In Endocitosi Fegato vivo seguita da purificazione delle cellule del fegato da parte di perfusione epatica

Riepilogo

Lo studio del fegato cellule endoteliali sinusoidali (SEC) deve essere eseguita con le cellule primarie ottenute da animali, non esistono linee cellulari. Questo metodo si basa sulla digestione del fegato e centrifugazione differenziale per la purificazione SEC per la coltura successiva e sperimentazione.

Abstract

Il fegato è il centro metabolico del corpo dei mammiferi e funge da filtro per il sangue. L'architettura di base del fegato è illustrata in figura 1 in cui è composto oltre l'85% della massa epatica di epatociti e il restante 15% della massa cellulare è composto da cellule di Kupffer (KCS), cellule stellate (HSC), e sinusoidale cellule endoteliali (SEC). SECS formano le pareti dei vasi sanguigni all'interno del fegato e contengono morfologia specializzate chiamate Fenestrae all'interno del citoplasma. Fenestrazione del citoplasma è la comparsa di buchi (~ 100 micron) all'interno delle cellule in modo che l'atto SECS come un setaccio in cui la maggior parte chilomicroni, i resti chilomicroni e macromolecole, ma non le cellule, passano attraverso la epatociti e HSC ¹ (fig. 1). A causa della mancanza di una membrana basale, il divario tra i secondi e epatociti forma dello spazio di Disse. HSC occupare questo spazio e giocare un ruolo importante nella regolazione e la risposta di injury, stoccaggio di acido retinoico e immunoregolazione dei ² fegato.

SECS sono tra le cellule più endocytically attiva del corpo con un vasto insieme di recettori scavenger sulla loro superficie ^{a 3} celle. Questi includono SR-A, Stabilin-1 e Stabilin-2. In generale, le piccole particelle colloidali meno di 230 nm e macromolecole in fase di buffer sono ripreso da SECS, mentre le particelle più grandi e detriti cellulari è endocitosi (fagocitati) di KC ^4. Così, la clearance maggior parte del materiale extracellulare come la glicosaminoglicani dal sangue è in gran parte dipende dalla salute e delle funzioni di endocitico SECS ^5,6. Per esempio, un aumento dei livelli ematici di acido ialuronico è indicativo di malattia del fegato che vanno da lievi a forme più gravi ^7.

Con l'eccezione di un rapporto di ^8, non ci sono immortalati SEC linee cellulari esistenti. Anche questa linea di cellule immortalizzate è de-differenziareated in quanto non esprime recettori scavenger che sono presenti sul SECS primari (i nostri dati, non riportati). Tutti gli studi cellula biologica deve essere eseguita su cellule primarie appena ottenuto dall'animale. Purtroppo, SECS dedifferentiate in condizioni di coltura standard e deve essere utilizzato entro 1 o 2 giorni su isolamento dall'animale. Differenziazione delle SECS è segnata dall'espressione di Stabilin-2 o recettori LEPRE ^9, CD31, e la presenza di fenestrazione citoplasmatici ^1. Differenziazione delle SECS può essere esteso con l'aggiunta di VEGF nei terreni di coltura o da cellule in coltura degli epatociti mezzo condizionato ^10,11.

In questo rapporto, dimostreremo l'attività endocitico di SECS nell'organo intatto utilizzando radio-marcato eparina per acido ialuronico per la SEC specifici Stabilin-2 recettore. Ci sarà poi purificare epatociti e SECS dal fegato perfuso di misurare endocitosi.

Protocollo

1. Escissione del fegato (adottato dal PO Seglen ¹² e R. Blomhoff ¹³ con modifiche ^14,15)

1. Aggiungere 10 ml 30% isoflurano in polietilene glicole di una capsula di Petri in una camera chiusa 5,5 L. E 'ottimale per attendere 10-15 minuti dopo l'aggiunta di isoflurano a creare un'atmosfera stabilizzato all'interno della camera.
2. Mettere un topo in camera stagna e farlo diventare anestetizzati. Pieno effetto dell'anestesia sono evidenti quando l'animale diventa molle, non risponde, e mostre respirazione profonda.
3. Mettere 2 ml di isoflurano in polietilene glicole in alcuni batuffoli di cotone sul fondo di un tubo siringa da 30 ml.
4. Posizionare il ratto sulla sua schiena su un pannolino-vassoio coperto e posto il tubo siringa sopra il muso.
5. Immediatamente confermare anestesia profonda bagnando l'addome con il 70% di etanolo. Non lasciate l'animale muore per overdose isoflurano.
6. Con forbici e pinze fasciatura, esporre l'intero abdcavità ominal.
7. Individuare la vena porta e, utilizzando pinze, disegnare due fili di seta o di filo di poliestere chirurgico (legatura) sotto la vena porta immediatamente sopra il ramo mesenterica.
8. Ritirare le pinze e un nodo sciolto overhand.
9. Utilizzando pinze sotto la vena porta e delicatamente tirando indietro per raddrizzare la vena, cannulate la vena con un catetere AutoGuard Insyte (18 GA, 1,3 x 300 mm, BD Biosciences) catetere o simili. Il catetere dovrebbe andare al di là di qualche mm l'anello formato dal filo.
10. Ritrarre e rimuovere l'ago con il rilascio a molla trigger il catetere. Il sangue dovrebbe iniziare a filtrare fino al corretto posizionamento del catetere indicando legatura.
11. Serrare il nodo semplice e sicuro con un altro nodo semplice.
12. Sever sia la vena cava inferiore o aorta discendente (abdominalis aorta) per consentire di drenare il sangue dal sistema circolatorio.
13. Iniziare lavaggio del fegato con ossigenatoTBS a 37 ° C per rimuovere il sangue (sbiancamento) ad un flusso di 20 mL / min. Il fegato deve girare da un viola rossastro ad un colore terriccio.
14. Mentre il fegato è vampate, accise il fegato tagliando via il tratto gastrointestinale e del tessuto connettivo. E 'importante non lacerare il fegato o forare la capsula di Glisson.
15. Mettere il fegato in una rete di plastica sopra un imbuto che permette di buffer da raccogliere e ricircolare. Buffer a questo punto non dovrebbe essere rimessa in circolazione, ma il flusso nel becher rifiuti. Vampate di calore non dovrebbe durare più di 10 min. (Fig. 2A). Preparare la soluzione endocitosi richiesto al punto 2.1 passo.

2. Internalizzazione di ¹²⁵ I-SA-b-Hep (o altro idoneo legante etichettati)

1. A 50 ml RPMI dei media in un bicchiere piccolo, aggiungere a una concentrazione finale BSA 0,05% e 0,01 mCi ¹²⁵ I-SA-b-epatite o altre ligando adeguatamente etichettati per endocitosi.
2. Attaccare questa coppa al un attrezzos per consentire l'ossigenazione.
3. Spegnere la pompa, passare il tubo di aspirazione, e poi accendere la pompa a 20 ml / min.
4. Come RPMI etichettato avvicina al fegato, spegnere la pompa e che il liquido in eccesso nel imbuto e tubo di scarico.
5. Posizionare il tubo di scarico nel becher mezzi di comunicazione per permettere il ricircolo dei media etichettati e quindi riavviare la pompa.
6. Lasciare fluidi di ricircolare attraverso il fegato per non più di 1 ora.
7. Durante questa fase di internazionalizzazione, sia che la temperatura nel fegato è stabile coprendolo e preparare la collagenasi per la digestione.

3. La digestione del fegato mediante digestione collagenasi

1. Appena sciolto e filtrato (0,45 micron) collagenasi (100 mg / kg di peso ratto) dovrebbe essere aggiunto al buffer 2 in un volume totale non superiore a 60 ml a 37 ° C. Il volume dipende dalla lunghezza / volume interno del tubo e deve essere adeguato di conseguenza.
2. Fermare la pompa e lo scambio deltubo di aspirazione dalla coppa media per il TBS.
3. Lavare il fegato per 2 min a 50 ml / min che permette di allentamento delle giunzioni cellulari desmosomiali che sono il calcio dipendente.
4. Mentre il fegato è vampate di calore, scambio il becher media con il bicchiere contenente collagenasi sopra l'apparecchio.
5. Immediatamente dopo il lavaggio, inizia la digestione con collagenasi in un ciclo circolatorio ad un flusso di 20 mL / min per un massimo di 15 min. Dal momento che i lotti collagenasi variano in base al numero di lotto, le variazioni nella quantità e nel tempo di digestione devono essere ottimizzati per ogni nuovo lotto di collagenasi. Collagenasi è anche il calcio dipendente. Spegnere la pompa e passare il buffer e le linee di gas da A a B. Flask Flask Trasferire la linea di scarichi dal contenitore dei rifiuti a Flask B (Fig. 2B).
6. Fermare la pompa, rimuovere il catetere e trasferire il fegato di un piatto contenente 20-30 mL di tampone 1.
7. Staccare la Glisson di capsula del fegato e scuotere il cellulares nel liquido.
8. Come il liquido diventa opaco con materiale cellulare, trasferire le cellule attraverso una maglia 100 micron seguita da filtrazione attraverso una maglia 30 micron e poi in un cono da 50 ml su ghiaccio.
9. Aggiungere più Tampone 1 al fegato e continuare scuotendo le cellule dalla matrice fegato, trasferendo il liquido per i filtri a rete e coniche.
10. Ripetere i passaggi 3,7-3,9 fino a quando non più cellule possono essere sloggiato con agitazione ragionevole del fegato.

4. Epatociti e SEC purificazione

1. Centrifugare i 50 mL conicals contenenti cellule a 150 xg per 3 min. per far sedimentare il epatociti.
2. Trasferire la frazione liquida che contiene le cellule non-parenchimali a fresco 50 ml conicals sul ghiaccio.
3. Lavare i epatociti essere risospendere il pellet in Tampone 3 e ripetendo i punti 4.1 e 4.2 altre tre volte.
4. Alla fine della lava, i pellet sono epatociti ≥ 97%. Per ottenere i secondi, centrifuga tutti i tubi containing pool surnatante (contenente HSC, secondi, e KC e alcuni piccoli epatociti) a 200 xg per 10 min. a 4 ° C.
5. Aspirare il buffer e risospendere tutti i pellet in 5 ml RPMI / BSA a 4 ° C.
6. Piscina unite le cellule in 2 tubi e aggiungere RPMI / BSA fino ad un volume di 35 ml.
7. Centrifugare conicals a 100 xg per 3 min.
8. Raccogliere i primi 25 ml di liquido e trasferirlo in una pulita da 50 ml.
9. Risospendere il pellet nel restante 10 media mL e aggiungere 25 ml di ritorno freddo RPMI / BSA e centrifugare a 100 xg per 3 min.
10. Ripetere i punti 3.8 e 3.9 una volta di più, scartare il pellet e 10 media inferiore ml.
11. Centrifugare il supernatents a pellet secondi, KC, e CSE a 200 xg per 10 min. a 4 ° C.
12. Preparare tre provette da 50 ml contenente 20 ml di Percoll al 25% in PBS su ghiaccio. Alla base con 15 ml di Percoll al 50% in ciascun tubo.
13. Risospendere il pellet di cellule in un volume totale di 30 ml RPMI / BSA.
14. Attentamente sovrapposizione each pendenza con 10 ml di cellule e centrifugare a 900 xg per 20 min a 4 ° C.
15. Secondi e KC hanno molto vicino densità di galleggiamento e sono a livello di interfaccia 25/50%. HSCs sono in genere al 25% / media interfaccia per la loro galleggiabilità maggiore, come le cellule lipidiche memorizzazione. Qualsiasi epatociti e cellule del sangue rimanenti hanno la buoyancies inferiori e sono pellet. Aspirare dall'alto verso il basso vicino l'interfaccia% 25/50 e smaltire questo materiale.
16. Raccogliere le cellule nel interfaccia 25/50% e trasferirli in un cono fresco con fredda RPMI. Il volume finale deve essere ~ 40 ml per diluire il Percoll.
17. Centrifugare la conica a 350 xg per 10 min a 4 ° C per agglomerare le cellule.
18. Risospendere le cellule in ~ 10 ml preriscaldata RPMI contenente 100 U / mL Penicillin/100 g / mL streptomicina celle e collocare in un piatto di vetro, lavata con acido Petri o cristallizzare piatto.
19. Incubare le cellule per 15 minuti. a 37 ° C in un tessuto culturale incubatore.
20. Roccia o agitare la piastra un po 'e poi raccogliere i SECS nel surnatante. Il KC aderire al vetro molto più rapidamente di secondi. In alternativa, SECS possono essere separati da KC da immunopurification utilizzando anticorpi anti-CD31 o anti-Stabilin2/HARE coniugato con sfere magnetiche.
21. Numeri vitalità delle cellule e possono essere valutati per esclusione trypan blu con un emocitometro o con l'utilizzo di un contatore automatico delle celle.
22. Cultura del sec su piatti di plastica fibronectina rivestite a 37 ° C, 5% di CO _2, RPMI/0.25% BSA con 40 ng / mL di VEGF, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina o con epatociti mezzi condizionati.
23. Epatociti, KC, e SECS possono essere valutare per l'internalizzazione dei materiali etichettati con l'uso di un contatore gamma e normalizzante per un totale di proteina cellulare o al microscopio (se fluorescente) utilizzando questi metodi di coltura.

5. Rappresentante dei risultati:

Purificazione degli epatociti è ≥ 97% e la purificazione SEC è typicalleato ≥ 95% con questo metodo. Asportazione della cavità addominale, incannulazione della vena porta, e pallore del fegato tutto dovrebbe avvenire entro un minuto per ottenere i migliori risultati. HARE/Stabilin-2 è un recettore specifico sulla SECS fegato e non è espresso in altri tipi di cellule del fegato. In questo esempio, lisati di cellule sia di epatociti e SECS erano separati da 5% SDS-PAGE e sondato con un anticorpo monoclonale contro entrambe le isoforme di Stabilin-2 (Fig. 3).

Eparina non frazionata iniettate nel flusso sanguigno viene eliminato dal fegato ^16. La clearance è principalmente eseguita da SECS fegato in contrasto con epatociti e KC ^17. Il recettore Stabilin-2/HARE è il recettore principale che lega spazio e interiorizza eparina in sec ^18. In questo nostro esempio, abbiamo etichettato eparina con un tag biotina sul gruppo carbossilato di GlcNAc / NS. La biotina è stata coniugata con streptavidina iodati per la rilevazione di interiorizzate prot eparinaeoglycan. L'iniezione del eparina etichettati seguito da dissanguamento 30 minuti post-iniezione ci permette di monitorare quali organi interiorizzare questa forma di eparina. In questo breve intervallo di tempo, il fegato è l'organo primario distanza (Fig. 4).

Per meglio comprendere quale tipo di cellula è responsabile per la liquidazione, abbiamo aggiunto ¹²⁵ I-SA-b-Hep ai media RPMI integrato con 0,05% BSA e permesso di circolare attraverso il fegato per 20 minuti. A seguito di digestione collagenasi e purificazione cellulare, la stragrande maggioranza di eparina marcato è interiorizzato da SECS in contrasto con epatociti (Fig. 5).

Figura 1. Architettura di base di fegato. SECS formano le pareti dei sinusoidi e sono normalmente finestrate (piccoli gruppi di cerchi). Cellule stellate (CSE) si trovano nello spazio di Disse in contrasto con Kupffer cells (KC) che sono normalmente presenti nel microcircolo dei sinusoidi. Epatociti occupano l'altro lato dello spazio di Disse.

Figura 2. Schematica degli apparati di perfusione. A) Set-up di apparecchi durante il lavaggio / lavaggio delle sinusoidi del fegato. TBS è in un pallone da 1 L. B) A 125 ml beuta contenente ~ 60 mL di tampone 2 con collagenasi viene utilizzata per la digestione del fegato in un circuito chiuso. La linea emissario è cambiato anche dal contenitore dei rifiuti a B beuta attraverso un taglio tacca nel tappo di gomma. La linea di ossigeno non è sommerso nel buffer contenente collagenasi (B fiasco) per evitare la formazione di schiuma. I tappi di ogni pallone sono dentellati per consentire un efficiente trasferimento della linea di scarichi e per evitare una maggiore pressione dal gas ossigeno.

Figura 3. epatociti non sono contaminati da secondi. La stessa quantità di lisati cellulari purificati da lotti di epatociti (corsia 1) e SECS (corsia 2) sono state separate da 5% SDS-PAGE e cancellati alla nitrocellulosa. Anticorpo monoclonale # 30, che è specifico contro entrambe le isoforme (315 kDa e 190 kDa) di HARE/Stabilin-2 è stato utilizzato per sondare la lisati.

Figura 4. Distribuzione di eparina etichettati di organi. I ratti sono stati iniettati attraverso la vena della coda laterale con ¹²⁵ I-SA-b-epatite attendere 30 minuti e poi dissanguato. Il sangue è stato raccolto in modo da non dare a tutti gli organi artificialmente letture alte. Conteggi al minuto (CPM) di ciascun organo sono stati normalizzati contro il peso degli organi in grammi.

Figura 5. Quantità di eparina etichettato in epatociti e secondi. RPMI supporti contenenti ¹²⁵ I-SA-b-Hep è stato permesso di circolare attraverso un fegato intatto per 20 minuti seguita da digestione collagenasi e purificazione cellulare. La stessa quantità di lisati cellulari delle proteine ​​degli epatociti e SEC sono stati quantificati con il saggio Bradford e contati da un contatore gamma.

Figura 6. Cellule di Kupffer sono separate da SECS per adesione su vetro. Le cellule sono state collocato in una lavata con acido piatto di vetro cristallizzare e ha permesso di aderire per 15 minuti a 37 ° C, 5% di CO _2. Il supernatent non contengono aderito cellule era agitato lentamente e messo in una provetta da centrifuga. Lisati da entrambe le celle aderito su vetro (corsia 1) e da quelli non rispettando le cellule (corsia 2) sono state separate da 8% SDS-PAGE, cancellati, e sondato con un anticorpo contro il CD163, che è specifico per le cellule di Kupffer.

SECS Figura 7. Placcato su fibronectina plastificato 6-bene i piatti durante la notte sono state incubate in RPMI integrato con 0,1% BSA. Immagini a contrasto di fase sono state prese a (A) e 100x (B) ingrandimento 200x.

Discussione

Anestesia del ratto con il metodo goccia in cui isoflurano vapore induce incoscienza è il metodo preferito per i nostri studi. Un vaporizzatore può anche essere usato al posto di una siringa con cotone per mantenere l'animale al di fuori della camera, ma le procedure chirurgiche sono così veloce, non è necessario. Polietilene glicole viene aggiunto al isoflurano per diminuire la pressione del vapore e la velocità di evaporazione. Troppo vapore isoflurano può indurre la morte troppo in fretta. Se l'animale muore prima che il fegato è cannulato e scottati con TBS, coaguli di sangue possono mettere in comune a livello epatico e prevenire lavaggio efficiente delle sinusoidi e la digestione con collagenasi. L'aggiunta di eparina può essere utile come anticoagulante, ma non è utilizzata in questi studi dato che usiamo eparina etichettati come la nostra sonda.

Soluzione salina tamponata di Gey (GBSS) è spesso sostituito da altri laboratori per la purificazione del sec. Mentre è utile per la purificazione SEC, l'epatiteatocytes non tollerano GBSS così come buffer 1-3 e Viabilità non sono così alti. Quando si misura endocitosi, è buona per misurare i livelli di fondo in organo e in purificata epatociti.

Questo metodo è uno dei due per la depurazione efficiente SECS dopo la perfusione del fegato con collagenasi. L'altro metodo separa le cellule non-parenchimali per centrifugazione elutriation ¹⁹ anzichè il gradiente Percoll. I vantaggi per l'utilizzo di elutriation su gradienti di Percoll sono Viabilità cellule leggermente più alta e numeri. Lo svantaggio è che centrifugazione elutriation richiede un rotore specializzato, centrifuga dedicata, e la pompa peristaltica insieme che costa decine di migliaia di dollari. Questo metodo richiede solo l'uso di una centrifuga refrigerata da tavolo e la pompa peristaltica, che è standard in molti laboratori.

Separazione di secondi e KC di adesione selettiva è un metodo standard20-22. Se è vero che SECS aderirà al vetro e plastica, il punto chiave è quello di utilizzare lavata con acido vetro pulito, con non più di 15 minuti di incubazione a 37 ° C al 5% di CO _2. KC sarà sempre più veloce di aderire secondi e si consiglia di lavare delicatamente il KC con i media per estrarre qualsiasi SECS rimanenti che si sono vagamente collegati. Pronasi e altre proteasi sono omessi dai passi della digestione collagenasi in questo protocollo per aumentare Viabilità delle cellule. Proteasi digerire recettori extracellulari e può inibire l'adesione cellulare nelle fasi di purificazione finale.

Il metodo presentato qui ha una grande varietà di applicazioni. Anche se si mostra il risultato finale in cui l'eparina viene inizialmente assunto per la liquidazione, la perfusione del fegato per ottenere epatociti primari, KC, SECS, e CSE può essere utile per una serie di studi che coinvolgono vie metaboliche, immunoregolazione, attività scavenger, e altri Studi fisiologicies. La parte più difficile di questa procedura è incannulazione buona, la digestione del fegato, e la gestione del fegato senza avere la polizza catetere dalla vena porta.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Azienda	Modello / catalogo	Commento
Acqua del bagno 20L	ThermoFisher	2231	L'acqua è circa 45 ° C per compensare il raffreddamento
			all'interno del tubo.
Pompa peristaltica	Cole-Parmer	7553-70	Masterflex serie
Centrifuga refrigerata	Sorvall	Legenda XTR
Catetere	BD Biosciences	381444
Essiccatore camera	Pescatore	08595E	Utilizzare una piastra interna
Percoll	Sigma	P4937
Albumina di siero bovino	SeraCare	AP-4510-01
100 micron mesh	Spettro laboratori	146488
30 micron mesh	Spettro laboratori	146506
RPMI 1640	Invitrogen	21870
Polietilene glicole	Spettro di laboratorios	PO107