In vivo Leber Endozytose durch Reinigung von Leberzellen durch Leberperfusion Gefolgt

Zusammenfassung

Das Studium der Leber sinusförmige Endothelzellen (SECS) muss mit primären Zellen aus dem Tier erhalten, da keine Zelllinien existieren durchgeführt werden. Diese Methode basiert auf Leber Verdauung und differentielle Zentrifugation für SEC Reinigung für nachfolgende Kultivierung und Experimentieren.

Zusammenfassung

Die Leber ist das metabolische Zentrum der Körper von Säugetieren und dient als Filter für das Blut. Die grundlegende Architektur der Leber ist in Abbildung 1, in denen mehr als 85% der Leber Masse der Hepatozyten besteht und die restlichen 15% der Zellmasse wird von Kupffer-Zellen (KCS), Sternzellen (HSC) zusammen dargestellt und Sinus-Endothelzellen (Sekunden). SECs bilden die Wände der Blutgefäße in der Leber und enthalten spezielle Morphologie genannt fenestrae in in das Zytoplasma. Fenestration des Cytoplasmas ist das Auftreten von Bohrungen (~ 100 Mikrometer) innerhalb der Zellen, so dass die SECs wirken wie ein Sieb, in dem die meisten Chylomikronen, Chylomikronen Reste und Makromolekülen, nicht aber Zellen, bis hin zu den Hepatozyten und HSCs ¹ (Abb. Pass 1). Durch das Fehlen einer Basalmembran, bilden die Lücke zwischen den SECs und Hepatozyten the Space of Disse. HSCs besetzen diesen Platz und spielen eine herausragende Rolle bei der Regulierung und der Reaktion auf injury, Lagerung von Retinsäure und Immunregulation in der Leber ^2.

SECs gehören zu den endocytically aktiven Zellen des Körpers die Anzeige einer Reihe von Scavenger-Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche Oberfläche ^3. Dazu gehören SR-A, Stabilin-1 und Stabilin-2. Generell sind kleine Kolloidteilchen weniger als 230 nm und Makromolekülen in Puffer-Phase von SECs genommen, während große Partikel und Zelltrümmer durch Endozytose (phagozytiert) von KC ^4. So wird der Großteil Clearance von extrazellulären Material wie die Glykosaminoglykane aus dem Blut weitgehend abhängig von der Gesundheit und endocytischen Funktionen SECs ^5,6. Zum Beispiel ist ein Anstieg im Blut Hyaluronsäure Ebenen Anzeichen für Lebererkrankungen leichten bis schweren Klassen ^7.

Mit Ausnahme von einem Bericht ^8, gibt es keine verewigt SEC-Zelllinien in der Existenz. Auch dieser immortalisierten Zelllinie ist de-differenziertenEINZELNEN SEKTOREN in, dass es nicht ausdrücken Scavenger-Rezeptoren, die derzeit auf primären SECs (unsere Daten nicht gezeigt). Alle zellbiologischen Studien müssen auf Primärzellen frisch vom Tier stammen, durchgeführt werden. Leider dedifferenzieren SECs unter Standard-Kulturbedingungen und muss innerhalb von 1 oder 2 Tage nach Isolierung aus dem Tier eingesetzt werden. Differenzierung von SECs ist durch die Expression von Stabilin-2 oder Hasen-Rezeptor ^9, CD31, und das Vorhandensein von zytoplasmatischen fenestration ¹ gekennzeichnet. Differenzierung von SECs kann durch die Zugabe von VEGF in Kulturmedien oder durch Kultivierung von Zellen in Hepatozyten konditionierten Medium ^10,11 ausgedehnt werden.

In diesem Bericht werden wir die Endozytose-Aktivität von SECs im intakten Organ demonstrieren mit radioaktiv markiertem Heparin für Hyaluronan für die SEC-spezifischen Stabilin-2-Rezeptor. Wir werden dann zu reinigen Hepatozyten und Sekunden aus dem perfundierten Leber Endozytose zu messen.

Protokoll

1. Excision der Leber (übernommen von PO Seglen ¹² und R. Blomhoff ¹³ mit Modifikationen ^14,15)

1. Fügen Sie 10 ml 30% Isofluran in Polyethylenglykol in eine Petrischale in einem geschlossenen 5,5 L Kammer. Es ist optimal, 10-15 min nach der Zugabe von Isofluran auf eine stabilisierte Luft innerhalb der Kabine zu schaffen warten.
2. Legen Sie eine Ratte in der verschlossenen Kammer und lassen Sie es sich betäubt. Volle Auswirkungen der Narkose sind offensichtlich, wenn das Tier wird schlaff, reagiert und weist tiefe Atmung.
3. Platz 2 mL von Isofluran in Polyethylenglykol in einigen Wattebällchen auf den Boden einer 30 ml Spritze Rohr.
4. Legen Sie die Ratte auf dem Rücken auf einer Windel bedeckt, und bewahren Sie die Spritze Rohr über die Schnauze.
5. Unmittelbar bestätigen tiefe Narkose durch Benetzung des Bauches mit 70% Ethanol. Lassen Sie sich nicht das Tier von Isofluran Überdosis sterben.
6. Mit Bandage Scheren und Zangen, setzen die gesamte abdominal Hohlraum.
7. Suchen Sie die Pfortader und mit einer Pinzette ziehen zwei Stränge der chirurgischen Seide oder Polyester Faden (Ligatur) unter der Pfortader unmittelbar oberhalb der mesenterialen Branche.
8. Ziehen Sie die Zange und Krawatte ein loses Überhandknoten.
9. Mit einer Pinzette unter die Pfortader und vorsichtig wieder zu begradigen die Vene, kanülieren die Vene mit einer Insyte Autoguard Katheter (18 GA, 1,3 x 300 mm, BD Biosciences) oder ähnliche Katheter. Der Katheter sollte einige mm über der Schleife durch das Gewinde geformt gehen.
10. Einfahren und entfernen Sie die Nadel durch die Freigabe der federbelastete Trigger auf dem Katheter. Blut sollte beginnen sickern bis in den Katheter der Angabe der richtigen Ligatur Platzierung.
11. Ziehen Sie die Überhandknoten und sichern Sie es mit einem anderen Überhandknoten.
12. Sever entweder die untere Hohlvene oder absteigenden Aorta (Aorta abdominalis), damit Blut aus dem Kreislaufsystem abtropfen lassen.
13. Begin Spülung der Leber mit sauerstoffreichemTBS bei 37 ° C, um das Blut (Blanchieren) bei einer Flussrate von 20 ml / min zu entfernen. Die Leber sollte von einem rötlich-violett zu einem Lehm verfärben.
14. Während die Leber Spülung, Verbrauchssteuern der Leber durch das Wegschneiden des GI-Trakts und des Bindegewebes. Es ist wichtig, nicht auf die Leber oder Punktion der Glisson'sche Kapsel zerreißen.
15. Legen Sie die Leber auf einem Kunststoff-Netz über einen Trichter, Puffern gesammelt und rückgeführt werden können. Puffer an dieser Stelle sollte nicht zurückgeführt werden, sondern fließen in den Abfall Becher. Die Spülung sollte nicht länger als 10 min. (Abb. 2A). Bereiten Sie die Endozytose Lösung in Schritt 2.1 erforderlich.

2. Die Internalisierung von ¹²⁵ I-SA-b-Hep (oder einem anderen geeigneten markierten Liganden)

1. Um 50 mL RPMI-Medium in einem kleinen Becherglas, bis zu einer Endkonzentration 0,05% BSA und 0,01 mCi ¹²⁵ I-SA-b-Hep oder anderen entsprechend markierten Liganden für Endozytose hinzuzufügen.
2. Bringen Sie diesen Becher auf die Apparatus für Sauerstoffzufuhr zu ermöglichen.
3. Schalten Sie die Pumpe, schalten Sie den Zulaufschlauch und dann an der Pumpe drehen bei 20 mL / min.
4. Wie die Bezeichnung RPMI Ansätze der Leber, schalten Sie die Pumpe und lassen überschüssige Flüssigkeit in den Trichter und Schlauch abtropfen lassen.
5. Setzen Sie den Ablaufschlauch in die Medien Becherglas Rückführung von markierten Medien ermöglichen und starten Sie dann die Pumpe.
6. Lassen Flüssigkeiten durch die Leber nicht mehr als 1 Stunde umwälzen.
7. Während dieser Verinnerlichung Schritt sicher, dass die Temperatur in der Leber ist stabil durch Abdecken und bereiten die Kollagenase für die Verdauung.

3. Die Verdauung der Leber durch Kollagenaseverdau

1. Frisch gelöst und filtriert (0,45 um) Kollagenase (100 mg / kg Ratte Gewicht) sollte hinzugefügt werden, um 2 in einem Gesamtvolumen von nicht zu 60 mL bei 37 ° C übersteigen Buffer werden Die Lautstärke ist abhängig von der Länge / Innenvolumen des Rohrs und sollte entsprechend angepasst werden.
2. Stoppen Sie die Pumpe und den Austausch derZulaufschlauch aus der Medien-Becher auf die TBS.
3. Flush in der Leber für 2 min bei 50 mL / min, die zum Lösen der desmosomalen Zellkontakte, die Calcium-abhängig sind erlaubt.
4. Während die Leber Spülung, den Austausch der Medien Becherglas mit der Becher mit Kollagenase auf das Gerät.
5. Unmittelbar nach dem Spülen, beginnen die Verdauung mit Kollagenase in einem Kreislauf Schleife bei einer Flussrate von 20 ml / min für bis zu 15 min. Da Kollagenase Chargen von Lot-Nummer ändern, müssen Schwankungen in der Menge und der Zeit der Verdauung, für jede neue Charge von Kollagenase optimiert werden. Collagenase ist auch Calcium-abhängig. Schalten Sie die Pumpe und die Schalter der Puffer-und Gasleitungen von Flask A bis Flask B. Übertragung des Abwassers Linie von den Abfallbehälter zu Flask B (Abb. 2B).
6. Stoppen Sie die Pumpe, entfernen Sie den Katheter und den Transfer der Leber zu einer Schale mit 20-30 mL Puffer 1.
7. Ziehen Sie die Glisson'sche Kapsel der Leber und schütteln Sie die Zelles in der Flüssigkeit.
8. Da die Flüssigkeit trübt sich mit zellulären Material, übertragen Sie die Zellen durch ein 100 um Sieb durch Filtration durch ein 30 um Maschenweite und dann in eine 50 ml konischen auf Eis.
9. Fügen Sie weitere Puffer 1 für die Leber und weiter Schütteln Zellen aus der Leber-Matrix, die Übertragung der Flüssigkeit auf die Siebe und konisch.
10. Wiederholen Sie die Schritte von 3,7 bis 3,9, bis keine Zellen mehr mit vertretbarem Schütteln der Leber verdrängt werden.

4. Hepatozyten und SEC Reinigung

1. Zentrifugieren Sie die 50 ml konische enthaltenden Zellen bei 150 xg für 3 min. Zum Pelletieren der Hepatozyten.
2. Die Flüssigkeit enthaltende Fraktion nicht Parenchymzellen an die frische 50 ml konische auf Eis.
3. Waschen Sie den Hepatozyten werden Resuspendieren des Pellets in Puffer 3 und wiederholen Sie die Schritte 4.1 und 4.2 noch dreimal.
4. Am Ende des wäscht, werden die Pellets ≥ 97% reinem Hepatozyten. Um die SECS, Zentrifuge alle Rohre containing gebündelt Überstand (enthält Blutstammzellen, SECS, und KCS und einige kleine Hepatozyten) bei 200 xg für 10 min. bei 4 ° C.
5. Saugen Sie den Puffer und resuspendieren alle Pellets in 5 ml RPMI / BSA bei 4 ° C.
6. Pool der Zellen zusammen in 2 Röhren und fügen RPMI / BSA bis zu einem Volumen von 35 mL.
7. Zentrifugieren Sie die konische bei 100 xg für 3 min.
8. Sammeln Sie die Top 25 ml Flüssigkeit aufnehmen und in sauberen 50 ml konischen.
9. Das Pellet in den restlichen 10 mL Medien und fügen Sie wieder 25 ml kaltem RPMI / BSA und Zentrifuge bei 100 xg für 3 min.
10. Wiederholen Sie die Schritte 3.8 und 3.9 noch einmal, verwerfen das Zellpellet und unteren 10 mL Medien.
11. Zentrifugieren Sie die Überstände an Pellet SECS, KCS, und HSCs bei 200 xg für 10 min. bei 4 ° C.
12. Bereiten Sie drei 50-ml-Röhrchen mit 20 ml 25% Percoll in PBS auf Eis. Unterlage mit 15 mL 50% Percoll in jeder Röhre.
13. Resuspendieren der Zellpellets in einem Gesamtvolumen von 30 mL RPMI / BSA.
14. Sorgfältig Overlay each Steigung mit 10 ml Zellen und Zentrifuge bei 900 xg für 20 min bei 4 ° C.
15. SECs und KCS haben sehr enge Auftrieb Dichten und sind an der 25/50%-Schnittstelle. HSK sind in der Regel bei 25% / media aufgrund ihrer höheren Auftrieb als Lipid speichernden Zellen-Schnittstelle. Alle verbleibenden Hepatozyten und Blutzellen der unteren Auftriebskräfte und pelletiert. Absaugen von oben nach unten in der Nähe der 25/50%-Schnittstelle und entsorgen Sie dieses Materials.
16. Sammeln Sie die Zellen in der 25/50%-Schnittstelle und den Transfer zu einem neuen konischen mit kaltem RPMI. Das endgültige Volumen sollte ca. 40 ml zu verdünnen die Percoll werden.
17. Centrifuge den konischen bei 350 xg für 10 min bei 4 ° C die Zellen zu pelletieren.
18. Resuspendieren der Zellen in ~ 10 mL vorgewärmtes RPMI mit 100 U / mL Penicillin/100 g / ml Streptomycin und Platz Zellen in einer Säure-gewaschene Glas Petrischale oder Kristallisierschale.
19. Inkubieren Sie die Zellen für 15 min. bei 37 ° C in einem Gewebekultur-Inkubator.
20. Rock oder schwenken Sie die Platte ein wenigund dann sammeln die SECs im Überstand. Die KCS auf das Glas viel schneller als SECs halten. Alternativ können SECs aus KCS durch immunopurification mit anti-CD31 oder anti-Stabilin2/HARE Antikörpern, konjugiert an magnetische Kügelchen getrennt werden.
21. Die Lebensfähigkeit und Zellzahl kann durch Trypanblau-Ausschluss mit einem Hämazytometer oder mit einem automatisierten Zelle Zähler beurteilt werden.
22. Kultur der SECs auf Fibronektin-beschichteten Plastikschalen bei 37 ° C, 5% CO _2, RPMI/0.25% BSA mit 40 ng / mL VEGF, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin oder mit Hepatozyten-konditionierten Medien.
23. Hepatozyten, KCS, und SECs kann für die Internalisierung des markierten Materials beurteilen durch die Verwendung eines Gamma-Counter und Normalisierung zu gesamten zellulären Proteins oder durch Mikroskopie (wenn fluoreszenzmarkierten) mit diesen Kultivierungsverfahren.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Hepatocyte Reinigung ist ≥ 97% und SEC Reinigung TypikVerbündeter ≥ 95% mit dieser Methode. Excision der Bauchhöhle, Kanülierung der Pfortader und Blanchieren der Leber alle sollten innerhalb einer Minute für die besten Ergebnisse auftreten. HARE/Stabilin-2 ist ein spezifischer Rezeptor auf Leber SECs und nicht in andere Leber Zelltypen exprimiert. In diesem Beispiel wurden Zelllysate beider Hepatozyten und SECs um 5% SDS-PAGE getrennt und sondiert mit einem monoklonalen Antikörper gegen beide Isoformen von Stabilin-2 (Abb. 3).

Unfraktioniertem Heparin in die Blutbahn injiziert wird von der Leber ¹⁶ gelöscht. Die Clearance ist in erster Linie von der Leber SECs im Gegensatz zu Hepatozyten und KC ¹⁷ durchgeführt. Die Stabilin-2/HARE Rezeptor ist die wichtigste Spiel-Rezeptor bindet und internalisiert in SECs ¹⁸ Heparin. In unserem Beispiel hier, beschriftet wir Heparin mit einer Biotin-Tag auf der Carboxylatgruppe von GlcNAc / NS. Die Biotin konjugiert mit jodhaltigen Streptavidin zum Nachweis von Heparin verinnerlicht proteoglycan. Injektion des markierten Heparin gefolgt von Ausbluten 30 Minuten nach der Injektion ermöglicht es uns, zu überwachen, welche Organe diese Form von Heparin zu verinnerlichen. In dieser kurzen Zeitspanne ist die Leber das primäre Organ-Clearance (Abb. 4).

Um besser zu verstehen, welcher Zelltyp verantwortlich für die Freigabe ist, haben wir ¹²⁵ I-SA-b-Hep zu RPMI-Medium mit 0,05% BSA ergänzt und erlaubt es durch die Leber für 20 min zirkulieren. Nach Kollagenaseverdau und zellulären Reinigung wird die überwiegende Mehrheit der markierten Heparin durch SECs im Gegensatz zu Hepatozyten (Abb. 5) verinnerlicht.

Abbildung 1. Grundlegende Leber-Architektur. SECs bilden die Wände der Sinusoide und sind in der Regel gefenstert (kleine Cluster von Kreisen). Sternzellen (HSC) sind im Raum der Disse im Gegensatz zu Kupffer c gefundenEllen (KCS), die normalerweise in der Mikrovaskulatur der Sinusoide vorhanden sind. Hepatozyten besetzen die andere Seite des Raums der Disse.

Abbildung 2. Schematische Darstellung des Perfusionsapparatur. A) Set-up des Geräts während der Spülung / Waschen der Sinusoide der Leber. TBS ist in einer 1 L Flasche. B) Ein 125 ml Kolben mit ~ 60 ml Puffer 2 mit Kollagenase ist für die Verdauung der Leber in einem geschlossenen Kreislauf verwendet. Das Abwasser Leitung ist auch aus dem Abfallbehälter zu Kolben B durch eine Kerbe in den Gummistopfen geändert. Der Sauerstoff-Leitung ist nicht in den Puffer mit Kollagenase (Kolben B) Schaumbildung zu vermeiden untergetaucht. Die Anschläge auf jeder Flasche sind eingekerbt, um eine effiziente Übertragung der Abwasser Linie zu ermöglichen und zu einem erhöhten Druck aus dem Sauerstoff zu verhindern.

Abbildung 3. Hepatocyte Präparate sind nicht mit SECs kontaminiert. Gleiche Mengen von Zelllysaten aus gereinigten Chargen von Hepatozyten (Spur 1) und Sekunden (Spur 2) wurden um 5% SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet. Monoklonale Antikörper # 30, das spezifisch gegen beide Isoformen (315 kDa und 190 kDa) von HARE/Stabilin-2 wurde verwendet, um die Lysate Sonde.

Abbildung 4. Vertrieb von markiertem Heparin in Organen. Die Ratten wurden über die laterale Schwanzvene mit ¹²⁵ I-SA-b-hep warten Sie 30 Minuten injiziert und dann verblutet. Das Blut wurde aufgefangen, so dass nicht alle Organe künstlich hoch Lesungen geben. Counts pro Minute (CPM) von jedem Organ gegen das Gewicht der Orgel in g normalisiert.

Abbildung 5. Menge an markiertem Heparin in Hepatozyten und Sekunden. RPMIch Medien mit ¹²⁵ I-SA-b-Hep durfte durch eine intakte Leber für 20 min durch Kollagenaseverdau und zellulären Reinigung gefolgt zirkulieren. Gleiche Mengen von Hepatozyten und SEC Zellproteins Lysate wurden mit dem Bradford-Assay quantifiziert und zählte mit einem Gamma-Counter.

Abbildung 6. Kupffer-Zellen werden aus SECs durch Adhäsion auf Glas getrennt. Die Zellen wurden in einer Säure-gewaschene Glas Kristallisierschale gegeben und man ließ sie für 15 min bei 37 ° C einzuhalten, 5% CO _2. Der Überstand mit nicht eingehalten Zellen wurde sanft geschwenkt und in ein Zentrifugenröhrchen. Lysate von beiden eingehalten Zellen auf Glas (Spur 1) und aus nicht-anhaftenden Zellen (Spur 2) wurden von 8% SDS-PAGE aufgetrennt, geblottet und sondiert mit einem Antikörper gegen CD163, die spezifisch für den Kupffer-Zellen ist.

Abbildung 7. SECs auf Fibronektin beschichteten Kunststoff verchromt 6-Well-Schalen wurden über Nacht in RPMI inkubiert ergänzt mit 0,1% BSA. Phasenkontrast-Bilder wurden bei (A) 100x und (B) 200x Vergrößerung.

Diskussion

Anästhesie der Ratte durch die hängenden Tropfen Methode, bei der Isofluran-Dampf verursacht Bewusstlosigkeit ist die bevorzugte Methode für unsere Studien. Ein Verdampfer kann auch anstelle einer Spritze mit Baumwolle, das Tier außerhalb der Kammer zu halten verwendet werden, aber die chirurgischen Eingriffe sind so schnell, es ist nicht erforderlich. Polyethylenglykol ist es, die Isofluran hinzugefügt, um den Dampfdruck und Verdunstung zu verringern. Zu viel Isofluran Dampf wird der Tod zu schnell zu induzieren. Wenn das Tier stirbt, bevor die Leber durchbohrt und blanchiert mit TBS, die Bündelung Blut Gerinnsel in der Leber und verhindern eine effiziente Reinigung der Sinusoide und Verdauung mit Kollagenase. Die Zugabe von Heparin kann nützlich sein, als Antikoagulans ist aber nicht in diesen Studien verwendet werden, da wir beschriftet Heparin als unsere Sonde verwenden.

Gey-Salzlösung (GBSS) wird oft von anderen Laboratorien für die Reinigung von SECs ersetzt. Zwar ist es für SEC Reinigung, hep nützlichatocytes tolerieren keine GBSS sowie Puffer 1-3 und Bewohnbarkeit sind nicht annähernd so hoch. Bei der Messung der Endozytose, ist es ratsam, Hintergrundwerte in der Orgel und in gereinigtem Hepatozyten zu messen.

Diese Methode ist eine von zwei für die effiziente Reinigung von SECs nach der Leberperfusion mit Collagenase. Die andere Methode trennt die Nicht-Parenchymzellen durch Auswaschen Zentrifugation ¹⁹ statt Percoll-Gradienten. Die Vorteile für die Verwendung von Schlämmen über Percoll Gradienten sind etwas höher Zellvitalitäten und Zahlen. Der Nachteil ist, dass Elutriation Zentrifugation eine spezielle Rotor, gewidmet Zentrifuge und Schlauchpumpe zusammen, die Zehntausende von Dollar kostet erfordert. Diese Methode erfordert nur die Verwendung einer Tischzentrifuge und Schlauchpumpe, die Standard in vielen Labors ist.

Trennung von SECs und KCS durch selektive Adhäsion ist eine Standardmethode20-22. Es ist zwar richtig, dass SECs wird auf das Glas und Kunststoff haften, ist der entscheidende Punkt, um acid-washed sauberes Glas mit nicht mehr als eine 15-minütige Inkubation Verwendung bei 37 ° C bei 5% CO _2. KC wird immer haften schneller als SECs und es ist ratsam, vorsichtig waschen die KCS mit den Medien, um alle verbleibenden SECs, dass sich lose extrahieren. Pronase und andere Proteasen sind auch im Kollagenaseverdau Schritte in diesem Protokoll weggelassen, um Bewohnbarkeit der Zellen zu erhöhen. Proteasen verdauen extrazellulären Rezeptoren und kann zelluläre Adhäsion in den letzten Reinigungsschritte zu hemmen.

Die hier vorgestellte Methode hat eine Vielzahl von Anwendungen. Obwohl wir das Endergebnis in dem Heparin zunächst up ist für die Abfertigung, die Durchblutung der Leber für den Erhalt von primären Hepatozyten aufgenommen wurden, zeigen, kann KC, SECS, und HSCs werden für eine Reihe von Studien, bei denen Stoffwechselwege, Immunregulation, Scavenger-Aktivitäten und andere nützliche physiologischen studies. Der schwierigste Teil dieses Verfahrens ist eine gute Zugänge, die Verdauung der Leber, und die Handhabung der Leber, ohne den Katheter gleiten aus der Pfortader.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer 1: 142 mM NaCl 6.7 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.5% BSA, pH 7.4 Buffer 2 (perfusion buffer): 67.0 mM NaCl, 6.7 mM KCl, 4.8 mM CaCl2-H2O, 101.0 mM HEPES, BSA 1.5%, pH 7.4. Buffer 3: 137 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0.7 mM MgSO4, 1.2 mM CaCl2-2H2O, 10 mM HEPES, 1.5% BSA, pH 7.4 RPMI/BSA: 15g/L BSA in RPMI TRIS-buffered Saline (TBS): 154 mM NaCl, 10 mM Trizma Base salt. Collagenase: Collagenase A (#11088785103) from Roche, Collagenase Type I (#LS004691) from Worthington Biochemical or Collagenase I (#C0130) or IA (#C9891) from Sigma-Aldrich.
All salts are from Sigma-Aldrich
20L water bath	ThermoFisher	2231	Water is about 45 °C to compensate for cooling within the tubing.
Peristaltic Pump	Cole-Parmer	7553-70	Masterflex series
Refrigerated Centrifuge	Sorvall	Legend XTR
Catheter	BD Biosciences	381444
Dessicator chamber	Fisher	08595E	Use internal plate
Percoll	Sigma	P4937
Bovine Serum Albumin	SeraCare	AP-4510-01
100 μm mesh	Spectrum labs	146488
30 μm mesh	Spectrum labs	146506
RPMI 1640	Invitrogen	21870
Polyethylene glycol	Spectrum labs	PO107