ב אנדוציטוזה כבד vivo ואחריו טיהור בתאי הכבד על ידי זלוף כבד

Summary

המחקר בתאי הכבד סינוסי אנדותל (שניות) חייב להתבצע עם תאים ראשוניים שהתקבלו החיה לא כמו שורות תאים קיימות. שיטה זו מסתמכת על מערכת העיכול הכבד צנטריפוגה ההפרש לטיהור SEC עבור culturing ניסויים עתידיים.

Abstract

הכבד הוא מרכז חילוף החומרים בגופם של יונקים ומשמש כמסנן עבור בדם. הארכיטקטורה הבסיסית של הכבד מתוארת באיור 1, שבו יותר מ 85% ממסת הכבד מורכב hepatocytes ואת 15% הנותרים של מסת הסלולר מורכב של תאים Kupffer (KCs), בתאי stellate (HSCs), ו לתאי אנדותל סינוסי (שניות). שניות בצורת דפנות כלי הדם בתוך הכבד מכילים מורפולוגיה מיוחד הנקרא fenestrae בתוך בציטופלסמה. אשנוב של הציטופלסמה היא מראה של חורים (~ 100 מיקרומטר) בתוך התאים, כך לפעול שניות כמו מסננת שבה רוב chylomicrons, שרידי chylomicron ו מקרומולקולות, אך לא תאים, עוברים את hepatocytes ו HSCs ¹ (איור 1). בשל היעדר קרום במרתף, הפער בין שניות ו hepatocytes בצורת שטח של Disse. HSCs למלא חלל זה ולשחק תפקיד מרכזי בוויסות ותגובה injury, אחסון של החומצה הרטינואית ו immunoregulation ² של הכבד.

שניות הם בין התאים הפעילים ביותר בגוף endocytically הצגת מערך של קולטנים נבלות על פני התא שלהם ^3. אלה כוללים SR-A, Stabilin-1 ו Stabilin-2. באופן כללי, חלקיקים colloidal קטן פחות מ 230 ננומטר מקרומולקולות בשלב חיץ נתפסות על ידי שניות, ואילו, חלקיקים גדולים ופסולת הסלולר הוא endocytosed (phagocytosed) על ידי KCs ^4. לפיכך, אישור עיקר החומר תאיים כגון glycosaminoglycans מהדם תלויה במידה רבה על הבריאות פונקציות endocytic סעיפים ^5,6. לדוגמה, עלייה בדם hyaluronan מעיד על מחלת כבד החל קלה עד צורות חמורות יותר ^7.

למעט דו"ח אחד ^8, אין קווי הנציח SEC תא הקיום. אפילו את שורות התאים הוא הנציח דה differentiated בכך שהוא אינו מבטא קולטנים נבלות שנמצאים שניות הראשי (הנתונים שלנו, לא מוצג). מחקרים ביולוגיים כל תא חייב להתבצע על תאים ראשוניים שהתקבלו טרי מן החיה. לרוע המזל, שניות dedifferentiate בתנאים תרבות סטנדרטי יש להשתמש תוך 1 או 2 ימים על במנותק מן החיה. דיפרנציאציה של שניות מסומן על ידי הביטוי של Stabilin-2 או קולטן, הארי ^9, CD31, ואת הנוכחות של אשנוב cytoplasmic ^1. דיפרנציאציה של שניות ניתן להאריך על ידי תוספת של VEGF בתקשורת תרבות או על ידי תאים culturing במדיום מותנה hepatocyte ^10,11.

בדו"ח זה, נדגים את הפעילות endocytic של שניות בתוך איבר שלם באמצעות רדיו שכותרתו הפרין עבור hyaluronan עבור קולטן Stabilin-2-SEC ספציפיים. לאחר מכן אנו לטהר hepatocytes ו שניות מהכבד perfused למדוד אנדוציטוזה.

Protocol

1. כריתה של הכבד (שאומצה מ ת.ד. Seglen ¹² ור 'Blomhoff ¹³ עם תיקונים ^14,15)

1. הוסף 10 מ"ל 30% isoflurane ב פוליאתילן גליקול על צלחת פטרי בתא סגור 5.5 ליטר. התרחיש האופטימלי הוא לחכות 10-15 דקות אחרי תוספת של isoflurane ליצור אווירה התייצב בתוך החדר.
2. המקום חולדה בחדר אטום ולאפשר לו להיות בהרדמה. אפקטים מלאה של הרדמה הם לכאורה כאשר החיה הופך רפוי, לא מגיב, ותערוכות נשימות עמוקות.
3. מקום 2 מ"ל של isoflurane ב פוליאתילן גליקול כמה כדורי צמר גפן בתחתית הצינור מזרק 30 מ"ל.
4. מניחים את החולדה על גבו על מגש חיתול מכוסה ובמקום הצינור מזרק על החוטם.
5. מיד לאשר הרדמה עמוקה על ידי הרטבה את הבטן עם אתנול 70%. אל תתנו לבעל החיים למות ממנת יתר isoflurane.
6. בעזרת מספריים התחבושת מלקחיים, לחשוף את כולו עבדominal חלל.
7. אתר את porta הנבוב ו, באמצעות מלקחיים, לצייר שני גדילי משי כירורגית או חוט פוליאסטר (ליגטורה) מתחת porta הנבוב מיד מעל הסניף mesenteric.
8. למשוך את מלקחיים לקשור קשר רופף מעל לראשו.
9. בעזרת מלקחיים מתחת porta הנבוב בעדינות למשוך בחזרה ליישר את הווריד, cannulate את הווריד עם קטטר Autoguard Insyte (18 GA, 1.3 x 300 מ"מ, BD Biosciences) קטטר או דומה. הקטטר צריך ללכת כמה מ"מ מעבר הלולאה שנוצר על ידי חוט.
10. לסגת ולהסיר את המחט על ידי שחרור על ההדק קפיץ על הקטטר. דם צריך להתחיל מחלחל לתוך הקטטר המציין מיקום המיתר הנכון.
11. הדקו את הקשר הבוהן ומאובטח אותו עם אחר קשר הבוהן.
12. סבר גם את הווריד הנבוב נחות או אבי העורקים היורד (abdominalis אבי העורקים) כדי לאפשר ניקוז דם ממערכת הדם.
13. בגין שטיפה הכבד עם מחומצןTBS ב 37 ° C כדי להסיר את הדם (הלבנה) בקצב זרימה של 20 mL / min. הכבד צריך להפוך מ סגול אדמדם לצבע הטיט.
14. בעוד הכבד הוא הסמקה, הבלו על הכבד על ידי חיתוך משם את מערכת העיכול ורקמות החיבור. חשוב לא לקרוע את הכבד או לנקב כמוסה של Glisson.
15. מניחים את הכבד על רשת פלסטיק מעל משפך המאפשר מאגרים ייאספו ממוחזר. Buffers בשלב זה לא צריך להיות ממוחזר, אבל לזרום לתוך כוס את הפסולת. פלאשינג לא צריך להימשך יותר מ 10 דקות. (איור 2A). הכן את הפתרון הנדרש אנדוציטוזה 2.1 צעד.

2. הפנמה של ¹²⁵ I-SA-b-הפ (או אחרים ליגנד שכותרתו מתאימה)

1. כדי 50 מ"ל התקשורת RPMI בכוס קטנה, מוסיפים BSA ריכוז הסופי 0.05% ו 0.01 mCi ¹²⁵ I-SA-b-הפ או ליגנד מסומן כראוי אחרים אנדוציטוזה.
2. צירוף זה כוס של apparatuזה כדי לאפשר חמצון.
3. כבה את המשאבה, להחליף את צינורות היניקה, ולאחר מכן להפעיל את המשאבה על 20 mL / min.
4. ככל RPMI שכותרתו גישות הכבד, לכבות את משאבת ולאפשר הנוזלים העודפים בנתיב צינורות ומסננים.
5. מניחים את צינור הניקוז לתוך כוס התקשורת לאפשר recirculation התקשורת שכותרתו ולאחר מכן הפעל מחדש את המשאבה.
6. אפשר נוזלים recirculate דרך הכבד במשך שעה לא יותר מ 1.
7. במהלך שלב זה הפנמה, כדי להיות בטוח את הטמפרטורה בכבד יציבה על ידי כיסוי אותו ולהכין את collagenase לעיכול.

3. עיכול של הכבד על ידי מערכת העיכול collagenase

1. מומס טרי ולסנן (0.45 מיקרומטר) collagenase (100 מ"ג / ק"ג משקל חולדה) יש להוסיף למאגר ב 2 בהיקף כולל שלא יעלה על 60 מ"ל ב 37 ° C. היקף תלויה באורך / נפח פנימי של צינורות, והיא אמורה להיות בהתאם.
2. עצור את המשאבה ואת חילופיכניסת צינורות מקנקן התקשורת את כפות.
3. פלאש הכבד 2 דקות בשעה 50 mL / min המאפשר התרופפות של צמתים תא desmosomal אשר סידן תלוי.
4. בעוד הכבד הוא סומק, להחליף את כוס התקשורת עם כוס המכילה collagenase על המנגנון.
5. מיד לאחר השטיפה, להתחיל את מערכת העיכול עם collagenase בלולאה הדם בקצב זרימה של 20 mL / min עד 15 דקות. מאז קבוצות collagenase להשתנות לפי מספר הרבה, וריאציות בסכום וזמן העיכול צריך להיות מותאם עבור כל מגרש חדש של collagenase. Collagenase גם סידן תלוי. כבה את המשאבה ולעבור החיץ וקווי גז מבקבוקון A ל-B Flask העברת קו השפכים של מיכל הפסולת Flask B (איור 2 ב).
6. עצור את המשאבה, להסיר את הקטטר ולהעביר את הכבד לצלחת המכילה 20-30 הצפת מ"ל 1.
7. פיל בחזרה הקפסולה Glisson של הכבד לנער את התאs החוצה בנוזל.
8. כאשר נוזל הופך אטום עם חומר הסלולר, העברת תאים באמצעות רשת של 100 מיקרומטר ולאחריו סינון דרך רשת 30 מיקרומטר ואז לתוך 50 מ"ל חרוט על הקרח.
9. הוסף חוצץ יותר 1 לכבד ולהמשיך רועד תאים מטריצה ​​הכבד, להעביר את הנוזל מסננים רשת ו חרוטי.
10. חזור על שלבים 3.7-3.9 עד תאים לא יותר יכול להיות עקר עם רעד סביר של הכבד.

4. Hepatocyte ו-SEC טיהור

1. צנטריפוגה conicals 50 מ"ל המכיל תאים ב XG 150 דקות 3. כדי גלולה hepatocytes.
2. העברת חלק קטן המכיל נוזל שאינו parenchymal תאים 50 מ"ל conicals טריים על קרח.
3. לשטוף hepatocytes להיות resuspending את הכדור בתוך מאגר 3 וחזרה צעדים 4.1 ו 4.2 שלוש פעמים נוספות.
4. בסוף שוטפת, כדורי הם 97% ≥ hepatocytes טהור. כדי להשיג את שניות, צנטריפוגה כל צינורות גontaining ונקווה supernatant (המכיל HSCs, שניות, ועל KCs וכמה hepatocytes קטן) בשעה XG 200 עבור 10 דקות. ב 4 ° C.
5. לשאוב את המאגר ואת resuspend כל כדורי ב 5 מ"ל RPMI / BSA ב 4 ° C.
6. בריכת התאים יחד לתוך 2 צינורות להוסיף RPMI / BSA עד נפח של 35 מ"ל.
7. צנטריפוגה conicals ב XG 100 דקות 3.
8. איסוף למעלה 25 מ"ל של נוזל והעברה נקייה 50 מ"ל חרוטי.
9. Resuspend את הכדור ב 10 מ"ל התקשורת הנותרים ולהוסיף חזרה 25 מ"ל של קר RPMI / BSA ו צנטריפוגות ב XG 100 דקות 3.
10. חזור על שלבים 3.8 ו - 3.9 פעם נוספת, לבטל את התא גלולה ולהפחית 10 מ"ל התקשורת.
11. צנטריפוגה supernatents כדי גלולה שניות, KCs ו HSCs ב XG 200 עבור 10 דקות. ב 4 ° C.
12. להכין שלושה צינורות 50 מ"ל המכיל 20 מ"ל Percoll 25% PBS על הקרח. ביסוד עם Percoll 15 מ"ל ב -50% בצינור אחד.
13. Resuspend את כדורי תא בהיקף כולל של 30 מ"ל RPMI / BSA.
14. בזהירות כיסוי EACh שיפוע עם 10 מ"ל של תאים צנטריפוגות ב XG 900 עבור 20 דקות ב 4 ° C.
15. שניות ו KCs יש קרוב מאוד צפיפויות קליל והם בממשק% 25/50. HSCs הם בדרך כלל 25% / מדיה ממשק עקב הציפה גבוה יותר שלהם, כמו תאים לאחסון השומנים. כל שנותר hepatocytes ותאי דם יש buoyancies נמוך והם pelleted. לשאוב מלמעלה למטה ליד ממשק% 25/50 וזורקים את החומר הזה.
16. איסוף התאים בממשק% 25/50 ולהעביר חרוטי טרי עם RPMI קר. היקף הסופי צריך להיות ~ 40 מ"ל לדלל את Percoll.
17. צנטריפוגה חרוטי ב XG 350 דקות 10 ב 4 ° C עד גלולה התאים.
18. Resuspend התאים המכיל ~ 10 מ"ל מראש חימם RPMI 100 U / mL Penicillin/100 g / ml תאים סטרפטומיצין ומניחים צלחת חומצה שטף כוס צלחת פטרי או גיבוש.
19. דגירה התאים במשך 15 דקות. ב 37 מעלות צלזיוס תרבות רקמות חממה.
20. רוק או עיטורים את הצלחת קצתואז לאסוף את שניות ב supernatant. KCs לדבוק הזכוכית הרבה יותר מהר מאשר שניות. לחלופין, ניתן שניות הופרדו KCs ידי immunopurification באמצעות נוגדנים נגד CD31 או anti-Stabilin2/HARE מצומדות כדי חרוזים מגנטיים.
21. מספרים הכדאיות של התא עשוי להיות מוערך על ידי הרחקה כחול trypan באמצעות hemacytometer או באמצעות דלפק תא אוטומטיות.
22. תרבות שניות על פיברונקטין מצופה פלסטיק מנות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, BSA RPMI/0.25% עם 40 ng / mL VEGF, 100 U / mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין או עם התקשורת מותנה hepatocyte.
23. Hepatocytes, KCs, ואת שניות ניתן להעריך על הפנמה של חומר הנקרא על ידי שימוש הדלפק גמא נרמול לחלבון הסלולר מסך או על ידי מיקרוסקופית (אם שכותרתו fluorescently) באמצעות שיטות אלה culturing.

5. נציג תוצאות:

טיהור hepatocyte הוא ≥ 97% וטיהור SEC היא typicברית ≥ 95% בשיטה זו. כריתה של חלל הבטן, cannulation של וריד השער, ואת הלבנה של הכבד כל צריך להתרחש תוך דקה לקבלת התוצאות הטובות ביותר. HARE/Stabilin-2 הוא קולטן מסוים על הכבד שניות ולא בא לידי ביטוי סוגי תאים אחרים בכבד. במדגם זה, lysates תא של שני hepatocytes ו שניות הופרדו ב -5% SDS-PAGE ומישש עם נוגדנים חד שבטיים כנגד שניהם isoforms של Stabilin-2 (איור 3).

הפרין Unfractionated מוזרק לזרם הדם מנוקה על ידי הכבד ^16. חיסול מבוצע בעיקר בניגוד hepatocytes ו KCs ¹⁷ שניות על ידי הכבד. קולטן Stabilin-2/HARE הוא קולטן אישור העיקרי שמחבר ומפנים הפרין ב ¹⁸ שניות. בדוגמה שלנו כאן, אנחנו שכותרתו הפרין עם תג ביוטין על הקבוצה carboxylate של GlcNAc / NS. ביוטין היה מצומדות עם streptavidin iodinated לגילוי prot הפרין הפנימוeoglycan. הזרקה של הפרין שכותרתו ואחריו exsanguination 30 דקות לאחר הזרקה מאפשר לנו לפקח על האיברים להפנים צורה זו של הפרין. בהפסקה זה זמן קצר, הכבד הוא האיבר העיקרי אישור (איור 4).

כדי להבין באופן ברור יותר את סוג התא אחראי על אישור, הוספנו ¹²⁵ I-SA-b-הפ התקשורת RPMI בתוספת BSA 0.05% והרשה לה לזרום דרך הכבד במשך 20 דקות. בעקבות עיכול collagenase וטיהור הסלולר, הרוב המכריע של הפרין שכותרתו מופנם על ידי שניות בניגוד hepatocytes (איור 5).

באיור 1. ארכיטקטורה כבד בסיסי. שניות טופס קירות sinusoids והם בדרך כלל fenestrated (בקבוצות קטנות של עיגולים). תאים Stellate (HSCs) נמצאים שטח של Disse בניגוד Kupffer גאמות (KCs) אשר בדרך כלל נוכח microvasculature של sinusoids. Hepatocytes לכבוש את הצד השני של שטח של Disse.

באיור 2. סכמטי של המנגנון זלוף. א) הקמה של מנגנון במהלך השטיפה / כביסה של sinusoids של הכבד. TBS הוא בבקבוק 1 ליטר. ב) בקבוק 125 מ"ל המכיל ~ 60 חוצץ 2 מ"ל עם collagenase משמש לעיכול של הכבד במעגל סגור. קו שפכים משתנה גם מיכל הפסולת בקבוקון B באמצעות סימן חריץ פקק הגומי. קו החמצן אינו שקוע לתוך המאגר המכיל collagenase (בקבוקון B) כדי למנוע הקצפה. פקקים על כל בקבוק הם מחורצים לאפשר העברה יעילה של קו שפכים כדי למנוע לחץ מוגבר של גז החמצן.

באיור 3. ההכנות hepatocyte אינם מזוהמים שניות. כמויות שוות של lysates התא קבוצות מטוהרים של hepatocytes (מסלול 1) ו - שניות (מסלול 2) שהופרדו על ידי 5% SDS-PAGE ומחתה על nitrocellulose. נוגדנים חד שבטיים # 30 אשר ספציפי כנגד שניהם isoforms (315 ו - 190 kDa KDA) של HARE/Stabilin-2 שימשה החללית lysates.

איור 4. התפלגות הפרין שכותרתו באיברים. חולדות הוזרקו דרך וריד הזנב לרוחב לחכות עם I-SA-b-הממולח ¹²⁵ במשך 30 דקות ו exsanguinated אז. הדם נאסף כדי לא לתת לכל האיברים באופן מלאכותי קריאות גבוהה. ספירות לדקה (CPM) של כל איבר היו מנורמל כנגד משקלו של האיבר בגרמים.

איור 5. סכום של הפרין שכותרתו hepatocytes ו שניות. RPMאני מדיה המכילה ¹²⁵ I-SA-b-הפ הורשה להסתובב דרך הכבד ללא פגע במשך 20 דקות ולאחריה העיכול collagenase וטיהור הסלולר. כמויות שוות של hepatocyte ו-SEC lysates החלבון בתא היו לכמת עם Assay ברדפורד וספר על הדלפק גמא.

איור 6. Kupffer תאים מופרדים שניות על ידי הדבקה על זכוכית. תאים הונחו בצלחת חומצה שטף כוס גיבוש ואיפשר לדבוק במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. Supernatent המכיל תאים שאינם דבק בעדינות התערבלו להציב צינור צנטריפוגות. Lysates משני תאים דבק על זכוכית (מסלול 1) וממנה אי דבק תאים (מסלול 2) שהופרדו על ידי 8% SDS-PAGE, מחק, ומישש עם נוגדן נגד CD163 שהוא ספציפי עבור תאים Kupffer.

איור 7. מצופה שניות על פלסטיק מצופה פיברונקטין 6-היטב מנות הודגרו לילה RPMI BSA בתוספת 0.1%. בניגוד לתמונות שלב צולמו (א) ו - 100x (ב) 200x ההגדלה.

Discussion

הרדמה של החולדה בשיטה טיפה תלוי בו isoflurane הכרה אדי מעוררת היא השיטה המועדפת ללימודים שלנו. מאדה עשוי לשמש גם במקום מזרק עם צמר גפן כדי לשמור על חיים מחוץ לחדר, אך ניתוח זה כל כך מהר, זה לא נדרש. פוליאתילן גליקול מתווספת isoflurane כדי להקטין את לחץ אדים וקצב אידוי. יותר מדי אדי isoflurane תגרום למוות מהר מדי. אם החיה מתה לפני הכבד cannulated והחוויר עם TBS, איגום קריש דם עלול בכבד ולמנוע כביסה יעיל של sinusoids ועיכול עם collagenase. תוספת של הפרין עשוי להיות שימושי כמו קרישה, אך אינו משמש במחקרים אלה שכן אנו משתמשים הפרין שכותרתו בדיקה שלנו.

שנאגרו של גיי תמיסת מלח (GBSS) מוחלף לעתים קרובות לטיהור של שניות על ידי מעבדות אחרות. אמנם זה שימושי עבור טיהור-SEC, בענייניםatocytes לא לסבול GBSS וכן Buffers 1-3 ו viabilities אינם בגובה דומה. כאשר מודדים אנדוציטוזה, זהו תרגול טוב כדי למדוד את רמות הרקע האיבר וגם מטוהרים hepatocytes.

שיטה זו היא אחת משתי לטיהור יעיל של שניות לאחר זלוף כבד עם collagenase. השיטה האחרת מפרידה הלא parenchymal תאים על ידי צנטריפוגה elutriation ¹⁹ במקום שיפוע Percoll. היתרונות לשימוש elutriation על הדרגתיים Percoll הם viabilities תא מעט גבוה יותר ומספרים. החיסרון הוא צנטריפוגה elutriation דורש הרוטור התמחה, צנטריפוגה ייעודי, ומשאבה peristaltic יחד שעולה עשרות אלפי דולרים. שיטה זו רק מחייב שימוש צנטריפוגה העליון בקירור שולחן המשאבה peristaltic אשר תקן במעבדות רבות.

הפרדת שניות ו KCs על ידי הדבקה סלקטיבית היא שיטה סטנדרטית20-22. אמנם נכון כי שניות תדבק זכוכית ופלסטיק, נקודת המפתח היא להשתמש חומצה שטף זכוכית נקייה עם לא יותר מ דגירה של 15 דקות בשעה 37 ° C 5% CO _2. KCs תמיד לדבוק שניות מהר יותר וגם רצוי לשטוף בעדינות את KCs עם התקשורת כדי לחלץ כל שנותר שניות שהפכו מחוברת באופן רופף. Pronase ו פרוטאזות אחרים השמיט גם את מערכת העיכול צעדים collagenase בפרוטוקול זה כדי להגדיל את viabilities של התאים. פרוטאזות לעיכול קולטני תאי ועלול לעכב הידבקות הסלולר השלבים לטיהור הסופי.

השיטה המוצגת כאן יש מגוון רחב של יישומים. למרות שאנחנו מראים את התוצאה הסופית שבה הפרין נלקח בתחילה ל זלוף אישור, הכבד להשגת hepatocytes העיקרי, KC, שניות, ועל HSCs עשוי להיות שימושי עבור מספר מחקרים שכללו מסלולים מטבוליים, immunoregulation, פעילויות נבלות, ועוד פיזיולוגיים Studies. החלק הקשה ביותר של הליך זה הוא cannulation טוב, עיכול של הכבד, וטיפול בכבד מבלי להחליק צנתר מהעורק הפורטל.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם	חברה	דגם / קטלוג #	הערה
אמבט מים 20L	ThermoFisher	2231	המים על 45 מעלות צלזיוס, כדי לפצות על קירור
			בתוך הצינור.
Peristaltic משאבה	קולמן בן הזוג	7553-70	Masterflex סדרה
קירור צנטריפוגה	Sorvall	מקרא XTR
צנתר	BD Biosciences	381444
Dessicator קאמרית	דיג	08595E	השתמש צלחת פנימי
Percoll	סיגמא	P4937
שור סרום אלבומין	SeraCare	AP-4510-01
100 מיקרומטר רשת	ספקטרום מעבדות	146488
30 מיקרומטר רשת	ספקטרום מעבדות	146506
RPMI 1640	Invitrogen	21870
פוליאתילן גליקול	ספקטרום מעבדהs	PO107