В естественных условиях эндоцитоза печени с последующей очисткой клеток печени путем перфузии печени

Резюме

Исследование печени синусоидальных эндотелиальных клеток (СПК) должны быть выполнены с первичными клеток, полученных от животных, как не клеточные линии существуют. Этот метод основан на пищеварение печени и дифференциального центрифугирования в течение SEC очистки для последующего выращивания и экспериментов.

Аннотация

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (˜100 μm) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs ¹ (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver ².

SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface ³. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs ⁴. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs ^5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms ⁷.

With the exception of one report ⁸, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor ⁹ , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration ¹. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium ^10,11.

In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

протокол

1. Иссечение печени (заимствовано из PO Seglen ¹² и Р. Blomhoff ¹³ с изменениями, ^14,15)

1. Добавить 10 мл 30% изофлуран в полиэтиленгликоля в чашке Петри в закрытом 5,5 L камеры. Это оптимальное подождать 10-15 минут после добавления изофлуран создать стабилизировалась среды внутри камеры.
2. Место крыса в герметичную камеру и позволить ей стать наркозом. Полный эффект анестезии очевидным, когда животное становится вялым, отвечать на запросы, и экспонаты глубокого дыхания.
3. Место 2 мл изофлуран в полиэтиленгликоля в некоторых ватные шарики на дне 30 мл шприц трубкой.
4. Место крысу на спине на пеленки покрытый поднос и поместите шприц трубке над мордой.
5. Немедленно подтвердить глубокого наркоза путем смачивания живота с 70% этанола. Не позволяйте животному умереть от передозировки изофлуран.
6. Использование повязки ножницы и щипцы, выставить весь абдominal полости.
7. Найдите поле Порта и с помощью щипцов, нарисуйте две нити хирургические шелковые или полиэфирной нити (лигатуры) под полой Порта непосредственно над брыжеечной отрасли.
8. Снятие щипцов и галстук свободный узел сверху.
9. Использование щипцов под полой Порта и осторожно потянув спину выпрямить вены, иглу с вены катетер Insyte Autoguard (18 Г.А., 1,3 х 300 мм, BD Biosciences) или аналогичные катетер. Катетер должен идти несколько мм за петли, образованной потоком.
10. Уберите и удалить иглу, выпустив пружинным триггер катетер. Кровь должна начать просачиваться вверх в катетер, указывающие правильное размещение вязью.
11. Затянуть узел сверху и закрепите его с другим узлом сверху.
12. Север или нижней полой вены или нисходящей аорты (аорта abdominalis), чтобы позволить крови вытечь из системы кровообращения.
13. Начало промывки печени с кислородомTBS при 37 ° С для удаления крови (шелушение) при скорости потока 20 мл / мин. Печень должна превратиться из красновато-фиолетового цвета на суглинках.
14. Хотя печень приливы, акцизный печени путем убирания желудочно-кишечном тракте и соединительной ткани. Важно, чтобы не терзать печень или прокол капсулы Глиссона в.
15. Место печени на пластиковую сетку над воронкой, что позволяет буферов для сбора и рециркуляции. Буферы в этот момент не должно быть рециркуляции, но поступать в отходы стакан. Промывка не должна длиться более 10 мин. (Рис. 2). Подготовка эндоцитоза решение требует в шаге 2.1.

2. Интернализация ¹²⁵ I-SA-би-Нер (или других приемлемых меченого лиганда)

1. До 50 мл RPMI СМИ в небольшой стакан, добавить к конечной концентрации 0,05% БСА и 0,01 мКи ¹²⁵ I-SA-B-гепатита или другой соответствующей маркировкой лиганд для эндоцитоза.
2. Вложите этот стакан, чтобы apparatuа для обеспечения оксигенации.
3. Выключите насос, переключатель входной трубы, а затем включить насос на 20 мл / мин.
4. Как помечены RPMI подходы печени, выключить насос и дайте лишней жидкости в воронке и труб канализации.
5. Место утечка трубку в стакан, чтобы средства массовой информации рециркуляции меченых средств массовой информации, а затем перезапустить насос.
6. Разрешить жидкости, чтобы распространить через печень не более чем на 1 час.
7. Во время этой интернализации шаг, убедитесь, что температура в печень стабильным, покрывая его и подготовить коллагеназы для пищеварения.

3. Переваривание печени коллагеназы пищеварения

1. Только что растворенный и фильтруется (0,45 мкм), коллагеназы (100 мг / кг веса крысы) должны быть добавлены в буфер 2 в общем объеме не превышает 60 мл при температуре 37 ° C. Объем зависит от длины / внутренний объем трубки и должны быть соответствующим образом скорректированы.
2. Остановить насос и обменвпускной трубы из стакана СМИ TBS.
3. Флеш печени в течение 2 мин при 50 мл / мин, который позволяет для рыхления desmosomal переходы ячейки, которые являются кальций зависимыми.
4. Хотя печень приливы, обмен стакан сред с стакан, содержащий коллагеназы на аппарат.
5. Сразу же после промывки, начните с пищеварением коллагеназы в кровеносной петля на скорости потока 20 мл / мин до 15 мин. Так как коллагеназа партий различаются в зависимости от номера партии, изменения в количестве и времени пищеварения должны быть оптимизированы для каждого нового много коллагеназы. Коллагеназа также кальций зависимыми. Выключите насос и переключатель буфера и газопроводов из колбы в колбу В. Передача канализационная линия от контейнер для отходов на колбу B (рис. 2В).
6. Остановить насос, удалить катетер и передачи печени блюдо с 20-30 мл буфера 1.
7. Пил назад Глиссона в капсуле печени и встряхнуть ячейкиа в жидкость.
8. Как жидкость становится непрозрачным с клеточного материала, передача клеток через 100 мкм сетки с последующей фильтрацией через сетку 30 мкм, а затем в 50 мл коническую на льду.
9. Добавить еще один буфер для печени и сотрясают клетки печени матрицы, передавая жидкости сетчатые фильтры и конические.
10. Повторите шаги с 3,7 до 3,9, пока больше клетки могут быть смещены с разумной сотрясение печени.

4. Гепатоцитов и SEC очистки

1. Центрифуга 50 мл conicals содержащие клетки при 150 мкг в течение 3 мин. для осаждения гепатоцитов.
2. Передача жидкая фракция, содержащими не паренхиматозные клетки на свежий 50 мл conicals на льду.
3. Вымойте гепатоцитов быть ресуспендирования гранул в буфере 3 и повторяя шаги 4.1 и 4.2 еще три раза.
4. В конце моет, гранулы ≥ 97% чистой гепатоцитов. Для получения СПК, центрифуги все трубы сontaining объединенный супернатант (содержащие ГСК, СПК, и крон и несколько небольших гепатоцитов) при 200 мкг в течение 10 мин. при 4 ° C.
5. Аспирируйте буфера и ресуспендирования все гранулы в 5 мл RPMI / BSA при 4 ° C.
6. Бассейн клетки вместе в 2 пробирки и добавить RPMI / БСА до объема 35 мл.
7. Центрифуга conicals при 100 мкг в течение 3 мин.
8. Сбор первых 25 мл жидкости и передачи чистых 50 мл коническую.
9. Ресуспендируют гранул в оставшиеся 10 мл средства массовой информации и добавить обратно 25 мл холодной RPMI / BSA и центрифуги при 100 мкг в течение 3 мин.
10. Повторите шаги 3,8 и 3,9 раза больше, отбросить осадок клеток и ниже 10 мл средства массовой информации.
11. Центрифуга supernatents для осаждения СПК, KCS и ГСК при 200 мкг в течение 10 мин. при 4 ° C.
12. Подготовка три 50 мл пробирки, содержащие 20 мл 25% Перколла в ФСБ на льду. Подложка с 15 мл 50% Перколла в каждую пробирку.
13. Ресуспендируют клеточный окатышей в общем объеме 30 мл RPMI / BSA.
14. Тщательно наложения EACч градиент с 10 мл клеток и центрифуги при 900 мкг в течение 20 мин при 4 ° C.
15. СПК и KCS имеют очень близкие плавучей плотности и находятся на интерфейсе 25/50%. ГСК, как правило, на 25% / раздела сред из-за их более высокой плавучестью, как липидный хранения клеток. Любые оставшиеся гепатоциты и клетки крови имеют более низкий buoyancies и гранулированный. Аспирируйте сверху вниз рядом 25/50 интерфейс% и выбросить данный материал.
16. Сбор клеток в интерфейсе 25/50% и трансфер в свежем конические с холодной RPMI. Окончательный объем должен быть ~ 40 мл для разбавления из Перколла.
17. Центрифуга коническая на 350 мкг в течение 10 мин при 4 ° С для осаждения клеток.
18. Ресуспендируют клеток в ~ 10 мл подогретого RPMI, содержащий 100 ЕД / мл Penicillin/100 г / мл стрептомицина и поместить клетки в кислотно-мыть стеклянном блюде Петри или кристаллизатор.
19. Инкубируйте клетки в течение 15 мин. при 37 ° С в культуре ткани инкубатора.
20. Рок или вращать пластину немногоа затем собирать СПК в супернатант. KCS придерживаться стекла гораздо быстрее, чем СПК. Кроме того, СПК могут быть отделены от крон на immunopurification с использованием анти-CD31 или anti-Stabilin2/HARE антител, конъюгированных с магнитных шариков.
21. Жизнеспособность и сотовые номера могут быть оценены трипанового синего исключение использования hemacytometer или с использованием автоматизированных счетчик клеток.
22. Культура СПК на фибронектин покрытые пластиковой посуды при температуре 37 ° C, 5% СО _2, RPMI/0.25% BSA с 40 нг / мл VEGF, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина или с гепатоцитов кондиционированной среде.
23. Гепатоцитов, крон, и СПК могут оценить для интернализации маркированного материала с помощью гамма-счетчика и нормализации для общего клеточного белка или с помощью микроскопа (если флуоресцентно меченных) с помощью этих методов культивирования.

5. Представитель результаты:

Гепатоцитов очистки ≥ 97% и SEC очистки typicсоюзника ≥ 95% при использовании этого метода. Иссечение брюшной полости, катетеризации из воротной вены, и побледнение печени все должно происходить в течение одной минуты для достижения наилучших результатов. HARE/Stabilin-2 является специфическим рецептором на печень СПК и не выражено в другие типы клеток печени. В этом примере клеточных лизатов обоих гепатоцитов и СПК были разделены на 5% SDS-PAGE и исследовали с моноклональных антител против обеих изоформ Stabilin-2 (рис. 3).

Нефракционированный гепарин вводят в кровь очищается в печени ^16. Оформление в первую очередь выполняет печень СПК, в отличие от гепатоцитов и крон ^17. Stabilin-2/HARE рецепторов является главным рецептором зазор, который связывает и усваивает гепарина в СПК ^18. В нашем примере, мы обозначили гепарина с биотином метки на карбоксилат группа GlcNAc / NS. Биотин было сопряжено с йодированной стрептавидин для обнаружения внутренним гепарин протeoglycan. Введение меченых гепарина следует обескровливание 30 минут после инъекции позволяет нам отслеживать, какие органы усвоить эту форму гепарина. В этот короткий промежуток времени, печень является основным органом просвет (рис. 4).

Чтобы более четко понять, какой тип клеток несет ответственность за оформление, мы добавили ¹²⁵ I-SA-би-Hep для RPMI среде с 0,05% БСА и позволили ей распространить через печень на 20 мин. После расщепления коллагеназы и клеточной очистки, подавляющее большинство меченых гепарина усвоены СПК, в отличие от гепатоцитов (рис. 5).

Рисунок 1. Базовая архитектура печени. СПК форме стен синусоиды и, как правило, перфорированную (небольшие скопления кружки). Звездчатых клеток (ГСК) находятся в пространстве Диссе в отличие от Купфера слоктя (крон), которые обычно присутствуют в микроциркуляторном русле синусоиды. Гепатоцитов занимать другую сторону космического Диссе.

Рисунок 2. Схема перфузии аппарата. ) Настройка аппарата во время промывки / мытья синусоидов печени. TBS находится в 1-литровую колбу. В) 125 мл колбу, содержащую ~ 60 мл буфера 2 с коллагеназы используется для переваривания печени в замкнутой цепи. Канализационная линия также изменен с отходами контейнера в колбу В через выемку сокращение резиновой пробкой. Кислорода линия не погружен в буфер, содержащий коллагеназы (фляга B), чтобы избежать пенообразования. Пробки на каждой колбы зубчатый чтобы позволить эффективную передачу стоков линии и, чтобы предотвратить повышение давления от газообразного кислорода.

Рисунок 3. гепатоцитов препараты не загрязненных СПК. Равные количества клеточных лизатов из очищенного партий гепатоцитов (дорожка 1) и СПК (дорожка 2) были разделены на 5% SDS-PAGE и смыл с нитроцеллюлозы. Моноклональные антитела, № 30, которая специфична против обоих изоформ (315 кДа и 190 кДа) из HARE/Stabilin-2 был использован для исследования лизатов.

Рисунок 4. Распределение меченых гепарин в органах. Крысам вводили через боковой вены хвоста с ¹²⁵ I-SA-би-ГПУ-подождите 30 минут, а затем обескровлены. Кровь была собрана таким образом, чтобы не давать какие-либо органов искусственно завышенные показания. Графы в минуту (CPM) каждого органа были нормализованы от веса органа в граммах.

Рисунок 5. Сумма меченых гепарина в гепатоциты и СПК. RPMЯ средах, содержащих ¹²⁵ I-SA-би-Hep было позволено циркулировать по интактной печени в течение 20 мин, а затем путем расщепления коллагеназы и клеточной очистки. Равные количества гепатоцитов и SEC лизатов клеточных белков были количественно с Пробирной Брэдфорд и рассчитывал на гамма-счетчика.

Рисунок 6. Купфера клетки отделены от СПК по адгезия к стеклу. Клетки были помещены в кислотно-мыть стекла кристаллизатор и позволило придерживаться в течение 15 мин при 37 ° C, 5% СО _2. Supernatent содержащих не придерживался клеток мягко кружились и помещен в центрифугу трубки. Лизаты с обеих придерживался клеток на стекле (дорожка 1) и от не придерживался клетки (дорожка 2) были разделены на 8% SDS-PAGE, уничтожены, и исследовали с антителами против CD163, которая специфична для Купфера клетки.

Рисунок 7. СПК высевали на пластиковые фибронектина покрытием 6-а блюда инкубировали в течение ночи в RPMI дополнена 0,1% BSA. Фазового контраста изображения были сделаны в (A) 100x и (В) 200x увеличением.

Обсуждение

Анестезия крыс по висячей капли метод, в котором изофлуран паров вызывает бессознательное является предпочтительным методом для наших исследований. Испаритель может также быть использован вместо шприца с хлопком для поддержания животных вне камеры, но хирургические процедуры настолько быстро, это не требуется. Полиэтиленгликоль добавляется в изофлуран для уменьшения давления пара и скорости испарения. Слишком много изофлуран пара будет вызывать смерть слишком быстро. Если животное умирает, прежде чем печень канюлированные и бланшированные с TBS, объединение сгусток крови может в печени и не допустить эффективной промывки синусоиды и пищеварения с коллагеназы. Кроме того гепарина может быть полезна в качестве антикоагулянта, но не используется в этих исследованиях, так как мы используем меченый гепарин в качестве нашего зонда.

Буферном растворе решение Гей (в GBSS) часто заменяются другими лабораториями для очистки СПК. Хотя это полезно для SEC очистки, ГПУatocytes не терпят GBSS а также буферы 1-3 и viabilities далеко не так высока. При измерении эндоцитоз, это хорошая практика для измерения фоновых уровней в органе и в очищенной гепатоцитов.

Этот метод является одним из двух для эффективной очистки СПК следующие печени перфузии с коллагеназы. Другой метод отделяет без паренхиматозных клеток отмучивания центрифугирования ¹⁹ вместо Перколла градиента. Преимущества использования отмучивания более градиенты Перколла несколько выше, клетка viabilities и цифры. Недостатком является то, что отмучивания центрифугирования требует специализированных ротора, посвященный центрифугу, и перистальтического насоса вместе, которая стоит десятки тысяч долларов. Этот метод требует только использование охлажденного центрифуги столешницы и перистальтического насоса, который является стандартным во многих лабораториях.

Разделение СПК и KCS селективной адгезии является стандартным методом20-22. Хотя это правда, что СПК будет придерживаться стекла и пластика, ключевой момент заключается в использовании кислотно-отмытый стекло с не более чем на 15 минут инкубации при температуре 37 ° С на 5% CO _2. KCS всегда будет придерживаться быстрее, чем СПК, и желательно, чтобы аккуратно мыть крон со средствами массовой информации для извлечения оставшихся СПК, которые стали свободно прилагается. Проназы и других протеаз, также исключены из коллагеназы пищеварения шаги в этом протоколе увеличить viabilities клеток. Протеазы переварить внеклеточной рецепторов и может препятствовать клеточной адгезии в окончательной стадии очистки.

Метод, представленный здесь, имеет широкий спектр применения. Хотя мы и показать конечный результат, в которой гепарин изначально принято к оформлению, перфузии печени для получения первичных гепатоцитах, KC, СПК, и гемопоэтические стволовые клетки могут быть полезны для ряда исследований с участием метаболических путей, иммунорегуляции, мусорщик деятельности, а также других физиологические Studiх годов. Самой трудной частью этой процедуры является хорошим катетеризации, пищеварение печени, и обработка печени без катетера скольжения от воротной вены.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Компания	Модель / Каталог #	Комментарий
20L водяной бане	ThermoFisher	2231	Вода составляет около 45 ° C для компенсации охлаждения
			внутри трубы.
Перистальтический насос	Коул-Parmer	7553-70	Masterflex серии
Центрифуга с охлаждением	Sorvall	Легенда XTR
Катетер	BD Biosciences	381444
Эксикатор камеры	Рыболов	08595E	Используйте внутренние пластины
Перколла	Сигма	P4937
Бычьего сывороточного альбумина	SeraCare	AP-4510-01
100 мкм сетки	Спектр лаборатории	146488
30 мкм сетки	Спектр лаборатории	146506
RPMI 1640	Invitrogen	21870
Полиэтиленгликоль	Спектр лабораторииы	PO107