Endocitose em Fígado vivo seguidos de purificação de células do fígado por perfusão de fígado

Resumo

O estudo do fígado sinusoidal células endoteliais (SCEE) devem ser realizados com células primárias provenientes do animal como não existem linhas celulares. Este método baseia-se na digestão de fígado e centrifugação diferencial para SEC purificação para a cultura subseqüente e experimentação.

Resumo

O fígado é o centro metabólico do corpo dos mamíferos e serve como um filtro para o sangue. A arquitetura básica do fígado é ilustrado na figura 1, no qual mais de 85% da massa do fígado é composto por hepatócitos e os restantes 15% da massa celular é composta por células de Kupffer (KCS), células estreladas (HSCs), e sinusoidal células endoteliais (SCEE). SCEE formam as paredes dos vasos sanguíneos dentro do fígado e conter morfologia especializada chamada fenestras dentro do citoplasma. Fenestração do citoplasma é o aparecimento de buracos (~ 100 mm) dentro das células, para que o ato SECS como uma peneira em que a maioria quilomícrons, remanescentes de quilomícrons e macromoléculas, mas não células, passam para os hepatócitos e HSCs ¹ (Fig. 1). Devido à falta de uma membrana basal, o fosso entre os segundos e hepatócitos formam o espaço de Disse. HSCs ocupar este espaço e desempenhar um papel proeminente na regulação e resposta ao injury, armazenamento de ácido retinóico e imunorregulação dos ^dois de fígado.

SCEE estão entre as células mais ativas endocytically do corpo exibindo uma variedade de receptores scavenger em seus ^três superfície da célula. Estes incluem SR-A, Stabilin-1 e Stabilin-2. Geralmente, pequenas partículas coloidais menos de 230 nm e macromoléculas em fase de buffer são ocupados por SCEE, enquanto que, as partículas grandes e restos celulares é endocytosed (fagocitados) por KCs ^4. Assim, a depuração maior parte do material extracelular, como os glicosaminoglicanos do sangue é em grande parte dependentes da saúde e as funções endocítica da SCEE ^5,6. Por exemplo, um aumento dos níveis sanguíneos de ácido hialurônico é um indicativo de doença hepática variando de leve a formas mais graves ^7.

Com a exceção de um relatório de ^8, não há linhas de células imortalizadas SEC na existência. Mesmo esta linha de células imortalizadas é de-diferenciadoated in que não expressam receptores scavenger que estão presentes em SECS primária (os nossos dados, não mostrados). Todos os estudos de células biológicas devem ser realizadas em células primários obtidos recentemente a partir do animal. Infelizmente, SCEE desdiferenciem sob condições de cultura padrão e deve ser utilizado dentro de 1 ou 2 dias após o isolamento do animal. Diferenciação do SCEE é marcada pela expressão de Stabilin-2 ou receptor HARE ^9, CD31, ea presença de fenestração citoplasmática ^1. Diferenciação do SCEE pode ser estendido com a adição de VEGF em meios de cultura ou cultura de células em meio condicionado de hepatócitos ^10,11.

Neste relatório, vamos demonstrar a atividade endocítica da SCEE no órgão intacto utilizando rádio-etiquetados heparina de ácido hialurônico para a SEC-receptor específico Stabilin-2. Nós, então, purificar hepatócitos e SCEE do fígado perfundido para medir a endocitose.

Protocolo

1. Excisão do fígado (adotada a partir de ¹² e PO Seglen Blomhoff R. ¹³ com modificações ^14,15)

1. Adicionar 10 mL de 30% de isoflurano em polietileno glicol a uma placa de petri em uma câmara fechada L 5.5. É ideal para esperar 10-15 min após a adição de isoflurano para criar um ambiente estabilizado dentro da câmara.
2. Coloque um rato na câmara selada e permitir que ele se torne anestesiados. Plenos efeitos da anestesia são visíveis quando o animal torna-se flácido, sem resposta, e apresenta respiração profunda.
3. Coloque 2 mL de isoflurano em polietileno glicol em algumas bolas de algodão na parte inferior de um tubo de seringa 30 mL.
4. Coloque o rato sobre as suas costas em uma bandeja coberta de fralda e colocar o tubo da seringa sobre o focinho.
5. Confirmar imediatamente anestesia profunda molhando o abdômen com etanol 70%. Não deixe que o animal morrer por overdose isoflurano.
6. Usando uma tesoura curativo e fórceps, expor o abd todacavidade ominal.
7. Localize a porta da veia e, usando uma pinça, desenhe duas fitas de seda ou de fio de poliéster cirúrgica (ligadura) abaixo da veia porta imediatamente acima do ramo mesentérico.
8. Retirar a pinça e faça um nó overhand solta.
9. Utilizando uma pinça debaixo da porta cava e puxando de volta para endireitar a veia, canular a veia com cateter autoguard INSYTE (18 GA, 1,3 x 300 mm, BD Biosciences) cateter ou similar. O cateter deve ir além dos vários milímetros laço formado pelo segmento.
10. Retrair e remover a agulha, liberando o gatilho de mola sobre o cateter. Sangue deve começar a escorrer para dentro do cateter indicando colocação de ligadura adequada.
11. Apertar o nó overhand e fixe-a com outro nó.
12. Sever ou a veia cava ou aorta descendente (aorta abdominalis) para permitir que o sangue escorra do sistema circulatório.
13. Comece a lavar o fígado com oxigenadaTBS, a 37 ° C para remover o sangue (branqueamento) a uma vazão de 20 mL / min. O fígado deve girar de um roxo-avermelhado para uma cor de barro.
14. Enquanto o fígado está esvaziando especiais de consumo, o fígado cortando-se o trato gastrointestinal e do tecido conjuntivo. É importante não lacerar o fígado ou perfure a cápsula de Glisson.
15. Coloque o fígado de uma rede de plástico sobre um funil que permite buffers a serem recolhidos e recirculado. Buffers, neste ponto não deve ser recirculado, mas o fluxo para o copo de resíduos. Lavagem não deve durar mais de 10 min. (Fig. 2A). Prepare a solução endocitose requeridas no ponto 2.1 passo.

2. Internalização de ¹²⁵ I-SA-b-Hep (ou ligante adequado outros rotulados)

1. A 50 mL de mídia RPMI em um pequeno copo, adicionar a uma concentração final BSA 0,05% e 0,01 mCi ¹²⁵ I-SA-b-Hep ou ligante devidamente rotulados para outros endocitose.
2. Anexar esse copo ao apparatus para permitir a oxigenação.
3. Desligar a bomba, mude a tubulação de entrada, e depois ligar a bomba a 20 mL / min.
4. Como o RPMI rotulados abordagens do fígado, desligue a bomba e permitir que o excesso de líquido no funil de drenagem e tubulação.
5. Coloque a tubulação de dreno para o copo de mídia para permitir a recirculação da mídia rotulados e reinicie a bomba.
6. Permitir que fluidos para recircular através do fígado por não mais de uma hora.
7. Durante esta etapa de internalização, certifique-se que a temperatura no fígado é estável, cobrindo-o e preparar a colagenase para a digestão.

3. Digestão do fígado pela digestão da colagenase

1. Recém-dissolvido e filtrada (0,45 mm) colagenase (100 de peso de ratos mg / kg) deve ser adicionado ao tampão de dois em um volume total não deve exceder 60 ml a 37 ° C. O volume é dependente do comprimento / volume interno da tubulação e deverá ser ajustado em conformidade.
2. Pare a bomba e trocar otubulação de entrada do copo de mídia para a TBS.
3. Lave o fígado por 2 min a 50 mL / min, que permite o afrouxamento das junções celulares desmossomais que são dependentes de cálcio.
4. Enquanto o fígado é o rubor, a troca do copo de mídia com o copo contendo colagenase sobre o aparelho.
5. Imediatamente após a lavagem, começar a digestão com colagenase em um loop circulatório a uma vazão de 20 mL / min até 15 min. Desde lotes colagenase variam de acordo com número de lote, as variações na quantidade e tempo de digestão precisam ser otimizados para cada novo lote de colagenase. Colagenase também é dependente de cálcio. Desligar a bomba e trocar o buffer e linhas de gás do balão A para B. Flask transferência da linha de efluente do recipiente de resíduos para Flask B (Fig. 2B).
6. Parar a bomba, remover o cateter e transferir o fígado para um prato contendo 20-30 mL de buffer 1.
7. Retire a cápsula de Glisson do fígado e agitar o celulars no líquido.
8. À medida que o líquido se torna opaco com material celular, transferência de células através de uma malha M 100 seguido por filtração através de uma malha M 30 e, em seguida, em um 50 mL cônico no gelo.
9. Adicionar mais um buffer para o fígado e continuar balançando as células hepáticas a partir da matriz, transferindo o líquido para os filtros de malha e cônico.
10. Repita os passos de 3,7-3,9 até que não haja mais células pode ser desalojado com agitação razoável do fígado.

4. Purificação dos hepatócitos e SEC

1. Centrífuga de 50 mL contendo células conicals a 150 xg por 3 min. pellet para os hepatócitos.
2. Alienar a fração líquida contendo células não-parenquimatosas a fresco 50 mL conicals no gelo.
3. Lavar os hepatócitos ser ressuspender o sedimento em tampão 3 e repetindo os passos 4.1 e 4.2 mais três vezes.
4. No final da lava, as pelotas são ≥ 97% hepatócitos puro. Para obter a SCEE, centrifugar todos os tubos containing pooled sobrenadante (contendo HSCs, SECS, e KCs e alguns hepatócitos pequenos) a 200 xg por 10 min. a 4 ° C.
5. Aspirar o buffer e ressuspender todos os pellets em 5 mL RPMI / BSA a 4 ° C.
6. Piscina as células juntas em 2 tubos e adicionar RPMI / BSA até um volume de 35 mL.
7. Centrifugar a 100 xg conicals por 3 min.
8. Recolher o top 25 mL de líquido e transferir para um limpo 50 ml.
9. Ressuspender o sedimento em media os restantes 10 mL e adicionar novamente 25 mL de frio RPMI / BSA e centrifugar a 100 xg por 3 min.
10. Repita os passos 3.8 e 3.9, uma vez mais, descartar o pellet celular e menor media 10 mL.
11. Centrifugar a supernatents para pellet SCEE, KCs e HSCs a 200 xg por 10 min. a 4 ° C.
12. Preparar três tubos de 50 mL contendo 20 mL de Percoll 25% em PBS sobre o gelo. Underlay com 15 mL de Percoll 50% em cada tubo.
13. Ressuspender o pellets de células em um volume total de 30 mL RPMI / BSA.
14. Cuidadosamente overlay each gradiente com 10 mL de células e centrifugação a 900 xg por 20 min a 4 ° C.
15. SCEE e KCs têm muito perto densidade de flutuação e estão na interface 25/50%. HSCs são tipicamente menos os 25% / media de interface devido à sua maior flutuabilidade como células lipídicas armazenamento. Qualquer hepatócitos remanescentes e as células sanguíneas têm a menor e são buoyancies peletizada. Aspirar de cima para baixo perto da interface 25/50% e descartar este material.
16. Coletar as células na interface de 25/50% e transferir para um cônico fresco com RPMI frio. O volume final deve ser ~ 40 mL para diluir o Percoll.
17. Centrifugar a cônica em 350 xg por 10 min a 4 ° C para agregar as células.
18. Ressuspender as células em ~ 10 mL pré-aquecido RPMI contendo 100 U / mL Penicillin/100 células g / mL estreptomicina e coloque em um ácido lavado prato de vidro Petri ou cristalização prato.
19. Incubar as células por 15 min. a 37 ° C em uma incubadora de cultura de tecidos.
20. Rocha ou redemoinho da placa um poucoe depois recolher os SECS no sobrenadante. O KCs aderir ao vidro muito mais rapidamente do que SCEE. Alternativamente, SCEE pode ser separado por KCs immunopurification utilizando anticorpos anti-CD31 ou anti-Stabilin2/HARE conjugado com esferas magnéticas.
21. Números e viabilidade celular pode ser avaliado pela exclusão do azul tripan utilizando um hemocitômetro ou com o uso de um contador de células automatizado.
22. Cultura da SCEE em fibronectina revestido pratos de plástico, a 37 ° C, 5% CO _2, BSA RPMI/0.25% com 40 ng / mL VEGF, 100 U / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / mL ou com hepatócitos media condicionado.
23. Hepatócitos, KCs e SCEE pode ser avaliar para a internalização do material marcado pelo uso de um contador gama e normalizar a proteína celular total ou por microscopia (se fluorescente etiquetado) com estes métodos de cultivo.

5. Resultados representativos:

Purificação dos hepatócitos é ≥ 97% e purificação SEC é typicaliado ≥ 95% usando este método. Excisão da cavidade abdominal, canulação da veia porta, e branqueamento do fígado todos devem ocorrer dentro de um minuto para obter os melhores resultados. HARE/Stabilin-2 é um receptor específico na SCEE fígado e não é expressa em outros tipos de células do fígado. Nesta amostra, lisados ​​celulares de ambos os hepatócitos e SCEE foram separados em 5% SDS-PAGE e sondou com um anticorpo monoclonal contra ambas as isoformas da Stabilin-2 (Fig. 3).

Heparina não fracionada injetada na corrente sanguínea é eliminado pelo fígado ^16. Depuração é realizada principalmente pela SCEE fígado, em contraste com hepatócitos e KCs ^17. O receptor Stabilin-2/HARE é o receptor que se liga clearance principal e internaliza heparina em SCEE ^18. No nosso exemplo aqui, nós rotulados heparina com uma tag biotina sobre o grupo carboxilato de GlcNAc / NS. A biotina foi conjugado com estreptavidina iodado para a detecção de prot heparina internalizadoeoglycan. Injeção de heparina marcada seguido por exsangüinação 30 minutos após a injecção nos permite monitorar os órgãos internalizar esta forma de heparina. Neste curto intervalo de tempo, o fígado é o órgão de folga primário (Fig. 4).

Para compreender mais claramente que tipo de célula é responsável pela depuração, acrescentamos ¹²⁵ I-SA-b-Hep à mídia RPMI suplementado com BSA 0,05% e permitiu que a circular através do fígado por 20 min. Após digestão com colagenase e purificação celular, a grande maioria de heparina marcada é internalizada pela SECS, em contraste com hepatócitos (Fig. 5).

Figura 1. Fígado arquitetura Basic. SCEE formam as paredes dos sinusóides e são normalmente fenestrado (pequenos grupos de círculos). Células estreladas (HSCs) são encontrados no espaço de Disse, em contraste com Kupffer cells (KCS), que estão normalmente presentes na microcirculação dos sinusóides. Hepatócitos ocupar o outro lado do espaço de Disse.

Figura 2. Esquemática do aparelho de perfusão. A) Set-up do aparelho durante a lavagem / lavagem dos sinusóides do fígado. TBS está num frasco de 1 L. B) Um frasco contendo 125 mL a 60 mL de buffer 2 com colagenase é utilizada para a digestão do fígado em um circuito fechado. A linha de efluentes também é alterada a partir do recipiente de resíduos de frasco B através de um corte entalhe na tampa de borracha. A linha de oxigênio não é submerso no buffer contendo colagenase (B frasco) para evitar a formação de espuma. As rolhas em cada frasco são entalhados para permitir a transferência eficiente da linha de efluentes e para evitar aumento da pressão do gás oxigênio.

Figura 3. Hepatócito não estão contaminados com SCEE. Quantidades iguais de lisados ​​celulares de lotes purificada dos hepatócitos (pista 1) e SECS (pista 2) foram separados em 5% SDS-PAGE e apagou a nitrocelulose. Anticorpo monoclonal # 30, que é específica contra ambas as isoformas (315 kDa e 190 kDa) de HARE/Stabilin-2 foi usado para investigar o lisados.

Figura 4. Distribuição de heparina rotulados de órgãos. Ratos foram injetados através da veia caudal lateral com ¹²⁵ wait I-SA-b-hep por 30 minutos e depois sangrar. O sangue foi coletado de forma a não dar quaisquer órgãos artificialmente leituras elevadas. Contagens por minuto (CPM) de cada órgão foram normalizados contra o peso do órgão em gramas.

Figura 5. Quantidade de heparina rotulado em hepatócitos e SCEE. RPMEu mídia contendo ¹²⁵ I-SA-b-Hep foi autorizado a circular através de um fígado intacto por 20 min seguida de digestão da colagenase e purificação celular. Quantidades iguais de hepatócitos e SEC lisados ​​proteínas celulares foram quantificados com o Ensaio de Bradford e contados por um contador gama.

Figura 6 células. Kupffer estão separados SECS pela adesão em vidro. As células foram colocadas em um prato de vidro lavado com ácido e cristalização e permitiu a aderir por 15 min a 37 ° C, 5% CO _2. O sobrenadante contendo células não-aderidas foi agitado suavemente e colocado em um tubo de centrifugação. Lisados ​​de ambas as células aderidas em vidro (pista 1) e de células não-aderidas (pista 2) foram separados em 8% SDS-PAGE, apagado, e sondou com um anticorpo contra a CD163, que é específico para células de Kupffer.

Figura 7. SECS plaqueadas em plástico revestido fibronectina 6-bem pratos foram incubadas durante a noite em RPMI suplementado com BSA 0,1%. Imagens de contraste de fase foram tomadas a (A) 100x e (B) ampliação 200x.

Discussão

Anestesia do rato pelo método de gota em suspensão em que o isoflurano vapor induz a inconsciência é o método preferido para os nossos estudos. Um vaporizador também pode ser usado em vez de uma seringa com algodão para manter o animal fora da câmara, mas os procedimentos cirúrgicos são tão rápidos, não é necessário. Polietileno glicol é adicionado ao isoflurano para diminuir a pressão de vapor e taxa de evaporação. Muito vapor isoflurano vai induzir a morte muito rapidamente. Se o animal morrer antes do fígado é canulada e escaldados com TBS, o acúmulo de sangue pode formar coágulos no fígado e prevenir a lavagem eficiente dos sinusóides e digestão com colagenase. A adição de heparina pode ser útil como um anticoagulante mas não é usado nesses estudos, já que utilizamos heparina rotulados como nossa sonda.

Gey solução tamponada de salina (GBSS) é muitas vezes substituído por outros laboratórios para a purificação de SCEE. Embora seja útil para a SEC purificação, hepatocytes não toleram GBSS bem como Buffers 1-3 e viabilidades não são tão altos. Ao medir a endocitose, é uma boa prática para medir os níveis de fundo no órgão e em hepatócitos purificada.

Este método é um dos dois para a purificação eficiente da SCEE após a perfusão hepática com colagenase. O outro método separa as células não-parenquimatosas por centrifugação elutriação ^{19 em} vez de gradiente de Percoll. As vantagens para a utilização de mais de elutriação gradientes de Percoll são viabilidades celulares ligeiramente maior e números. A desvantagem é que a centrifugação elutriação requer um rotor especializados, dedicados centrífuga, e bomba peristáltica juntos que custa dezenas de milhares de dólares. Este método requer apenas o uso de uma centrífuga refrigerada de bancada e uma bomba peristáltica que é padrão em muitos laboratórios.

Separação de segundos e KCs por adesão seletiva é um método padrão20-22. Embora seja verdade que SCEE vai aderir ao vidro e plástico, o ponto chave é usar ácido lavou o vidro limpo, com não mais do que 15 minutos de incubação a 37 ° C em 5% CO _2. KCs sempre aderem mais rápido do que segundos e é aconselhável lavar cuidadosamente a KCs com a mídia para extrair qualquer SECS restantes que tornaram-se frouxamente ligados. Pronase e outras proteases também são omitidos os passos colagenase digestão neste protocolo para aumentar a viabilidades das células. Proteases digerir receptores extracelulares e pode inibir a adesão celular nas etapas de purificação final.

O método aqui apresentado tem uma grande variedade de aplicações. Embora nós mostramos o resultado final em que a heparina é inicialmente assumido para a perfusão de apuramento, do fígado para a obtenção de hepatócitos primários, KC, SECS, e HSCs pode ser útil para uma série de estudos envolvendo vias metabólicas, imunorregulação, atividades de catadores, e outros fisiológicas studies. A parte mais difícil deste procedimento é canulação boa, a digestão do fígado, e manuseio do fígado sem ter o deslizamento cateter da veia portal.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Companhia	Modelo / catalogo	Comentário
Banho de água 20L	ThermoFisher	2231	Água é de aproximadamente 45 ° C para compensar refrigeração
			dentro da tubulação.
Bomba peristáltica	Cole-Parmer	7553-70	Masterflex série
Centrífuga refrigerada	Sorvall	Legenda XTR
Cateter	BD Biosciences	381444
Câmara exsicador	Pescador	08595E	Use placa interna
Percoll	Sigma	P4937
Albumina de soro bovino	SeraCare	AP-4510-01
100 mesh mM	Espectro de laboratórios	146488
30 mesh mM	Espectro de laboratórios	146506
RPMI 1640	Invitrogen	21870
Polietileno glicol	Espectro de laboratórios	PO107