간 재관류에 의한 간 세포의 정화를 얹는 생체내 간 Endocytosis에서

요약

간 sinusoidal 내피 세포 (초)의 연구는 더 셀 라인이 존재하지 않는 등 동물에서 얻은 기본 세포로 수행되어야합니다. 이 방법은 이후 culturing 및 실험에 대한 SEC의 정화를 위해 간 소화 및 차등 원심 분리에 의존하고 있습니다.

초록

간은 포유류의 신체의 대사 중심이며, 혈액에 대한 필터 역할을합니다. 간장의 기본 아키텍처 간 질량 이상 85%가 hepatocytes로 구성되어 있으며, 세포 대량의 나머지 15%가 Kupffer 세포 (KCs), 별 모양의 세포 (HSCs)으로 구성되어있는 그림 1에서 그림, 그리고 sinusoidal 내피 세포 (초). 초 간 내의 혈관 벽을 형성하고 세포질 내에 fenestrae라는 전문 형태가 포함되어 있습니다. 세포질의 Fenestration은 초 행동 체로 가장 chylomicrons, chylomicron 잔해가 흩어져 및 macromolecules 아니지만 세포가, hepatocytes 및 HSCs ¹ (그림으로 통과하는 있도록 세포 내의 구멍의 모양 (~ 100 μm의)입니다 1). 지하 막의 부족으로 인해, 초 및 hepatocytes 사이의 간격이 Disse의 공간을 형성합니다. HSCs이 공간을 점유하고 규제와 나는에 대한 응답으로 두드러진 역할을njury, retinoic 산성과 간 ² immunoregulation의 저장 용량을 확장합니다.

초 자신의 세포 표면 ³ 스캐빈저 수용체의 배열을 표시하는 신체의 가장 endocytically 활성 세포들이다. 이들은 SR - A, Stabilin - 1 Stabilin - 2를 포함합니다. 큰 입자와 세포 부스러기가 KCs ^4로 (phagocytosed) endocytosed이며, 반면에 일반적으로, 버퍼 단계에서 작은 콜로이드 입자 이하 230 NM과 macromolecules은 초에 의해 촬영되었습니다. 따라서, 이러한 혈액의 glycosaminoglycans 등 세포외 물질의 대량 통관이 건강과 초 ^5,6의 endocytic 기능에 크게 의존하고있다. 예를 들어, 혈액 hyaluronan 수준의 증가는 온화에서 더 심한 형태의 ^7에 이르기까지 간질환을 나타내는 것입니다.

하나의 리포트 ^8을 제외하고, 존재에 불후의 SEC 셀 라인은 없습니다. 심지어는이 불후의 세포 라인 드 differenti입니다그것이 주 초 (우리의 데이터가 표시되지 않음)에 존재하는 청소 수용체를 표현하지 않는다는에서 ated. 모든 세포 생물 학적 연구는 동물에서 얻은 신선한 기본 세포에서 수행되어야합니다. 불행하게도, 초는 표준 문화 조건 dedifferentiate과 동물로부터 격리시 1 또는 2 일 이내에 사용해야합니다. 초의 분화는 Stabilin - 2 또는 토끼 수용체 ^9, CD31, 그리고 세포질 fenestration ^1의 존재의 표현에 의해 표시됩니다. 초의 분화는 문화 매체에서 VEGF의 추가 또는 hepatocyte 에어컨 매체 ^10,11에 culturing 세포에 의해 확장될 수 있습니다.

이 보고서에서는, 우리는 SEC 특정 Stabilin - 2 수용체에 대한 hyaluronan을위한 라디오 레이블 헤파린을 사용하여 손상 장기에서 초의 endocytic 활동을 보여줄 것입니다. 그러면 endocytosis를 측정 per​​fused 간장에서 hepatocytes 및 초 정화됩니다.

프로토콜

1. 간장의 절단 (변경 ^14,15과 함께 PO Seglen ¹² R. Blomhoff ^{13 일부터} 채택)

1. 닫힌 5.5 L 챔버에 페트리 접시에 폴리에틸렌 글리콜의 isoflurane 10 ML 30 %를 추가합니다. 그것은 챔버 내에 안정 분위기를 만들 수 isoflurane를 추가 후 10-15 분 기다 리 최적입니다.
2. 밀폐 챔버에서 쥐를를 삽입하고 anesthetized 될 수 있습니다. 마취의 전체 효과는 동물 응답, 지치게되면 분명하며, 깊은 호흡을 전시하고 있습니다.
3. 30 ML 주사기 튜브의 하단에있는 일부 면화 공에 폴리에틸렌 글리콜의 isoflurane의 장소 2 ML.
4. 기저귀 - 대상 트레이과 장소 주둥이를 통해 주사기 튜브에 미치는 뒷면에있는 쥐 놓으십시오.
5. 즉시 70 % 에탄올로 복부를 젖음하여 깊은 마취를 확인합니다. 동물이 isoflurane 과다 복용에 의해 죽게 내버려하지 마십시오.
6. 붕대 가위와 집게를 사용하여 전체 abd 노출ominal 캐비티.
7. 베나 포르를 찾아, 집게를 사용하여 즉시 mesenteric 지점 위에있는 베나 포르 아래 수술 실크 또는 폴리에스터 스레드 (끈)의 두 가닥을 그립니다.
8. 포셉을 철회하고 느슨한 overhand의 매듭을 묶게.
9. 베나 포르 아래 집게를 사용하여 부드럽게 정맥을 평탄케하기 위해 후퇴, Insyte의 Autoguard의 카테 테르 (18 GA, 1.3 X 300mm, BD Biosciences) 또는 유사 카테터와 정맥을 cannulate. 카테 테르는 스레드에 의해 형성된 루프를 넘어 몇 mm를 이동해야합니다.
10. 카테 테르에 용수철 트리거를 발표하여 바늘을 철회하고 제거합니다. 피가 적절한 봉합사 배치를 나타내는 카테 테르에까지 들어와서 시작합니다.
11. overhand의 매듭을 고정시켜 다른 overhand 매듭으로 확보.
12. 하부 대정 맥 또는 내림차순 대동맥 (대동맥의 abdominalis)는 혈액이 순환 시스템에서 유출하도록하거나 끊다.
13. 산소로 간 꼴이지 시작37 TBS ° C 20 ML / 분의 유량에서 혈액 (창백)를 제거합니다. 간은 붉은 자주색에서 롬 색상 설정해야합니다.
14. 간이 플러시되는 동안, 소비세 GI 요로 및 결합 조직 멀리 절단하여 간장. 간 또는 주사 Glisson의 캡슐을 괴롭히다하지 중요합니다.
15. 버퍼가 수집 및 recirculated 수 있습니다 퍼널을 통해 플라스틱 그물에 간 놓습니다. 이 시점에서 버퍼는 recirculated하지만 폐기물 비커에 흐름을해서는 안됩니다. 플러쉬는 10 분 이상 지난해서는 안됩니다. (그림 2A). 단계 2.1 필요한 endocytosis 솔루션을 준비합니다.

2. ¹²⁵ I - SA - B - C 형 간염 (또는 기타 적합한 레이블 리간드)의 국제화

1. 작은 비커에 50 ML RPMI 미디어, 최종 농도 0.05 %의 BSA와 0.01 MCI ¹²⁵ I - SA - B - C 형 간염 또는 endocytosis 다른 적절하게 표시 리간드에 추가할 수 있습니다.
2. apparatu이 비커를 첨부하여S는 산소를 허용합니다.
3. , 펌프를 끄고 유입 튜브를 전환한 다음 20 ML / 분 펌프를 켭니다.
4. 표시된 RPMI이 간을 방법으로 펌프를 끄고 퍼널 및 튜브의 배수구로 초과하는 액체를 허용합니다.
5. 분류 미디어의 재순환을 허용하고 펌프를 다시 시작합니다 미디어 비커에 드레인 튜브를 놓습니다.
6. 체액이 2 개 이상의 시간 동안 간을 통해 recirculate 수 있습니다.
7. 이 국제화 단계 동안 간장의 온도가 그것을 커버하고 소화에 대한 collagenase를 준비하여 안정되어 있는지 확인합니다.

3. collagenase의 소화에 의한 간장의 소화

1. 신선한 해산 및 필터링 (0.45 μm의) collagenase가 (100 MG / kg 쥐의 무게) 37 60 ML을 초과하지 않는 총 볼륨 ° C. 2를 버퍼에 추가합니다 볼륨 길이 / 튜브의 내부 볼륨에 따라 좌우됩니다 그에 따라 조정해야합니다.
2. 펌프 및 교환을 중지미디어 비커에서 TBS로 유입 튜브.
3. 50 ML / 칼슘에 의존하는 desmosomal 세포 분기점의 느슨해진을 허용 분 2 분 간 물로 씻어.
4. 간이 플러시되는 동안 장치에서 collagenase를 포함하는 비커와 미디어 비커을 교환.
5. 즉시 세정 후 최대 15 분 20 ML / 분의 유량에서 순환 루프에서 collagenase로 소화를 시작합니다. collagenase의 배치가 많은 번호에 따라 다를 수 있기 때문에, 소화의 양과 시간에 변화 collagenase의 모든 새로운 많은 최적화해야합니다. Collagenase 또한 칼슘 따라 달라집니다. 펌프를 끄고는 플라스크의 B.에 (그림 2B) 플라스크 B에 쓰레기 컨테이너에서 유출 라인을 전송 플라스크에서 버퍼와 가스 라인을 전환합니다.
6. 펌프를 중지 카테 테르를 제거 20-30 명의 ML 버퍼 1을 포함하는 요리에 간장을 전송.
7. 다시 껍질 Glisson의 간 캡슐과 세포를 흔들어액체의 아웃.
8. 액체가 세포 물질과 불투명 해짐에 따라, 30 μm의 메쉬를 통해 그리고 50 ML 원뿔에 얼음 여과 다음 100 μm의 메쉬를 통해 세포를 전송합니다.
9. 간 더 버퍼 1을 추가하고 메쉬 필터와 원뿔에 액체를 전송, 간 매트릭스에서 세포를 흔들어 계속 진행합니다.
10. 반복 단계 3.7-3.9 더 이상 세포 간의 합리 잡고 dislodged 수 없습니다 때까지.

4. Hepatocyte 및 SEC 정화

1. 3 분 150 XG에 세포를 포함하는 50 ML conicals을 원심 분리기. 펠렛 hepatocytes 수 있습니다.
2. 얼음 신선한 50 ML conicals에 비 parenchymal 세포를 포함하는 액체 분획을 전송합니다.
3. hepatocytes은 버퍼 3의 펠렛을 resuspending 및 단계 4.1 및 4.2 이상을 세 번 반복해야 씻으십시오.
4. 세척의 끝에, 산탄들이 ≥ 97% 순수 hepatocytes 있습니다. 초를 얻으려면, 튜브 C의 모든 원심 분리기10 분 200 XG에 (HSCs, 초, 그리고 KCs 및 일부 작은 hepatocytes를 포함)의 표면에 뜨는 풀링 ontaining. 4 ° C.
5. 버퍼를 대기음 4에서 5 ML RPMI / BSA의 모든 산탄 ° C.를 resuspend
6. 이 튜브로 함께 세포를 풀 35 ML의 볼륨을 최대 RPMI / BSA를 추가합니다.
7. 3 분 100 XG에 conicals을 원심.
8. 액체와 깨끗한 50 ML 원뿔로 전송의 상위 25 ML를 수집합니다.
9. 나머지 10 ML 미디어의 펠렛을 Resuspend 다시 25 차가운 RPMI / BSA의 ML, 3 분 100 XG에 원심 분리기를 추가합니다.
10. 단계를 반복 3.8 및 3.9 한 번 더 세포 펠렛과 낮은 열 ML 미디어를 폐기하십시오.
11. 펠렛 초, KCs, 그리고 10 분 200 XG에서 HSCs에 supernatents을 원심. 4 ° C.
12. 얼음 PBS 20 ML 25 % Percoll을 포함하는 세 50 ML 튜브를 준비합니다. 각 튜브 15 ML 50 % Percoll과 밑받침.
13. 30 ML RPMI / BSA의 총 볼륨에있는 세포 알약을 Resuspend.
14. 조심스럽게 중첩 EAC4 20 분 900 XG에서 세포 원심 분리기 10 ML과 H 그라데이션 ° C.
15. 초 및 KCs은 매우 낙관적인 밀도를 닫고 50분의 25 %의 인터페이스에 있습니다했습니다. HSCs는 / 미디어 지질 저장 세포로 자신의 높은 부력으로 인해 인터페이스를 25 %로 일반적으로하고 있습니다. 남아있는 hepatocytes과 혈액 세포는 낮은 buoyancies을 가지고 pelleted 있습니다. 50분의 25 % 인터페이스 상단의 아래에서 대기음이 자료를 폐기하십시오.
16. 50분의 25 %의 인터페이스와 차가운 RPMI와 신선한 원뿔로 전송에서 세포를 수집합니다. 최종 볼륨 Percoll을 희석하기 위해 ~ 40 ML해야합니다.
17. 4 10 분 350 XG에있는 원뿔을 원심 ° C를 펠렛 세포 수 있습니다.
18. ~ 10 ML 미리 예열 RPMI은 산성 입힌 유리 페트리 접시에 100 U / ML Penicillin/100 G / ML 스트렙토 마이신과 장소 세포를 포함하거나 접시를 crystallizing에있는 세포를 Resuspend.
19. 15 분 대한 세포를 품어. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터 인치
20. 록 또는 소용돌이 접시 조금다음 뜨는에서 초를 수집합니다. KCs 훨씬 더 빠르게 초보다 유리 준수합니다. 또한, 초는 자기 구슬로 복합 백신 CD31 또는 anti-Stabilin2/HARE 항체를 사용 immunopurification로 KCs 분리 수 있습니다.
21. 생존과 세포 숫자는 hemacytometer를 사용하여 trypan 파랑 제외 또는 자동 세포 계수기를 이용하여 평가 수 있습니다.
22. 문화 37 fibronectin - 코팅 플라스틱 접시에있는 초 ° C 5 % CO _2, 40 NG / ML VEGF, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신 또는 hepatocyte 에어컨 미디어 RPMI/0.25 %의 BSA.
23. Hepatocytes, KCs, 그리고 초는 감마 카운터를 사용하여 표시된 자료의 국제화를위한 평가하고 이러한 culturing 방법을 사용하여 (찬란 표시하는 경우) 전체 세포 단백질이나 현미경으로 정규화 수 있습니다.

5. 대표 결과 :

Hepatocyte 정화는 ≥ 97%하고 SEC 정화는 typic입니다앨리 ≥이 방법을 사용 95%. 복강, 포털 정맥의 cannulation, 그리고 간 창백의 절단은 모두 좋은 결과를 분 이내에 발생한다. HARE/Stabilin-2 간 초의 특정 수용체​​이며 다른 간 세포 유형에 표현되지 않습니다. 이 샘플에서는 hepatocytes와 초 모두 세포 lysates 5 % SDS - PAGE로 분리되었고 Stabilin - 2의 두 isoforms (그림 3)에 대한 단클론 항체와 탐지.

혈액 흐름에 주입 Unfractionated 헤파린은 간 ¹⁶ 지워집니다. 통관은 주로 hepatocytes 및 KCs ¹⁷ 대조적으로 간 초에 의해 수행됩니다. Stabilin-2/HARE 수용체는 바인딩과 초 ¹⁸ 헤파린 물질이 주요 통관 수용체이다. 여기에 우리의 예제에서, 우리는 GlcNAc / NS의 카르복 그룹에 비오틴 태그 헤파린을 표시. 비오틴은 보호해주는 내면 헤파린의 검출을위한 iodinated streptavidin과 함께 복합했습니다eoglycan. 분류 헤파린의 주입 30 분 후 분사 우리가 장기 헤파린의이 양식을 internalize있는 모니터 수 과다로 따라갔다. 이 짧은 시간 간격에서 간은 기본 통관 기관 (그림 4)이다.

좀 더 명확하게 셀 유형 통관에 대한 책임있는 이해하기 위해서, 우리는 0.05 %의 BSA와 보충 RPMI 미디어 I - SA - B - C 형 간염 ¹²⁵ 추가하고 20 분 간을 통해 순환 수있었습니다. collagenase의 소화와 세포 정화에 따라 레이블 헤파린의 대부분은 hepatocytes (그림 5)에 대조적으로 초에 의해 내면됩니다.

그림 1. 기본 아키텍처 간. 초는 sinusoids의 벽을 형성하고 일반적 (동아리의 작은 클러스터) fenestrated 있습니다. 별 모양의 세포 (HSCs)는 Kupffer C 달리 Disse의 공간에서 발견일반적으로 sinusoids의 microvasculature에 존재 ells (KCs). Hepatocytes는 Disse의 공간의 반대편을 차지하고 있습니다.

그림 2. 재관류 장치의 도식. A) 간 sinusoids의 세정 / 세척하는 동안 장치의 설정. TBS는 1 L 플라스크에 있습니다. B) collagenase와 함께 ~ 60 ML 버퍼 2를 포함하는 125 ML의 플라스크는 폐쇄 회로에 간 소화하는 데 사용됩니다. 유출물 라인도 고무 마개에 노치 컷을 통해 폐기물 컨테이너에서 플라스크를 B로 변경됩니다. 산소 라인은 거품 방지하는 collagenase (플라스크 B를) 포함하는 버퍼로 침수되지 않습니다. 각 플라스크에 stoppers가 유출 라인의 효율적인 전송을 허용하고 산소 가스의 증가 압력을 방지하기 위해 노치 수 있습니다.

그림 3. Hepatocyte 준비는 초와 오염되지 않습니다. 정화 hepatocytes의 배치 (레인 1)과 초 (레인 2)에서 세포 lysates의 동등한 양의 5 % SDS - PAGE로 분리하고 nitrocellulose에 blotted했다. HARE/Stabilin-2 두 isoforms (315 kDa 및 190 kDa)에 대한 구체적인 단클론 항체 # 30 lysates을 알아내기 위해 사용되었습니다.

그림 4. 장기 표시 헤파린의 유통. 쥐 30 분 ¹²⁵ I - SA - B - C 형 간염 대기와 측면 꼬리 정맥을 통해 주입 후 exsanguinated했다. 혈액은 인공적으로 어떤 장기 높은 수치를 제공하지 않도록 수집했습니다. 각 기관의 분 (CPM) 당 계산이 g에서 기관의 무게에 대한 표준되었습니다.

그림 5. hepatocytes 및 초에 표시 헤파린의 금액입니다. RPM¹²⁵ 포함 나 미디어는 I - SA - B - C 형 간염은 collagenase의 소화와 세포 정화 다음 20 분 간 손상을 통해 순환 수했습니다. hepatocyte 및 SEC 세포 단백질 lysates 동등한 양의는 브래드 포드 분석과 계량 및 감마 카운터로 집계되었다.

그림 6. Kupffer 세포는 유리에 부착하여 초부터 구분됩니다. 세포는 산성 입힌 유리 crystallizing 접시에 배치하고 ° C 5 % CO ₂ 37 15 분 준수 허용되었다. 비 준수 세포를 포함하는 supernatent는 부드럽게 swirled 및 원심 튜브에 배치되었다. 유리에 모두 준수 세포 (레인 1)에서와 비 준수 전지 (레인 2)에서 Lysates는 8% SDS - PAGE로 구분 blotted 및 Kupffer 세포에 대한 구체적인 CD163에 대한 항체로 탐지되었습니다.

fibronectin 코팅 플라스틱에 도금 그림 7. 초는 6 - 잘 요리는 0.1 % BSA와 보충 RPMI에서 하룻밤 incubated되었습니다. 위상 콘트라스트 이미지는 (A) 100x와 (B) 200x 배율에서 찍은되었습니다.

토론

isoflurane 증기 유도의 무의식이 우리의 연구에 대한 선호하는 방법입니다 걸려있는 드롭 방식으로 쥐 마취. 기화기 또한 챔버 밖의 동물을 유지하기 위해 면봉과 주사기 대신 사용하지만 수술 절차가 필요하지 않으므로 재빨리 수 있습니다. 폴리에틸렌 글리콜은 증기 압력과 증발 속도를 감소 isoflurane에 추가됩니다. 너무 isoflurane 수증기가 너무 빨리 죽음을 유발합니다. 간이 cannulated와 TBS, 간장 풀링 혈액 응고와 함께 5 월 blanched 및 collagenase와 sinusoids과 소화의 효율적인 세탁을 방지하기 전에 동물이 죽으면. 헤파린의 또한 항응고제로서 유용하게 사용될 수 있지만 우리의 탐사선으로 표시 헤파린 사용되기 때문에 이러한 연구에 사용되지 않습니다.

Gey의 버퍼 생리 식염수 (GBSS)는 종종 초의 정화를 위해 다른 실험실에 의해 대체됩니다. 그것은 SEC 정화, C 형 간염에 대한 유용 동안atocytes 1-3 GBSS뿐만 아니라 버퍼를 용납하지 않으며 viabilities 거의 같은 높이 없습니다. endocytosis를 측정하면, 그것은 기관과 hepatocytes를 정화의 배경 수준을 측정하는 것이 좋습니다.

이 방법은 collagenase와 함께 간 재관류에 따라 초의 효율적인 정화의 두 가지 중 하나입니다. 다른 방법은 elutriation의 원심 분리 ¹⁹ 대신 Percoll 기울기에 의해 비 parenchymal 세포를 분리합니다. Percoll의 그라디언트를 통해 elutriation를 사용하는 장점은 약간 높은 세포 viabilities와 숫자입니다. 단점은 elutriation의 원심 분리는 전문 회전자, 전용 원심 분리기, 그리고 달러 수만명의 비용이 함께 연동 펌프를 필요로한다는 것입니다. 이 방법은 많은 실험실에서 표준 냉동 테이블 상단의 원심 분리기와 연동 펌프의 사용을 필요로합니다.

선택적 부착하여 초와 KCs의 분리는 표준 방법입니다20-22. 그것이 초는 유리와 플라스틱을 준수합니다 사실이지만, 핵심 포인트 37에서 15 분 배양보다는 더 이상 함께 산 - 씻은 깨끗한 유리를 사용하는 것입니다 ° C 5 % CO _2. KCs는 항상 초보다 준수하고, 그것은 부드럽게 느슨하게 연결된되고있는 남아있는 초를 추출 미디어 KCs 씻는 것이 좋습니다. Pronase 및 기타 프로 테아제도 세포 viabilities 향상이 프로​​토콜의 collagenase의 소화 단계에서 생략됩니다. 프로 테아제는 세포외 수용체를 소화하고 최종 정화 단계에서 세포 유착을 억제 수도 있습니다.

여기서 제시하는 방법은 어플 리케이션의 다양한 있습니다. 우리가 헤파린가 처음 기본 hepatocytes를 얻기 위해 간을 통과, 재관류에 촬영되는 최종 결과를 보여주지만, KC, 초, 그리고 HSCs는 신진 대사 통로, immunoregulation, 청소 활동, 및 기타 관련된 연구 여러 유용할 수 있습니다 생리 studi알면서도. 이 절차의 가장 어려운 부분은 포털 정맥에서 카테 테르 전표를하지 않고 좋은 cannulation, 간장의 소화와 간 처리됩니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
이름	회사	모델 / 카탈로그 #	논평
20L 물 목욕	ThermoFisher	2231	물은 45 ° C 냉각 보상하는 것입니다
			튜브 안에.
연동 펌프	콜 - Parmer	7553-70	Masterflex 시리즈
냉장 원심 분리기	Sorvall	전설 XTR
카테 테르	BD Biosciences	381,444
Dessicator 챔버	어부	08595E	내부 플레이트를 사용하여
Percoll	시그마	P4937
소 혈청 알부민	SeraCare	AP - 4510-01
100 μm의 메쉬	스펙트럼 연구소	146,488
30 μm의 메쉬	스펙트럼 연구소	146,506
RPMI 1640	Invitrogen	21,870
폴리에틸렌 글리콜	스펙트럼 연구소의	PO107