肝灌流による肝細胞の精製した生体肝エンドサイトーシスに

要約

ない細胞株が存在しないと肝類洞内皮細胞（SECS）の研究は、動物から得られた初代培養細胞を使用して実行する必要があります。このメソッドは、その後の培養と実験のためのSECの浄化のための肝臓の消化および分画遠心法に依存しています。

要約

肝臓は哺乳類の体の代謝の中心であり、血液用のフィルタとして機能します。肝臓の基本的なアーキテクチャは、肝臓の質量の85％以上が肝細胞で構成されていると、細胞塊の残り15％はクッパー細胞（KCS）、星状細胞（HSC）で構成されている図1に示​​されている、と類洞内皮細胞（秒）。 SECSは、肝臓内の血管壁を形成し、細胞質の内fenestraの複数形と呼ばれる特殊な形態が含まれています。細胞質の開窓最もカイロミクロン、カイロミクロンレムナントと高分子のふるいとしてSECS行為そのため、細胞内の穴の外観（〜100μm程度）ではなく、細胞が、肝細胞および造血幹細胞に通過さ^1（ 図1）。基底膜の欠如に起因する、SECSと肝細胞間のギャップは、Disseの空間を形成する。造血幹細胞は、このスペースを占有し、規制やiへの応答に重要な役割を果たすnjury、レチノイン酸と肝²の免疫調節の記憶。

SECSは、その細胞表面³上のスカベンジャー受容体の配列を表示する体の最もendocyticallyアクティブセルの一つです。これらは、SR - A、Stabilin - 1とStabilin - 2が含まれています。大きな粒子と細胞残渣がKCS ⁴で（貪食）エンドサイトーシスされ、一方、一般的に、バッファの段階で小さなコロイド粒子より小さい230 nmにおよび高分子は、SECSで取り上げられている。従って、このような血液からグリコサミノグリカンなどの細胞外物質のバルククリアランスは健康とSECS ^5,6のエンドサイトーシスの機能に大きく依存している。例えば、血中ヒアルロン酸濃度の増加は軽度からより重症⁷までの範囲の肝疾患の指標である。

つのレポート⁸を除いて、存在には不死化SECの細胞株はありません。さえこの不死化細胞株は、非差別です。それは主要なSECS（私たちのデータは、図示せず）上に存在するスカベンジャー受容体を発現しないという点でated。すべての細胞生物学的な研究は、新鮮な動物から得られた初代培養細胞上で実行する必要があります。残念ながら、SECSは標準的な培養条件下で脱分化すると動物からの分離によって1〜2日以内に使用しなければなりません。 SECSの分化はStabilin - 2またはHARE受容体⁹の発現、CD31、および細胞質の開窓¹の存在によってマークされています。 SECSの分化は、培地中のVEGFを添加することによりまたは肝細胞の馴化培地^10,11の培養細胞による拡張することができます。

このレポートでは、我々はSEC固有Stabilin - 2受容体に対するヒアルロン酸のための無線標識ヘパリンを使用して無傷の器官でSECSのエンドサイトーシス活性を示すだろう。我々は、その後、エンドサイトーシスを測定するために灌流した肝臓から肝細胞とSECSを浄化します。

プロトコル

1。肝臓の切除（修正^14,15とPO Seglen ¹²とR. Blomhoff ¹³から採用された）

1. クローズ5.5 Lチャンバー内のペトリ皿にポリエチレングリコールのイソフルラン10mLの30％を追加。それは、チャンバー内で安定な雰囲気を作成するにはイソフルランの添加後10〜15分を待つことが最適です。
2. 密閉チャンバーにラットを置き、それが麻酔になることができます。麻酔の完全な効果は、動物がぐったりなったときに、応答のない明白であり、そして深呼吸を示す。
3. 30mLの注射器のチューブの下部にある綿球のポリエチレングリコールのイソフルランの場所を2mL。
4. おむつに覆われたトレイに、その背中にラットを置き、鼻を介して注射器のチューブを置きます。
5. 直ちに70％エタノールで腹部を濡らすことによって、深い麻酔を確認してください。動物はイソフルラン過剰摂取で死ぬようにしてください。
6. 包帯のはさみや鉗子を使用して、全体のABDを公開ominal空洞。
7. 静脈ポルタを検索して、鉗子を使用して、すぐに腸間膜枝の上に静脈ポルタ下外科シルクやポリエステル糸（合字）の二本鎖を引く。
8. 鉗子を撤回し、緩い結び目の結び目を作る。
9. 静脈ポルタの下に鉗子を使用して、ゆっくりと静脈をまっすぐに引いて、Insyte Autoguardのカテーテル（18 GA、1.3 × 300ミリメートル、BDバイオサイエンス）または同様のカテーテルを静脈にカニューレを挿入する。カテーテルは、スレッドによって形成されるループを超えて数mmを行く必要があります。
10. カテーテルにあるバネトリガーを解放することによって針を収納して削除する。血液は、適切な合字の配置を示すカテーテルにまで浸透開始する必要があります。
11. オーバーハンドノットを締め、別のオーバーハンドノットで固定します。
12. 血液が循環系から排出できるように、どちらかの下大静脈や下行大動脈（腹部大動脈）を断ち切る。
13. 酸素と肝臓のフラッシュを開始する37 TBS℃で20 mL /分の流量で血液（白化）を除去する。肝臓は赤紫色からローム層の色に変わるはずです。
14. 肝臓がフラッシュされている間、消費税消化管と結合組織を離れて切断することによって肝臓。肝臓または穿刺グリソン鞘を裂くようにすることが重要です。
15. バッファの収集と再循環を可能にする漏斗上にプラスチックのネット上で肝臓を置きます。この時点でバッファは循環が、廃棄物のビーカー内に流入してはいけません。フラッシングは、10分以上続くことはありません。 （ 図2A）。ステップ2.1で必要なエンドサイトーシスの溶液を調製します。

2。 ¹²⁵ I - SA - B - HEP（または他の適切な標識リガンド）の内在化

1. 小さ ​​なビーカーに50mlのRPMI培地に、最終濃度0.05％のBSAと0.01 mCiの¹²⁵ I - SA - B - HEPまたはエンドサイトーシスのための他の適切な標識リガンドに追加します。
2. apparatuにこのビーカーを取り付けますの酸素化を可能にする。
3. 、ポンプの電源をオフにインレットチューブを切り替え、その後、20mL /分でポンプの電源を入れます。
4. というラベルのRPMIが肝臓に近づくと、ポンプの電源を切り、漏斗とチューブドレインで余分な水分を許可する。
5. ラベルを付けたメディアの再循環を可能にしてポンプを再起動するためにメディアのビーカーにドレインチューブを置きます。
6. 流体がこれ以上より1時間肝臓を通して循環することができます。
7. この内部化のステップの間、肝臓内の温度がそれをカバーし、消化のためにコラゲナーゼを準備することで安定であることを確認してください。

3。コラゲナーゼ消化により肝臓の消化

1. たて溶解し、ろ過（0.45μm）のコラゲナーゼ（100 mg / kgのラットの体重）を37で60 mLを超えないように総量で2をバッファに追加されるべき℃にボリュームは、チューブの長さ/内部容積に依存しており、それに応じて調整する必要があります。
2. ポンプと交換停止メディアのビーカーからTBSへの入口チューブ。
3. カルシウム依存しているdesmosomal細胞の接合部のゆるみを可能に50mL /分で2分間の肝臓をフラッシュします。
4. 肝臓がフラッシュされている間、装置のコラゲナーゼを含むビーカーにメディアのビーカーを交換。
5. すぐに洗浄後、15分間20mL /分の流量で循環ループにおけるコラゲナーゼで消化を始めます。コラゲナーゼのバッチは、ロット番号によって異なりますので、消化の量と時間の変動は、コラゲナーゼのすべての新しいロットのために最適化する必要があります。コラゲナーゼはまた、カルシウム依存性である。ポンプの電源をオフにして、フラスコBに（ 図2B）フラスコBに廃棄物の容器からの流出ラインを転送フラスコからバッファおよびガスラインを切り替える。
6. ポンプを停止し、カテーテルを取り外し、20〜30 mlのBuffer 1を含む皿に肝臓を転送する。
7. 肝臓のグリソン鞘戻って皮をむき、細胞を振る液体での出。
8. 液体が細胞物質と不透明になると、30μmのメッシュを介して、次に50 mLコニカルに氷上でろ過により、100μmのメッシュを介して細胞を移す。
9. 肝臓に多くのバッファ1を追加し、メッシュフィルターと円錐に液体を移す、肝臓のマトリックスから細胞を振り続ける。
10. これ以上の細胞が肝臓の揺れ合理的に外れないことができるまで、ステップを3.9から3.7を繰り返します。

4。肝細胞とSEC精製

1. 3分間150 × gで細胞を含有する50mLのconicalsを遠心分離します。ペレット肝細胞へ。
2. 氷の上で新鮮な50mLのconicalsする非実質細胞を含む液体フラクションを転送する。
3. 肝細胞は、バッファ3にペレットを再懸濁し、ステップ4.1と4.2を3回繰り返すことが洗う。
4. 洗浄の最後に、ペレットは≥97パーセント純粋な肝細胞です。 SECSを取得するには、管cのすべてを遠心10分間、200 xgで（造血幹細胞、SECS、およびKCSといくつかの小さな肝細胞を含む）上清をプールontaining。 4℃
5. バッファーを吸引除去し、4で5 mLのRPMI / BSA内のすべてのペレットを再懸濁℃を
6. 2チューブに一緒に細胞をプールし、35 mLのボリュームを最大RPMI / BSAを加える。
7. 3分を100 × gでconicalsを遠心分離します。
8. 液体ときれいな50 mLコニカルへの転送の上位25 mLを収集する。
9. 残りの10 mLの培地でペレットを再懸濁し、バック冷RPMI / BSAと3分を100 × gで遠心分離を25 mLを加え。
10. もう一度手順3.8と3.9を繰り返して、細胞ペレットと下位10 mLのメディアを破棄する。
11. 10分間、200 xgでペレットSECS、KCS、および造血幹細胞にsupernatentsを遠心分離します。 4℃
12. 氷上でPBSで20mLの25％パーコールを含む3つの50 mLの試験管を準備します。各チューブに15 mLの50％パーコールとアンダーレイ。
13. 30 mLのRPMI / BSAの合計容積に細胞ペレットを再懸濁します。
14. 慎重にオーバーレイEAC4℃20分、900​​ xgで細胞と遠心を10 mL℃の時間勾配
15. SECSとKCSは非常に好調な密度を閉じて、50分の25％のインタフェースにありますしている。 25％/メディアは、脂質を格納する細胞としての高い浮力に起因する界面での造血幹細胞は、通常です。残りのすべての肝細胞と血液細胞は、低いbuoyanciesを持っているし、ペレット化。 50分の25％の界面付近のトップダウンから吸引し、この材料を捨てる。
16. 50分の25％のインタフェースと冷RPMIと新鮮な円錐への転送に細胞を回収。最終容量は、パーコールを希釈するために〜40 mLのはずです。
17. 4時10分、350 × gで円錐形を遠心° Cの細胞をペレット化する。
18. 〜10 mLを予め温めておいたRPMIは酸洗浄ガラスペトリ皿または結晶皿の中で100 U / mLのPenicillin/100 g / mlのストレプトマイシンおよび場所の細胞を含むで細胞を再懸濁します。
19. 15分間細胞をインキュベートする。組織培養インキュベーターで37℃。
20. ロックまたはスワールプレートを少しし、上清中のSECSを収集する。 KCSは、はるかに急速にSECS以上のガラスに付着する。また、SECSは、磁気ビーズに結合した抗CD31またはanti-Stabilin2/HARE抗体を用いた免疫精製によってKCSから分離することができる。
21. 生存率と細胞数は血球計算盤を用いてトリパンブルー排除により、または自動細胞カウンターを用いて評価することができます。
22. 37フィブロネクチンでコーティングされたプラスチック製の皿° C、5％CO _2、40 ng / mLのVEGF、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンを持つまたは肝細胞馴化培地とRPMI/0.25％のBSAでの文化は、SECS。
23. これらの培養方法を用いて肝細胞、KCS、およびSECSガンマカウンターで標識された物質の内部化のために評価し、細胞のタンパク質や顕微鏡での合計に正規化されることがあります（蛍光標識されている場合）。

5。代表的な結果：

肝細胞精製は≥97％であるとSECの精製はtypicです味方≥95％このメソッドを使用する。腹腔の切除、門脈のカニューレ挿入、および肝臓のブランチングは、すべての最良の結果を得るためには分以内に発生する必要があります。 HARE/Stabilin-2は、肝臓のSECS上の特定の受容体であり、他の肝臓の細胞型で発現されていません。このサンプルでは、肝細胞及びSECS両方の細胞溶解液を5％SDS - PAGEにより分離し、Stabilin - 2の両方のアイソフォーム（ 図3）に対するモノクローナル抗体でプローブ。

血流に注入された未分画ヘパリンは肝臓¹⁶でクリアされます。クリアランスは、主に肝細胞およびKCS ^17〜対照的に、肝臓のSECSによって実行されます。 Stabilin-2/HARE受容体が結合し、SECS ¹⁸にヘパリン内部化メインクリアランス受容体である。ここに私たちの例では、我々はN -アセチルグルコサミン/ NSのカルボキシレート基上にビオチンタグを使用してヘパリンというラベルが付いて。ビオチンは、内部化ヘパリンのprotの検出のためのヨウ素化されたストレプトアビジンと結合させたeoglycan。放血30分後の注射に続いて標識したヘパリンの注入は、私たちはヘパリンのこの形式を内部化なる器官を監視することができます。この短い時間間隔で、肝臓は主なクリアランスの器官（ 図4）です。

より明確に細胞型がクリアランスに責任があるかを理解するために、我々は、0.05％BSAを添加したRPMI培地にI - SA - B - HEP ^125を追加し、それが20分間肝臓を通って循環することができました。コラゲナーゼ消化し ​​、細胞の精製の ​​後、標識したヘパリンの大部分は肝細胞（ 図5）とは対照的に、SECSによって内在化されています。

図1基本的な肝臓のアーキテクチャ。 SECSは、正弦波の壁を形成し、通常は（円の小さなクラスター）窓のあるされています。星状細胞（HSC）は、クッパーCとは対照的にDisseのスペースに記載されています通常、正弦波の微小血管に存在するells（KCS）。肝細胞はDisseのスペースの反対側を占める。

図2。灌流装置の回路図。 A）肝臓の類洞のフラッシュ/洗濯時の装置のセットアップ。 TBSは1Lフラスコにあります。 B）コラゲナーゼで〜60 mlのBuffer 2を含む125mLのフラスコに、閉回路における肝臓の消化のために使用されます。排水ラインは、ゴム栓でノッチのカットを通じて廃棄物の容器からフラスコBに変更されます。酸素ラインは発泡避けるために、コラゲナーゼ（フラスコB）を含む緩衝液に浸漬されていません。各フラスコでストッパーは排水ラインの効率的な転送を可能にすると酸素ガスからの上昇圧力を防ぐために、ノッチです。

図3。 肝細胞調製物は、SECSで汚染されていません。精製された肝細胞のバッチ（レーン1）およびSECS（レーン2）からの細胞溶解物の等量の5％SDS - PAGEによって分離し、ニトロセルロースにブロットした。 HARE/Stabilin-2の両方のアイソフォーム（315 kDaと190 kDaの）に対して特異的なモノクローナル抗体＃30は溶解液をプローブするために使用されていました。

図4。器官の標識ヘパリンの分布。ラットを30分間¹²⁵ I - SA - B - HEPの待機と外側尾静脈を介して注入し、放血した。血液は人工的にあらゆる臓器に高い測定値を与えるためにしないように、収集した。各器官の分当たりのカウント数（CPM）は、グラムの臓器の重量に対して正規化された。

図5肝細胞及びSECSで標識したヘパリンの量。 RPM¹²⁵ I - SA - B - HEPを含む私のメディアは、コラゲナーゼ消化し ​​、細胞の精製に続いて20分間そのままに肝臓を通って循環させた。肝細胞およびSEC細胞の蛋白質の溶解物の等量のBradfordアッセイで定量し、ガンマカウンターでカウントした。

図6。クッパー細胞は、ガラス上に付着によってSECSから分離されています。細胞は酸洗浄ガラス結晶皿に入れ、37℃で15分間、5％CO ₂のために付着させた。非付着細胞を含む上清を静かに旋回し、遠心管に入れていた。ガラスの両方の接着細胞（レーン1）から、非接着細胞（レーン2）から溶解液を8％SDS - PAGEにより分離、ブロッティング、およびクッパー細胞に特異的であるCD163に対する抗体でプローブした。

フィブロネクチン被覆プラスチックにメッキを図7。SECSを6ウェルディッシュは、0.1％BSAを添加したRPMIで一晩インキュベートした。位相コントラスト画像は、（A）100倍と（B）200倍の倍率で撮影した。

ディスカッション

イソフルラン蒸気が無意識を誘導するハンギングドロップ法によるラットの麻酔は、私たちの研究のための好ましい方法である。気化器は、チャンバ外部に動物を維持するために綿で注射器の代わりに使用される場合がありますが、外科手術が非常に速くなる、これは必須ではありません。ポリエチレングリコールは、蒸気圧および蒸発速度を減少させるためにイソフルランに追加されます。あまりにも多くのイソフルラン蒸気は、早すぎる死を誘発する。肝臓は、カニューレを挿入し、TBS、肝臓におけるプーリングの血液5月の血栓をブランチングとコラゲナーゼと正弦波と消化の効率的な洗浄を防止する前に動物が死亡した場合。ヘパリンの添加は、抗凝固剤として有用かもしれないが、我々はプローブとして標識したヘパリンを使用するので、これらの研究では使用されません。

Geyの緩衝生理食塩溶液（GBSS）が頻繁にSECSの精製のために他の研究室で置換されている。それは、SECの精製、HEPのに便利ですが、atocytesは1-3 GBSSだけでなく、バ​​ッファを許容しないと生存率がほぼ高くありません。エンドサイトーシスを測定するとき、それは臓器で、肝細胞を精製でバックグラウンドレベルを測定することをお勧めします。

このメソッドは、コラゲナーゼによる肝灌流は、次のSECSの効率的な精製のための2つのうちの1つです。他の方法は、水簸の遠心分離¹⁹の代わりに、Percoll勾配による非実質細胞を分離する。パーコール勾配上の水簸を使用するための利点は、わずかに高い細胞生存率と数字です。欠点は、水簸の遠心分離は、特殊なローター、専用の遠心機、そして何万ドルものコストがかかる一緒に蠕動ポンプを必要とすることです。このメソッドは、多くの研究室で標準となっている冷蔵テーブルトップ遠心機と蠕動ポンプを使用する必要があります。

選択的接着によるSECSとKCSの分離は、標準的な方法です。20から22。それはSECSは、ガラスやプラスチックに付着することは確かですが、キーポイントは、37℃で15分間のインキュベーションを超えないで酸洗浄きれいなガラスを使用することです。℃、5％のCO _2。 KCSは、常にSECSより速く付着し、それは静かにゆるく付着して残りのSECSを抽出するためにメディアとKCSを洗うことをお勧めします。プロナーゼと他のプロテアーゼは、細胞の生存率を高めるためにこのプロトコルのコラゲナーゼ消化のステップから省略されています。プロテアーゼは細胞外受容体を消化し、最終精製工程における細胞接着を阻害する可能性があります。

ここで紹介する方法は、多種多様なアプリケーションを持っています。我々はヘパリンが最初にクリアランスのためにとられている最終的な結果を示していますが、初代肝細胞、KC、SECS、および造血幹細胞を得るための肝臓の灌流は、代謝経路、免疫調節、スカベンジャーの活動、および他を含む数多くの研究に役立つことがあります生理トゥディES。この手順の中で最も難しい部分は、門脈からカテーテルの滑りをしなくても良いカニュレーション、肝臓の消化、および肝臓の処理です。

資料

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の名前	会社	モデル/カタログ＃	コメント
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蠕動ポンプ	コー​​ル - パーマー	7553〜70	Masterflexシリーズ
冷凍遠心器	ソーバル	レジェンドXTR
カテーテル	BDバイオサイエンス	381444
デシケーター室	フィッシャー	08595E	内部プレートを使用してください
パーコール	シグマ	P4937
ウシ血清アルブミン	SeraCare	AP - 4510から01
100μmのメッシュ	スペクトラムラボ	146488
30μmのメッシュ	スペクトラムラボ	146506
RPMI 1640	インビトロジェン	21870
ポリエチレングリコール	スペクトラムラボの	PO107