La endocitosis en vivo de hígado seguido por la purificación de las células hepáticas de la perfusión del hígado

Resumen

El estudio del hígado de las células endoteliales sinusoidales (segundos) se debe realizar con las células primarias procedentes de los animales que no existen líneas celulares. Este método se basa en la digestión del hígado y centrifugación diferencial para la purificación de la SEC para el cultivo posterior y experimentar.

Resumen

El hígado es el centro metabólico del cuerpo de los mamíferos y sirve como un filtro para la sangre. La arquitectura básica del hígado se ilustra en la figura 1 en la que se compone más del 85% de la masa hepática de los hepatocitos y el restante 15% de la masa celular se compone de células de Kupffer (KC), las células estrelladas (HSC), y las células endoteliales sinusoidales (segundos). SECS forman las paredes de los vasos sanguíneos en el hígado y contener la morfología especializadas llamadas fenestras en el citoplasma. Fenestración del citoplasma es la aparición de agujeros (~ 100 m) dentro de las células para que el acto SECS como un tamiz en el que la mayoría de los quilomicrones, remanentes de quilomicrones y macromoléculas, pero no células, pasan a través de los hepatocitos y HSC ¹ (Fig. 1). Debido a la falta de una membrana basal, la brecha entre la SECS y hepatocitos forman el espacio de Disse. HSCs ocupar este espacio y desempeñar un papel destacado en la regulación y la respuesta a la injury, almacenamiento de ácido retinoico y la inmunorregulación de las ² de hígado.

SECS se encuentran entre las células más activas endocytically del cuerpo mostrando una gran variedad de receptores scavenger en sus ^tres la superficie celular. Estos incluyen SR-A, 1-Stabilin y Stabilin-2. En general, las pequeñas partículas coloidales menos de 230 nm y macromoléculas en la fase de amortiguación son tomados por SECS, mientras que las partículas grandes y los restos celulares proceso de endocitosis (fagocitosis) por KC ^4. Por lo tanto, la eliminación masiva de materiales extracelulares, tales como los glicosaminoglicanos de la sangre depende en gran medida la salud y las funciones endocítica de las § ^5,6. Por ejemplo, un aumento en los niveles en sangre de ácido hialurónico es un indicativo de la enfermedad hepática de leve a formas más graves ^7.

Con la excepción de un informe ^8, no hay inmortalizado líneas celulares SEC en existencia. Incluso esta línea celular inmortalizada es de-diferenciaciónated en que no expresan receptores scavenger que están presentes en SECS primaria (nuestros datos, no se muestra). Todos los estudios de biología celular se debe realizar en las células primarias recién obtenido del animal. Desafortunadamente, la SECS desdiferencian en condiciones estándar de cultivo y debe usarse dentro de 1 o 2 días después de aislamiento de los animales. La diferenciación de SECS está marcada por la expresión de Stabilin-2 o receptor HACE ^9, CD31, y la presencia de fenestración citoplasma ^1. La diferenciación de SECS se puede ampliar mediante la adición de VEGF en medios de cultivo o por el cultivo de células en un medio condicionado de hepatocitos ^10,11.

En este informe, vamos a demostrar la actividad endocítica de segundos en el órgano intacto con radio-marcado con heparina de ácido hialurónico para la SEC específicos Stabilin-2 receptor. A continuación, se purifican los hepatocitos y segundos desde el hígado perfundido para medir la endocitosis.

Protocolo

1. Extirpación del hígado (adoptado de PO Seglen ¹² y R. Blomhoff ¹³ con modificaciones ^14,15)

1. Añadir 10 ml de 30% de isoflurano en polietilenglicol a una placa de Petri en una cámara de 5,5 L cerrada. Lo mejor es esperar 10-15 minutos después de la adición de isoflurano para crear un ambiente estabilizado dentro de la cámara.
2. Lugar a una rata en la cámara sellada y permitir que se convierta anestesiados. Pleno efecto de la anestesia son evidentes cuando el animal se queda sin fuerzas, que no responde, y presenta una respiración profunda.
3. Coloque 2 mL de isoflurano en polietilenglicol en unas bolas de algodón en la parte inferior de un tubo de la jeringa de 30 ml.
4. Coloque el ratón sobre su espalda en una bandeja cubierta de pañal y se coloca el tubo de la jeringa sobre el hocico.
5. Inmediatamente confirmar anestesia profunda mojando el abdomen con un 70% de etanol. No deje que el animal muere por sobredosis de isoflurano.
6. El uso de tijeras y pinzas venda, exponga toda la abdcavidad NOMINAL.
7. Localizar la vena porta y, con las pinzas, sacar dos hilos de seda o hilo de poliéster quirúrgica (ligadura) por debajo de la vena porta inmediatamente encima de la rama mesentérica.
8. Retirar las pinzas y corbata un nudo suelto.
9. El uso de pinzas por debajo de la vena porta y tirando suavemente de vuelta a enderezar la vena, canular la vena con un catéter AutoGuard Insyte (18 GA, 1.3 x 300 mm, BD Biosciences), catéter o similar. El catéter debe ir más allá de varios mm el bucle formado por el hilo.
10. Retractarse y retirar la aguja se suelta el gatillo con resorte en el catéter. Sangre deberá empezar a filtrarse a través del catéter que indica la colocación correcta de ligadura.
11. Apretar el nudo simple y segura con otro nudo.
12. Sever o la vena cava inferior o la aorta descendente (aorta abdominalis) para permitir que la sangre fluya en el sistema circulatorio.
13. Comience a enjuagar el hígado con oxigenadaTBS a 37 ° C para eliminar la sangre (blanqueo), con un caudal de 20 mL / min. El hígado se convierta de un color púrpura rojizo a un color arcilla.
14. Mientras que el hígado está descargando, extirpar el hígado a través de cortar el tubo digestivo y el tejido conectivo. Es importante no lacerar el hígado o el pinchazo de la cápsula de Glisson.
15. Lugar en el hígado en una red de plástico sobre un embudo que permite a los topes que se recojan y recircula. Buffers en este punto no debe ser recirculado, pero el flujo en el vaso de residuos. Lavado no debe durar más de 10 min. (Fig. 2A). Prepare la solución requiere endocitosis en 2,1 paso.

2. La internalización de ¹²⁵ I-SA-b-Hep (u otro ligando adecuado etiquetado)

1. A 50 ml medio RPMI en un vaso pequeño, se suman a una concentración final de BSA al 0,05% y 0,01 mCi ¹²⁵ I-SA-b-Hep o ligando otros debidamente etiquetados para la endocitosis.
2. Adjunte este vaso a la Apparatus para permitir la oxigenación.
3. Apague la bomba, cambiar la tubería de entrada, y luego pasar a la bomba a 20 ml / min.
4. Como el RPMI etiquetado se aproxima a la del hígado, apague la bomba y permita que el exceso de líquido en el embudo y drenar la tubería.
5. Coloque el tubo de drenaje en el vaso de los medios de comunicación que permita la recirculación de los medios de comunicación la etiqueta y luego reiniciar la bomba.
6. Permitir que los líquidos para recircular a través del hígado por no más de 1 hora.
7. Durante esta etapa, la internalización, asegúrese que la temperatura en el hígado es estable por lo cubre y preparar la colagenasa para la digestión.

3. La digestión del hígado por la digestión con colagenasa

1. Recién disuelto y se filtra (0,45 m) colagenasa (100 mg / kg de peso del animal) debe ser añadido al buffer 2 en un volumen total que no exceda de 60 ml a 37 ° C. El volumen depende de la longitud / volumen interno de la tubería y debe ajustarse en consecuencia.
2. Parar la bomba y el intercambioTubo de entrada del vaso medios de comunicación a la TBS.
3. Lavar el hígado durante 2 min a 50 ml / min que permite el aflojamiento de la unión entre las células que se desmosómicas dependiente de calcio.
4. Mientras que el hígado es el lavado, cambio de la copa de los medios de comunicación con el frasco que contiene colagenasa en el aparato.
5. Inmediatamente después del lavado, comienza la digestión con colagenasa en un bucle de circulación a una velocidad de flujo de 20 mL / min durante 15 min. Desde lotes colagenasa varían según el número de lote, las variaciones en la cantidad y el tiempo de la digestión deben ser optimizados para cada nuevo lote de colagenasa. La colagenasa es también dependiente de calcio. Apague la bomba y el interruptor de la memoria intermedia y las líneas de gas de A a B. Frasco Frasco de transferencia de la línea de efluentes del contenedor de desechos de frasco B (Fig. 2B).
6. Parar la bomba, retirar el catéter y la transferencia del hígado a un plato que contiene 20 a 30 ml de tampón 1.
7. Pele la cápsula de Glisson del hígado y del movimiento de la células en el líquido.
8. A medida que el líquido se vuelve opaco con material celular, transferir las células a través de una malla de 100 micras seguido de una filtración a través de una malla de 30 micras y luego en un Erlenmeyer de 50 ml en hielo.
9. Añadir más Tampón 1 en el hígado y continuar agitando las células de la matriz del hígado, la transferencia de los líquidos a los filtros de malla y cónicos.
10. Repita los pasos 3,7 hasta 3,9 hasta que no haya más células pueden desprenderse con agitación razonable del hígado.

4. Hepatocitos y purificación de la SEC

1. Centrífuga de 50 ml que contiene conicals células a 150 g durante 3 min. para que sedimenten los hepatocitos.
2. Transferencia de la fracción de líquido que contiene células no parenquimatosas a un nuevo 50 conicals ml en hielo.
3. Lavar los hepatocitos se resuspender el pellet en tampón 3 y repitiendo los pasos 4.1 y 4.2 veces más de tres.
4. Al final de los lavados, los pellets son ≥ 97% pura hepatocitos. Para obtener la SECS, centrífuga de todos los tubos de containing agrupados sobrenadante (que contiene HSCs, SECS, y KCS y algunos hepatocitos pequeños) a 200 g durante 10 min. a 4 ° C.
5. Aspirar el buffer y resuspender todas las bolas en 5 ml de RPMI / BSA a 4 ° C.
6. Piscina de las células, junto a dos tubos y añadir RPMI / BSA, hasta un volumen de 35 ml.
7. Se centrifuga la conicals a 100 g durante 3 min.
8. Recoge los 25 ml de líquido y la transferencia a un lugar limpio cónico de 50 ml.
9. Resuspender el precipitado en los medios de comunicación ml restantes 10 y volver a agregar 25 ml de RPMI frío / BSA y centrifugar a 100 g durante 3 min.
10. Repita los pasos 3.8 y 3.9, una vez más, desechar el sedimento celular y los medios de comunicación inferior a 10 ml.
11. Se centrifuga la supernatents de pellet SECS, KC, y HSCs a 200 g durante 10 min. a 4 ° C.
12. Prepare tres tubos de 50 ml que contiene 20 ml de Percoll al 25% en PBS en hielo. Subcapa con 15 ml de Percoll al 50% en cada tubo.
13. Resuspender los pellets de células en un volumen total de 30 ml de RPMI / BSA.
14. Cuidadosamente superposición each gradiente con 10 ml de células y se centrifuga a 900 g durante 20 min a 4 ° C.
15. SECS y KCS tiene muy cerca de la densidad de flotación y se encuentran en la interfaz de un 25/50%. HSCs son típicamente menos del 25% / interfaz de medios debido a su flotabilidad mayor medida que las células lípidos de almacenamiento. Cualquier resto de los hepatocitos y las células sanguíneas tienen la buoyancies inferior y se precipitan. Aspirar de arriba hacia abajo cerca de la interfaz de un 25/50% y desechar este material.
16. Recoger las células de la interfaz de un 25/50% y la transferencia a un nuevo cono de frío RPMI. El volumen final debe ser ~ 40 ml para diluir el Percoll.
17. Se centrifuga la cónica a 350 g durante 10 min a 4 ° C para que sedimenten las células.
18. Resuspender las células en el ~ 10 ml previamente calentada RPMI que contiene 100 U / mL Penicillin/100 g / ml estreptomicina células y colocar en un lavado con ácido de cristal placa de Petri o Cristalizador.
19. Se incuban las células durante 15 minutos. a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos.
20. Roca o agitar la placa un pocoy luego recoger los segundos en el sobrenadante. El KC se adhieren al cristal mucho más rápidamente que la SECS. Por otra parte, SECS puede ser separado de KC por inmunopurificación el uso de anticuerpos anti-CD31 o anti-Stabilin2/HARE conjugada con partículas magnéticas.
21. Números de la viabilidad celular y puede ser evaluada por exclusión del azul tripano usando un hemocitómetro o con el uso de un contador celular automático.
22. La cultura de la SECS en fibronectina recubiertos platos de plástico a 37 ° C, 5% de CO _2, RPMI/0.25% BSA con 40 ng / mL de VEGF, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina o con medio condicionado de hepatocitos.
23. Hepatocitos, KC, y SECS puede evaluar para la internalización de material marcado por el uso de un contador gamma y la normalización de la proteína celular total o por microscopía (si la etiqueta fluorescente) utilizando estos métodos de cultivo.

5. Los resultados representativos:

Purificación de hepatocitos es ≥ 97% y purificación SEC es Typicaliado de ≥ 95% con este método. La escisión de la cavidad abdominal, la canalización de la vena porta y palidez del hígado todos debe ocurrir dentro de un minuto para obtener mejores resultados. HARE/Stabilin-2 es un receptor específico en la SECS hígado y no se expresa en otros tipos de células del hígado. En esta muestra, lisados ​​celulares de ambos hepatocitos y SECS fueron separados en un 5% SDS-PAGE y probaron con un anticuerpo monoclonal contra las dos isoformas de Stabilin-2 (Fig. 3).

La heparina no fraccionada se inyecta en el torrente sanguíneo se elimina por el hígado ^16. El aclaramiento se realiza principalmente por la SECS hígado a diferencia de los hepatocitos y KC ^17. El receptor Stabilin-2/HARE es el receptor principal de depuración que se une a la heparina e internaliza en las secciones ^18. En nuestro ejemplo, hemos denominado heparina con una etiqueta de biotina en el grupo carboxilato de GlcNAc / NS. La biotina se conjugó con estreptavidina yodado para la detección de prot heparina internalizadoeoglycan. La inyección de la heparina etiqueta seguido por exanguinación 30 minutos después de la inyección nos permite controlar que los órganos interiorizar esta forma de heparina. En este corto intervalo de tiempo, el hígado es el órgano tolerancia primaria (Fig. 4).

Para entender más claramente qué tipo de célula es responsable del despacho, hemos añadido ¹²⁵ I-SA-b-Hep a los medios de comunicación RPMI suplementado con BSA al 0,05% y se deja que circule a través del hígado durante 20 minutos. Después de la digestión de colagenasa y la purificación celular, la gran mayoría de heparina marcada es internalizado por segundos en contraste con los hepatocitos (Fig. 5).

Figura 1. Arquitectura básica del hígado. SECS forman las paredes de los sinusoides y normalmente son fenestrados (pequeños grupos de círculos). Las células estrelladas (HSC) se encuentran en el espacio de Disse, en contraste con Kupffer canas (KCS), que normalmente están presentes en la microvasculatura de los sinusoides. Hepatocitos ocupan el otro lado del espacio de Disse.

Figura 2. Esquema del aparato de perfusión. A) Puesta en marcha del aparato durante el lavado / lavado de los sinusoides del hígado. TBS es en un frasco de 1 litro. B) Un frasco de 125 ml que contenga aproximadamente 60 ml de tampón 2 con colagenasa se utiliza para la digestión del hígado en un circuito cerrado. La línea de aguas residuales también se puede cambiar el contenedor de residuos para el frasco B a través de una muesca en el tapón de goma. La línea de oxígeno no se sumerge en el tampón que contiene colagenasa (frasco B) para evitar la formación de espuma. Los tapones en cada frasco se hacen muescas para permitir una transferencia eficiente de la línea de efluentes y para evitar aumento de la presión del gas de oxígeno.

Figura 3. hepatocitos no están contaminados con SECS. Igual cantidad de lisados ​​celulares de los lotes purificados de los hepatocitos (carril 1) y segundos (carril 2), fueron separados en un 5% SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. Anticuerpo monoclonal # 30, que es específica contra las dos isoformas (315 kDa y 190) de HARE/Stabilin-2 fue utilizado para investigar los lisados.

Figura 4. Distribución de la heparina en los órganos de la etiqueta. Las ratas fueron inyectadas a través de la vena lateral de la cola con ¹²⁵ I-SA-b-hep esperar 30 minutos y se desangraron entonces. La sangre fue recolectada a fin de no dar a alguno de los órganos artificialmente altas lecturas. Cuentas por minuto (CPM) de cada órgano se normalizaron en contra el peso de los órganos en gramos.

Figura 5. Cantidad de heparina etiquetados en los hepatocitos y SECS. RPMYo los medios de comunicación que contiene ¹²⁵ I-SA-b-Hep se permite la circulación a través de un hígado intacto durante 20 minutos seguido por la digestión de colagenasa y la purificación celular. Igual cantidad de lisados ​​de los hepatocitos y SEC proteína celular se cuantificó con el ensayo de Bradford y contados por un contador gamma.

Figura 6. Las células de Kupffer son separados de SECS por adhesión sobre el vidrio. Las células se colocan en un recipiente de vidrio lavado con ácido y la cristalización permite que se adhieran durante 15 min a 37 ° C, 5% de CO _2. El sobrenadante que contiene las células no adheridas fue agitado vigorosamente y se coloca en un tubo de centrífuga. Lisados ​​de células adheridas, tanto en el vidrio (carril 1) y de células no adheridas (carril 2), fueron separados en un 8% SDS-PAGE, se transfirieron, y probaron con un anticuerpo contra el CD163 que es específica para las células de Kupffer.

SECS la figura 7. Chapada en fibronectina recubiertos de plástico de 6 pocillos se incubaron durante la noche en medio RPMI suplementado con 0,1% de BSA. Imágenes de contraste de fase se tomaron en (A) 100x y (B) aumento de 200x.

Discusión

La anestesia de la rata, por el método de la gota colgante en el que el isoflurano produce vapor de inconsciencia es el método preferido para nuestros estudios. Un vaporizador también puede utilizarse en lugar de una jeringa con un algodón para mantener los animales fuera de la cámara, pero los procedimientos quirúrgicos son tan rápidos, que no es necesario. Glicol de polietileno se añade a la isoflurano para disminuir la presión de vapor y velocidad de evaporación. El exceso de vapor de isoflurano se induce la muerte muy rápidamente. Si el animal muere antes que el hígado es canulado y se blanquean con TBS, la acumulación de sangre puede coagularse en el hígado y prevenir el lavado eficiente de los sinusoides y la digestión con colagenasa. La adición de heparina puede ser útil como un anticoagulante, pero no es utilizada en estos estudios ya que el uso de heparina etiquetados como nuestra sonda.

Solución salina tamponada de Gey (GBSS) es a menudo sustituida por otros laboratorios para la purificación de la SECS. Si bien es útil para la purificación de la SEC, la hepatitisatocytes no toleran GBSS, así como amortiguadores de 1-3 y viabilidades que no son tan altos. Cuando se mide la endocitosis, es una buena práctica para medir los niveles de fondo en el órgano y en los hepatocitos purificada.

Este método es uno de los dos para la purificación eficiente de la SECS después de la perfusión del hígado con colagenasa. El otro método que separa las células no parenquimatosas por centrifugación elutriación ^{19 en} lugar de gradiente de Percoll. Las ventajas para el uso de decantación en gradientes de Percoll son ligeramente mayores viabilidades celulares y números. La desventaja es que requiere de una decantación centrifugación rotor especializados, dedicados centrífuga y bomba peristáltica juntos que cuesta decenas de miles de dólares. Este método sólo requiere el uso de una centrífuga de mesa refrigerada y una bomba peristáltica que es estándar en muchos laboratorios.

La separación de SECS y KCS de adhesión selectiva es un método estándar20-22. Si bien es cierto que la SECS se adhiere al vidrio y el plástico, el punto clave es el uso de lavado con ácido de vidrio limpio con no más de una incubación de 15 minutos a 37 ° C en 5% CO _2. KC siempre se adherirá más rápido que SECS y es recomendable lavar el KC con los medios para extraer cualquier resto de SECS que se han convertido en poco adheridas. Pronasa y otras proteasas también se omiten los pasos de la digestión de colagenasa en este protocolo para incrementar las viabilidades de las células. Proteasas digieren receptores extracelulares y puede inhibir la adhesión celular en las etapas de purificación final.

El método que aquí se presenta tiene una amplia variedad de aplicaciones. A pesar de que muestran el resultado final en el que la heparina es un principio asumido para el despacho, la perfusión del hígado para la obtención de hepatocitos primarios, KC, SECS, y HSC puede ser útil para una serie de estudios que involucra diferentes vías metabólicas, inmunorregulación, las actividades del tesoro, y otros fisiológicos studies. La parte más difícil de este procedimiento es la canalización buena digestión del hígado, y la manipulación del hígado sin tener el recibo de catéter de la vena porta.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre	Empresa	Modelo / Catálogo #	Comentario
Baño de agua de 20 litros	ThermoFisher	2231	El agua es de aproximadamente 45 ° C para compensar la refrigeración
			dentro del tubo.
Bomba peristáltica	Cole-Parmer	7553-70	Masterflex serie
Centrífuga refrigerada	Sorvall	Leyenda XTR
Catéter	BD Biosciences	381444
Desecador cámara	Pescador	08595E	Use la placa interna
Percoll	Sigma	P4937
Albúmina de suero bovino	SeraCare	AP-4510 a 01
100 micras de malla	Espectro de los laboratorios	146488
30 micras de malla	Espectro de los laboratorios	146506
RPMI 1640	Invitrogen	21870
Polietilenglicol	Espectro de laboratorios	PO107