité et l'heure de la digestion doivent être optimisés pour chaque nouveau lot de collagénase. La collagénase est également dépendante du calcium. Eteignez la pompe et l'interrupteur de la mémoire tampon et les lignes de gaz de ballon A à B. Flacon de transfert des effluents de la ligne à partir du conteneur des déchets dans le ballon B (fig. 2B).
6. Arrêter la pompe, retirer le cathéter et le transfert du foie dans un plat contenant 20-30 ml de tampon 1.
7. Peler l'Glisson capsule du foie et secouer la cellules dans le liquide.
8. Comme le liquide devient opaque avec du matériel cellulaire, transfert des cellules à travers un maillage de 100 um suivi d'une filtration à travers une maille 30 um et ensuite dans une forme conique de 50 mL sur la glace.
9. Ajouter plus de tampon 1 pour le foie et continuer secouant les cellules de la matrice du foie, le transfert du liquide vers le filtre maille et conique.
10. Répétez les étapes 3.7 à 3.9 jusqu'à ce qu'il n'y plus de cellules peuvent être délogés avec agitation raisonnable du foie.

4. Purification de l'hépatocyte et SEC

1. Centrifuger les 50 ml contenant des cellules Coniques à 150 xg pendant 3 min. pour culotter les hépatocytes.
2. Transfert de la fraction liquide contenant des cellules non parenchymateuses au frais 50 ml Coniques sur la glace.
3. Laver les hépatocytes se remettre en suspension le culot dans un tampon de 3 et répéter les étapes 4.1 et 4.2 plus de trois fois.
4. A la fin des lavages, les pastilles sont ≥ 97% des hépatocytes pur. Pour obtenir le SECS, centrifugeuse de tous les tubes contenant commun surnageant (contenant les CSH, secs, et KCS et quelques petits hépatocytes) à 200 xg pendant 10 min. à 4 ° C.
5. Aspirer le tampon et la suspension de toutes les boulettes dans 5 ml de RPMI / BSA à 4 ° C.
6. Piscine les cellules ensemble dans deux tubes et ajouter RPMI / BSA jusqu'à un volume de 35 ml.
7. Centrifuger les Coniques à 100 xg pendant 3 min.
8. Recueillir les 25 premiers ml de liquide et le transfert à un nettoyage conique de 50 mL.
9. Reprendre le culot dans les 10 autres supports mL et ajouter 25 ml de retour du froid RPMI / BSA et centrifuger à 100 xg pendant 3 min.
10. Répétez les étapes 3,8 et 3,9 fois de plus, jetez le culot cellulaire et inférieure 10 ml de milieu.
11. Centrifuger les surnageants à granulés SECS, KCS, et de CSH à 200 xg pendant 10 min. à 4 ° C.
12. Préparer trois tubes de 50 ml contenant 20 ml de Percoll 25% dans le PBS sur la glace. Sous-couche avec 15 ml de Percoll 50% dans chaque tube.
13. Resuspendre les culots cellulaires dans un volume total de 30 mL de RPMI / BSA.
14. Soigneusement superposition each gradient avec 10 ml de cellules et centrifuger à 900 xg pendant 20 min à 4 ° C.
15. Secondes et KCs ont très proche des densités porteur et sont à l'interface 25/50%. CSH sont généralement à 25% / media Interface en raison de leur plus grande flottabilité que les cellules lipidiques stockage. Toute hépatocytes restants et les cellules sanguines ont la plus faible et flottabilités sont culottées. Aspirer de haut en bas près de l'interface de 25/50% et jeter ce matériel.
16. Collecter les cellules dans l'interface de 25/50% et le transfert d'une forme conique à froid fraîche avec du RPMI. Le volume final doit être ~ 40 ml à diluer le Percoll.
17. Centrifuger les coniques à 350 xg pendant 10 min à 4 ° C pour culotter les cellules.
18. Resuspendre les cellules dans ~ 10 ml pré-chauffé RPMI contenant 100 U / ml Penicillin/100 g / mL cellules streptomycine et placer dans un plat en verre lavé à l'acide de Pétri ou Cristallisoir.
19. Incuber les cellules pendant 15 min. à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire.
20. Rock ou tourbillon de la plaque un peu pluspuis recueillir les SECs dans le surnageant. Le KCS adhérer au verre beaucoup plus rapidement que SECS. Alternativement, le SEC peut être séparé de KCs par immunopurification utilisant des anticorps anti-CD31 ou anti-Stabilin2/HARE conjugués à des billes magnétiques.
21. Numéros de la viabilité et la cellule peut être évaluée par exclusion du bleu trypan utilisant un hématimètre ou avec l'aide d'un compteur de cellules automatisé.
22. Culture de la fibronectine secondes sur enduit de plats en plastique à 37 ° C, 5% de CO _2, BSA RPMI/0.25% avec 40 ng / ml de VEGF, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine ou avec des hépatocytes milieux conditionnés.
23. Hépatocytes, KCS, et secondes peuvent être évaluer pour l'internalisation des contenus labellisés par l'utilisation d'un compteur gamma et la normalisation de la protéine cellulaire totale ou par microscopie (si marqué par fluorescence) en utilisant ces méthodes de culture.

5. Les résultats représentatifs:

Purification de l'hépatocyte est ≥ 97% et la purification SEC est Typicallié de ≥ 95% en utilisant cette méthode. Excision de la cavité abdominale, la canulation de la veine porte, et le blanchiment du foie devraient tous se produisent au sein d'une minute pour obtenir les meilleurs résultats. HARE/Stabilin-2 est un récepteur spécifique sur SECs foie et n'est pas exprimée dans d'autres types de cellules du foie. Dans cet échantillon, les lysats cellulaires des deux hépatocytes et secondes ont été séparés par 5% de SDS-PAGE et sondé avec un anticorps monoclonal dirigé contre les deux isoformes de Stabilin-2 (Fig. 3).

L'héparine non fractionnée injectée dans le sang est éliminé par le foie ^16. La clairance est principalement réalisée par le foie SECs contrairement aux hépatocytes et KCS ^17. Le récepteur est le récepteur Stabilin-2/HARE dédouanement principale qui lie l'héparine et internalise en s ^18. Dans notre exemple, nous avons étiqueté héparine avec une étiquette biotine sur le groupe carboxylate de GlcNAc / NS. La biotine a été conjugué à de la streptavidine iodés pour la détection de prot héparine intérioriséeoglycan. L'injection de l'héparine étiquetés suivie par exsanguination 30 minutes après l'injection nous permet de contrôler quels organes intérioriser cette forme d'héparine. Dans ce court intervalle de temps, le foie est l'organe dégagement primaire (Fig. 4).

Pour mieux comprendre quel type de cellule est responsable du dédouanement, nous avons ajouté ¹²⁵ I-SA-b-Hep aux médias RPMI supplémenté avec 0,05% de BSA et lui a permis de circuler à travers le foie pendant 20 min. Après digestion par la collagénase et la purification cellulaire, la grande majorité de l'héparine marquée est intériorisée par sec en contraste avec les hépatocytes (Fig. 5).

Figure 1. Architecture du foie de base. SECs forment les parois des sinusoïdes et sont normalement fenêtrée (petits amas de cercles). Cellules étoilées (CSH) sont trouvés dans l'espace de Disse, contrairement à c Kupfferaunes (KCS) qui sont normalement présents dans la microvascularisation des sinusoïdes. Hépatocytes occuper l'autre côté de l'espace de Disse.

Figure 2. Schéma de l'appareil de perfusion. A) Mise en place d'un appareil lors de la vidange / lavage des sinusoïdes du foie. SCT est dans un flacon de 1 litre. B) Un flacon 125 ml contenant environ 60 ml de tampon 2 avec de la collagénase est utilisée pour la digestion du foie dans un circuit fermé. La ligne de l'effluent est également modifiée dans le conteneur de déchets à travers un flacon B entaille dans le bouchon en caoutchouc. La ligne de l'oxygène n'est pas immergé dans le tampon contenant de la collagénase (flacon B) pour éviter la mousse. Les bouchons sur chaque ballon est entaillée pour permettre un transfert efficace de la ligne d'effluents et d'éviter une pression accrue de l'oxygène gazeux.

Figure 3. hépatocytes sont pas contaminés par la SEC. Des quantités égales de lysats de cellules purifiées à partir de lots d'hépatocytes (voie 1) et secs (piste 2) ont été séparés par 5% de SDS-PAGE et transférées sur nitrocellulose. Anticorps monoclonal # 30 qui est spécifique contre les deux isoformes (315 kDa et 190 kDa) de HARE/Stabilin-2 été utilisé pour sonder les lysats.

Figure 4. Distribution de l'héparine étiquetés dans les organes. Les rats ont été injectés dans la veine latérale de la queue avec ¹²⁵ I-SA-b-hépatite attendre 30 minutes, puis saigné. Sang a été prélevé afin de ne pas donner un quelconque des organes artificiellement lectures élevé. Coups par minute (CPM) de chaque organe ont été normalisées par rapport au poids de l'organe en grammes.

Figure 5. Montant de l'héparine étiquetés dans les hépatocytes et SEC. RPMJ'ai supports contenant ¹²⁵ I-SA-b-Hep a été autorisé à circuler à travers un foie intact pendant 20 minutes suivie par digestion à la collagénase et la purification cellulaire. Des quantités égales de lysats hépatocytes et SEC protéine cellulaire ont été quantifiés par le dosage de Bradford et comptées par un compteur gamma.

Figure 6. Cellules de Kupffer sont séparés de SECs par adhérence sur le verre. Les cellules ont été placés dans un plat en verre lavé à l'acide cristallisant et autorisés à adhérer pendant 15 min à 37 ° C, 5% de CO _2. Le surnageant contenant non respectées cellules a été doucement agité et placé dans un tube à centrifuger. Lysats de cellules à la fois collé sur le verre (voie 1) et de la non-respectées cellules (piste 2) ont été séparés par 8% de SDS-PAGE, effacé, et sondé avec un anticorps contre CD163 qui est spécifique des cellules de Kupffer.

SECs Figure 7. Plaqué sur plastique recouvert de fibronectine à 6 puits boîtes ont été incubées pendant la nuit dans RPMI supplémenté avec 0,1% de BSA. Des images à contraste de phase ont été prises à (A) 100x et (B) 200x de grossissement.

Discussion

Anesthésie du rat par la méthode de goutte pendante dans laquelle la vapeur d'isoflurane induit inconscience est la méthode préférée pour nos études. Un vaporisateur peut aussi être utilisé à la place d'une seringue avec du coton pour maintenir l'animal en dehors de la chambre, mais les interventions chirurgicales sont si rapides, il n'est pas nécessaire. Le polyéthylène glycol est ajouté à l'isoflurane pour diminuer la pression de vapeur et le taux d'évaporation. Trop de vapeurs d'isoflurane va induire la mort trop rapidement. Si l'animal meurt avant que le foie est canulée et blanchies avec le SCT, l'accumulation de sang peut coaguler dans le foie et éviter un lavage efficace des sinusoïdes et la digestion par la collagénase. L'ajout d'héparine peut être utile comme un anticoagulant, mais n'est pas utilisé dans ces études puisque nous utilisons l'héparine étiqueté comme notre sonde.

Gey solution saline tamponnée (GBSS) est souvent remplacé par d'autres laboratoires pour la purification de la SEC. Bien qu'il soit utile pour la purification de la SEC, l'hépatiteatocytes ne tolèrent pas GBSS ainsi que des tampons 1-3 et viabilités ne sont pas aussi élevés. Lorsque l'on mesure l'endocytose, c'est une bonne pratique pour mesurer les niveaux de fond dans l'organe et dans les hépatocytes purifiée.

Cette méthode est l'un des deux pour une purification efficace des SEC après la perfusion du foie avec de la collagénase. L'autre méthode sépare les cellules non parenchymateuses par ¹⁹ centrifugation élutriation lieu de gradient de Percoll. Les avantages de l'utilisation d'élutriation plus gradients de Percoll sont viabilités cellulaires légèrement plus élevé et les chiffres. L'inconvénient est que la centrifugation élutriation nécessite un rotor spécialisée, dédiée centrifugeuse et la pompe péristaltique ensemble, ce qui coûte des dizaines de milliers de dollars. Cette méthode ne nécessite que l'utilisation d'une centrifugeuse de table réfrigérée et une pompe péristaltique qui est la norme dans de nombreux laboratoires.

Séparation des secondes et KCs par adhésion sélective est une méthode standard20-22. S'il est vrai que SECs va adhérer au verre et le plastique, le point clé est d'utiliser lavé à l'acide de verre propre avec pas plus d'une incubation de 15 minutes à 37 ° C à 5% de CO _2. KCS adhèrent toujours plus rapide que s et il est conseillé de laver délicatement le KCS avec les médias pour en extraire toute SECs restants qui sont devenus lâchement. Pronase et d'autres protéases sont également omis de la digestion par la collagénase étapes dans ce protocole pour augmenter viabilités des cellules. Les protéases digèrent récepteurs extracellulaires et peut inhiber l'adhésion cellulaire dans les étapes finales de purification.

La méthode présentée ici a une grande variété d'applications. Bien que nous montrons le résultat final dans lequel l'héparine est d'abord pris pour le dédouanement, la perfusion du foie pour l'obtention d'hépatocytes primaires, KC, secs, et les CSH peut être utile pour un certain nombre d'études impliquant des voies métaboliques, immunorégulation, des activités au trésor, et les autres physiologiques studies. La partie la plus difficile de cette procédure est bonne canulation, la digestion du foie, et la manipulation du foie sans avoir le bordereau de cathéter de la veine porte.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom	Société	Modèle / catalog #	Commentaire
Bain d'eau 20L	ThermoFisher	2231	L'eau est d'environ 45 ° C pour compenser le refroidissement
			dans le tube.
Pompe péristaltique	Cole-Parmer	7553-70	Masterflex série
Centrifugeuse réfrigérée	Sorvall	Légende XTR
Cathéter	BD Biosciences	381444
Dessiccateur de chambre	Fisher	08595E	Utilisez la plaque intérieure
Percoll	Sigma	P4937
Bovine Serum Albumin	SeraCare	AP-4510-01
100 mailles um	Laboratoires du spectre	146488
30 mesh um	Laboratoires du spectre	146506
RPMI 1640	Invitrogen	21870
Polyéthylène glycol	Spectre de laboratoires	PO107