في Electroporation المجراة من Morpholinos في الكبار التجديد زعنفة الذيل الزرد

Summary

وصفنا أسلوبا لضربة قاضية مشروط التعبير عن بروتين الهدف خلال الكبار الزرد تجديد زعنفة. هذا الأسلوب الذي ينطوي الصغيرة عن طريق الحقن وelectroporating morpholinos قليل النوكليوتيد العقاقير إلى الأنسجة الزعانف، والذي يسمح باختبار دور هذا البروتين في مراحل مختلفة من تجديد الزعانف، بما في ذلك التئام الجروح، وتشكيل مأرمة، وثمرة التجدد.

Abstract

يمكن أن أنواع معينة من urodeles والأسماك مكتملة العظام تجديد أنسجتها. وأصبحت نموذجا الزرد المستخدمة على نطاق واسع لدراسة تجديد التلقائي للأنسجة البالغين، مثل القلب ^1، شبكية العين ^{2، 3} الحبل الشوكي، العصب البصري ^4، خلايا الشعر الحسية ^5، وزعانف ^6.

الزعنفة الزرد هو ملحق بسيطة نسبيا التي يتم التلاعب بها بسهولة لدراسة مراحل متعددة في تجديد تجدد المقطوع. كلاسيكيا، تميزت زعنفة تجديد من قبل ثلاث مراحل متميزة: التئام الجروح، وتشكيل مأرمة، وثمرة زعنفة. بعد بتر جزء من الزعانف، وظهارة المحيطة انتشارا ويهاجر على الجرح. في 33 درجة مئوية، وهذه العملية تحدث في غضون ست ساعات ما بعد بتر (HPA، الشكل 1B) ^6،7. المقبل، والخلايا الكامنة من أنساب مختلفة (مثل العظام والدم والدبقية، الخلايا الليفية) إعادة إدخال دورة الخلية لتشكيل مأرمة التكاثري، ثhile البشرة المغطي تستمر في التكاثر (1D الشكل) ^8. ثمرة كما يحدث الخلايا الأقرب إلى مأرمة في الأنساب كل منها إعادة التفريق، لتشكيل أنسجة جديدة (الشكل 1E) ^8. تبعا لمستوى لبتر، اكتمال تجديد كامل في الاسبوع لمدة شهر.

التعبير عن عدد كبير من العائلات الجينات، بما في ذلك hox، wnt، جمعية جيل المستقبل، MSX، حمض الريتينويك، SHH، الشق، BMP، وactivin بيتا الجينات A، هو ما يصل ينظم خلال مراحل معينة من تجديد زعنفة ^9-16. ومع ذلك، فقد كان دور كل من هذه الجينات والبروتينات التي ترميز خلال تجديد الصعب تقدير، ما لم يكن المانع محددة للبروتين موجود ^13، متحولة حساسة للحرارة أو وجود حيوان المعدلة وراثيا (إما overexpressing البروتين من النوع البري أو المهيمنة 1 سلبية البروتين) قد ولدت ^7،12. نحن develoPED تقنية عكس الوراثية بسرعة وسهولة اختبار وظيفة من أي جين خلال تجديد زعنفة.

وتستخدم على نطاق واسع [أليغنوكليوتيد] Morpholino لدراسة فقدان بروتينات معينة أثناء الزرد، القيطم والحمص، والفأر التنمية ^17-19. Morpholinos basepair مع تسلسل الحمض النووي الريبي مكملة لاما الربط ما قبل مرنا كتلة أو ترجمة مرنا. ونحن تصف طريقة لإدخال بكفاءة فلوريسئين الموسومة العقاقير morpholinos في زعانف اسماك الزرد تجديد في التعبير ضربة قاضية من البروتين الهدف. وmorpholino والصغرى تحقن كل مأرمة من زعنفة الذيل تجديد الزرد وelectroporated في الخلايا المحيطة بها. فلوريسئين يوفر هذا الاتهام إلى electroporate في morpholino وتصور morpholino في الأنسجة زعنفة.

هذا البروتوكول يسمح مشروط ضربة قاضية البروتين لدراسة دور بروتينات معينة أثناء نمو زعانف التجدد. في مناقشة:ن، ونحن تصف كيفية ويمكن تكييف هذا النهج لدراسة دور بروتينات معينة أثناء التئام الجروح أو تشكيل مأرمة، فضلا عن علامة المحتملة للهجرة من خلال تشكيل خلية مأرمة.

Protocol

1. Resuspend Morpholino

1. تمييع 300 نيوتن متر من فلوريسئين الموسومة morpholino إلى 100 ميكروليتر من nuclease خالية من المياه لتقديم حل ما يقرب من 3 مم. وaliquoted الحل morpholino الى عدة أنابيب microcentrifuge البارافين مختومة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة وبعيدا عن الضوء.
2. لتحديد تركيز morpholino بالضبط، تمييع 5 ميكرولتر من حل morpholino (أو المياه باعتبارها فارغة) في 95 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك N 0.1. تحديد خط الأساس على معمل في 265 نانومتر مع فارغة الماء ثم تحديد القراءة من الحل morpholino المخفف. مضاعفة الامتصاصية morpholino بواسطة ثابت لها وتحدد من قبل عامل تخفيف لتحديد تركيز في نانوغرام / ميكروليتر. يتم حساب ثابت morpholino على النحو التالي:

   Morpholino ثابت = الوزن الجزيئي للامتصاص morpholino 1000/molar X.

   ويمكن الاطلاع على الوزن الجزيئي والامتصاصية المولية للmorpholino على "بنسبة ضئيلة للعقارات "ورقة قدمت مع المنتج. تقسيم تركيز morpholino، في نانوغرام / ميكروليتر، من الوزن الجزيئي لتحديد تركيز في ملي. تمييع morpholino، إذا كان ذلك ضروريا، إلى تركيز العمل، مم 1.2 عادة.

2. زعنفة البتر

1. تخدير الزرد الكبار سواء في Tricaine أو 2-فينوكسي ايثانول في ملغ 1.0 / مل في مياه الصهاريج.
2. بتر الزعنفة باستخدام شفرة حلاقة أو مشرط معقم الأقرب إلى نقطة lepidotrichial 1 المتفرعة. وينبغي أن يتم هذا في الموقع القريب / البعيد نفسها على كل حيوان (على سبيل المثال 7 شرائح عظمية البعيدة من حزام FIN). هام: تأكد لخفض عمودي تماما على الطائرة الأمامي / الخلفي من الحيوان. وسوف يؤدي إلى خفض الزاوية ثمرة زعنفة متفاوتة من نصفين ظهري وبطني من الزعانف.
3. عودة الأسماك إلى خزان. نحافظ على عادة السمك عند 33 درجة مئوية إلى زيادة معدل التجدد. اعتمادا على التصميم التجريبي، ثآيت آخر أيام 0-2 بتر (د ب أ) لتجديد زعنفة قبل أن يبدأ عرضه morpholino. وتناقش النهج البديل في المناقشة، أدناه.

3. Morpholino حقن

1. في اليوم قبل حقن morpholino، وجعل لوحة حقن (الشكل 2). تأكد من قطع الشق في واحدة من نهاية جيد، مما يساعد على تحقيق الاستقرار في الأسماك لإجراء microinjection.
2. في 2 د ب أ، إعداد جهاز حقن الجزئي وحل morpholino.
3. تمييع morpholino فلوريسئين الموسومة إلى تركيز مناسب (يوصي بدءا من 1.2 ملم) ومكان في حمام ماء 65 درجة مئوية، لمدة 5 دقائق.
4. سحب الإبرة زجاج لحقن الجزئي باستخدام إبرة مجتذب.
5. تحميل إبرة مع morpholino (ملاحظة: اعتمادا على ما إذا ظهر التعبئة أو جبهة التحميل إبرة الخاص سوف تحدد ما إذا كنت تحميل إبرة الأولى، أو قطع طرف الأول).
6. قطع رأس قبالة إبرة فين زاوية.
7. اتبع التوجيهات من النظام الخاص بك حقن الجزئي لحقن فقاعة NL ما يقرب من 5 من morpholino لكل حقن. يمكن أن كميات أكبر من morpholino تعطيل الأنسجة.
8. تخدير الأسماك ومكان على لوحة حقن. إزالة كافة السائل الزائد وتوجيه الإبرة إلى المكان المناسب، البعيدة فقط للراي عظمي (الشكل 3). باستخدام المجهر وجهاز microinjection مناسبة لحقن morpholino (انظر الجدول من الكواشف معينة)، حقن morpholino في فنلندا من سابقة لاحق، كما هو مبين في الشكل (3). عن طريق الحقن من الخلفية إلى الأمامية يؤدي إلى الأنسجة زعنفة نشمر خلال الحقن وصعب جدا.
9. يدخل الإبرة بلطف في الأنسجة التجدد، البعيدة تماما على كل شعاع عظمي (يحمل الرقم "1" في الشكل 3)، ودفع بشكل أقصى حتى تقع في مأرمة (وضع علامة "2" في الشكل 3). يجب الحرص على عدم دفع الإبرة من خلال ENزعنفة الاطارات. عندما يكون موضعيا بشكل صحيح الإبرة، حقن morpholino (أي فوق مرة واحدة). في 1.2 ملم، والحل morpholino فلوريسئين الموسومة يبدو الأصفر والأخضر، حتى في ظروف الإضاءة العادية. مع كل حقنة، لونه أصفر "نفخة" من حل morpholino يمكن تصور، مما يساعد على إضفاء الطابع المحلي على حقن لمأرمة. وينبغي حقن ما يقرب من 75 NL (10-15 النقرات) من حل morpholino لكل راي عظمي. وقفة ~ 1 ثانية بين النقرات. نحن فقط حقن الجانب الظهري، وذلك باستخدام بطني كما electroporation فقط السيطرة. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن تكرار هذا الإجراء بأكمله باستخدام morpholino السيطرة على النصف بطني من الزعانف.

4. Electroporation من Morpholino

1. فورا بعد الحقن للmorpholino، وإزالة لوحة حقن من جهاز حقن الجزئي. شغل لوحة حقن بشكل جيد مع حل التخدير حتى يتم المغمورة السمك. يتم تنفيذ electroporation تحت خط الماء.
<لى> من البلاتين قطرها 3 ملم لوحة إلكترود منتاش (CUY 650-P3 الملقط، بروتك الدولية) يموضع النبضات إلى نصف ما يقرب من الزعانف. يجب الحرص على عدم لمس الأقطاب الكهربائية إلى النسيج زعنفة. للتأكد من أن الأقطاب لا تلمس الأنسجة الزعانف، وتناوب على السمك على الجانب الظهري والنظر مباشرة إلى أسفل خط الوسط لelectroporation.
2. Electroporate كلا من ظهري وبطني (للتحكم عن الآثار electroporation غير محددة) من جانبي الزعنفة باستخدام CUY21 ساحة الموجة Electroporator (بروتك الدولية، وشركة). مسح الأقطاب مع KimWipe رطبة بعد كل electroporation لإزالة أي فقاعات يمكن أن تكون قد تشكلت. إذا لم تتم إزالتها، مصغرة تهمة يتراكم، الأمر الذي جذب النسيج نحو القطب. وينبغي تعيين المعلمات electroporation إلى 10 ميللي ثانية على التوالي البقول 50، في 15 V مع وقفة ثانية 1 بين النبضات.
3. ضع السمك على شريحة زجاجية أو صحن بيتري والصورة بسرعة وفنلندا، مع التأكد من نالمؤسسة التجارية العمانية التوجه ظهري / بطني. وسيتم استخدام هذه الصورة لتحليل إعادة النمو في اليوم التالي. عودة الأسماك إلى الخزان.

5. تحليل

1. إذا كان مطلوبا من البروتين المستهدفة التي تم ترسيتها في التعبير عن التجدد زعنفة السليم، وينبغي أن الفرق الكبير بين شطري ظهري وبطني من الزعنفة يكون واضحا 1 يوم بعد electroporation (الشكل 5B).
2. في 3 د ب أ، التقاط صورة أخرى من الزعنفة من كل الأسماك وتطابق هذه الصورة مع صورة 2 د ب أ المقابلة (الشكل 5B). والاختلاف الطبيعي في زعنفة نمط تصبغ بين الحيوانات تسمح لك لتحديد بشكل صحيح الأسماك الفردية.
3. المعاهد الوطنية للصحة باستخدام صورة، تتبع 2 مجالات د ب أ د ب أ و 3 من كل شطر في ظهري وبطني (الشكل 5B).
4. لتحديد منطقة٪ من استخدام ظهري بطني مقابل الصيغة التالية: (الظهرية _3dpa - الظهرية _2dpa) / (بطني _3dpa - بطني _2dpa) × 100 = منطقة٪

6. ممثل النتائج

1. نحن دائما لفحص ثمرة الزعانف في 3 HPE د ب أ، أو 24 (ساعة electroporation آخر). في هذا الوقت، يجب أن morpholino فلوريسئين الموسومة أن تكون موجودة في النصف الظهري من الزعنفة (إضافي الشكل 1 والشكل 6A). فمن الطبيعي أن نرى بعض زائدة وصولا الى مستوى من البتر.
2. يجب أن يكون هناك أي اختلاف بين الجانبين ظهري وبطني في زعنفة حقن وelectroporated مع morpholinos مراقبة (الشكل 6B).
3. إذا كان morpholino تجريبي يستهدف بروتين ضروري لنمو زعانف، ينبغي ملاحظة وجود فارق كبير بين الجانبين ظهري وبطني (الشكل 6C).
4. إذا لمست القطب الزعنفة خلال electroporation، وسوف تظهر في النسيج البني (احترق تقريبا في مظهر) ونخرية.

"SRC =" / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg "/>
الشكل 1. تخطيطي لمختلف الأحداث التي تحدث أثناء تجديد زعنفة. تعطى مرة الكامنة وراء كل حدث في ساعات ما بعد بتر (HPA) وتتوافق مع درجة الحرارة من 33 دبابة درجة مئوية.

الشكل 2. أ. التخطيطي لوحة الحقن، والتي تتم من الاغاروز ويحتوي على قليل جيدا لعقد الأسماك خلال microinjection من morpholino.

الشكل 3. تخطيطي من microinjection morpholino. ألف مكان السمك في طبق مع رئيس الأسماك في خفض درجة من البئر، الأمر الذي سيساعد على الأسماك البقاء مستقرة. باء على التكبير المنخفضة، وترتيب الإبرة بحيث انها قريبة من النسيج تجديد للزعنفة. C. في تضخم أعلى، حقن morpholino البعيدة إلى كل أشعة الزعانف العظمية (أي في كل مأرمة). يجب أن تدخل إبرة في الأنسجة البعيدة فقط للراي عظمي (1)، ثم انتقل إلى موقع مأرمة (2). ملاحظة: وتهدف فقط على الدوائر الخضراء في تخطيطي لتظهر في موقع الحقن. يمكن أن يكون لفترة وجيزة morpholino تصور بأنها "نفخة" أخضر / أصفر بعد كل حقن، ولكن هذا لا تزال قائمة كما هو موضح في التخطيطي.

الشكل 4. تخطيطي من electroporation زعنفة. A. وبعد microinjection، ضع السمك في طبق بيتري كامل من التخدير وelectroporate كلا نصفي ظهري وبطني. B. تأكد من عدم لمس الأنسجة زعنفة. ينبغي أن توضع الأقطاب ~ 1 ملم من الأنسجة.

الشكل 5. تخطيطي من الأساليب المستخدمة لحساب زعنفة تثبيط نمو. ألف التقط صورة للالزعنفة من كل السمك في 2 د ب أ، حقن morpholino إما مباشرة قبل أو بعد وelectroporation. تتبع الأنسجة التجدد من ظهري على حد سواء (الخضراء) وبطني (الأزرق) نصفين من الزعنفة باستخدام المعاهد الوطنية للصحة صورة، (أسود الخطوط المتقطعة). باء في 3 د ب أ، التقاط صورة أخرى من كل زعنفة وتتبع مرة أخرى في المناطق ظهري وبطني من إعادة النمو باستخدام المعاهد الوطنية للصحة صورة. جيم طرح مجال إعادة النمو في 2 د ب أ من إعادة نمو إجمالي في 3 د ب أ عن الأغنياء على حد سواء ظهري وبطني. ويمكن حساب منطقة في المئة من ظهري بطني مقابل إعادة النمو باستخدام صيغة: ((D _3dpa - _{د ب أ} د ₂₎ / (V _3dpa - V _2dpa)) X 100. تثبيط في المئة = 100 - النسبة المئوية المنطقة.

الشكل 6. أمثلة من المتوقعنتائج. ألف صورة نيون تظهر فلوريسئين الموسومة سيطرة morpholino في النصف الظهري للزعنفة، 24 ساعة بعد electroporation (تربية الصحية والبدنية). صورة Brightfield باء من زعنفة التي تم حقن وelectroporated مع morpholino السيطرة في الشوط ظهري . في الصورة تظهر إعادة النمو على قدم المساواة من نصفين كل ظهري وبطني من زعنفة، 24 تربية الصحية والبدنية. جيم Brightfield صورة الزعانف التي تم حقن وelectroporated مع morpholino تجريبي في النصف الظهري. في الصورة تظهر تثبيط إعادة النمو على الجانب الظهري / المحقونة. خط يظهر مقدار من إعادة النمو في 2 د ب أ قبل على الفور، إلى morpholino الحقن وelectroporation.

الشكل 7. تخطيطي من حقنة المناوبين وإجراء electroporation على البروتينات الهدف المشاركة في التئام الجروح وتكوين مأرمة. ألف حقن morpholinoبين كل أشعة الزعنفة عظمي في النصف الظهري من الزعنفة. باء Electroporate في morpholino عاديا. جيم بتر الزعنفة القريبة على الفور (~ 1 قطعة عظمية) إلى موقع الحقن. دال فلوريسئين الموسومة يمكن ملاحظتها morpholino في ظهارة الجرح ومأرمة في 24 تربية الصحية والبدنية.

الرقم 8. باستخدام التقنية لاستهداف ظهارة الجرح وتكوين مأرمة. صورة Brightfield ألف من زعنفة في 24 HPA التي تم حقن وelectroporated مع morpholino الرقابة المسبقة على الفور لبتر. B. صورة نيون من الزعنفة هو مبين في مذكرة ألف لوحة أن النصف المحقونة الظهري للزعنفة يظهر امتصاص جيد للmorpholino في النسيج التجديدي. ج - ج "تضخم أعلى من النصف الظهري من الزعنفة هو موضح في لوحات ألف وباء ومواقع الحقن وغالبا ما تكون واضحة لا يزال (النصال)، ولكن هاجرت العديد من الخلايا المستهدفة للمشاركة في ظهارة الجرح ومأرمة تشكيل (السهم).

الشكل 9. باستخدام التقنية لاستهداف الخلايا التي تهاجر لتشكيل. مأرمة ألف نيون والصور brightfield أقحم يظهر زعنفة حقن وelectroporated مع morpholino على نصفين على حد سواء ظهري وبطني. وقد بترت ثم الزعنفة في طائرتين. وقد قطع نصف ظهري البعيدة على الفور إلى مواقع الحقن، حيث كما تم قطع نصف بطني 9-10 شرائح عظمية البعيدة إلى مواقع الحقن. B. في 24 HPA، الصور الفلورسنت وbrightfield أقحم تبين أن morpholino قد هاجروا إلى ظهري تجديد (1)، ولكن ليس تجديد بطني (2)، مشيرا إلى أن فقط الخلية القريبة على الفور الى موقع القطع المشاركة في تشكيل مأرمة. مجموعتين من رؤوس سهام بيضاء تظهر على مستوى كل بترطائرة. تميزت لوحات 1 و 2 في أقصى اليمين من الصورة تظهر وجهة نظر تضخم أعلى من نصفين ظهري وبطني من الزعانف، على التوالي.

تكميلية الشكل 1. شريط فيديو من كومة-Z مبائر من منطقة المقابلة لمكان وجود مأرمة في زعنفة حقن وelectroporated مع morpholino السيطرة. لقد التقطت الصورة في 24 تربية الصحية والبدنية. منذ جزيء فلوريسئين واحد لا يمكن أن يكون تصور، لا يمكن أن جميع morpholino يمكن تصور أو كميا. ومع ذلك، هذه الصور تعطي فكرة عن درجات متفاوتة من امتصاص ذلك يمكن تصور في الخلايا، من النقاط منقط الفردية، إلى الخلايا كامل كامل من morpholino فلوري. على صورة ثابتة، يظهر اتجاه. مقياس شريط: 25 ميكرون.

Discussion

هنا، نحن تصف قوية الخسارة من وظيفة إلى نهج البروتينات ضربة قاضية مشروط من الاهتمام خلال تجديد الزعانف في الزرد الكبار. وقد استخدمت هذه التقنية لدراسة الجينات تقاطع الفجوة، مما يشير إلى المستقبلات، عوامل النسخ، و microRNAs خلال ثمرة زعنفة التجدد ^{16، 20-22.}

ونحن نتوقع أن هذه التقنية يمكن أيضا أن تستخدم لدراسة الجينات اللازمة لالتئام الجروح وتكوين مأرمة عن طريق تكييف هذه التقنية. على سبيل المثال، نحن وحقن electroporated 1 morpholino التحكم في المسافة بين الزعانف عظمي في النصف الظهري من الزعنفة قبل بتر (الشكل 7). نحن بتر ثم الزعنفة البعيدة على الفور إلى حقن طائرة. 24 HPA، لاحظنا أن الخلايا المستهدفة morpholino هاجروا بشكل أقصى لتشكيل كلا من ظهارة الجرح ومأرمة (الشكل 8)، مشيرا إلى أن الخلايا خلال هذه المراحل المبكرة من التجدد ويمكن أيضا أن targeted.

هذه التقنية لديها عدد قليل من القيود الملحوظة. على سبيل المثال، مضان من العلامة فلوريسئين لا تستمر تثبيت التالية وتجهيز المناعية، مما يجعل من المستحيل لربط النمط الظاهري خاص الخلوية (أي تكاثر الخلايا) مع كمية من morpholino الحالي في خلية. وبالإضافة إلى ذلك، لم نتمكن من تحقيق باستمرار electroporation من البلازميدات في تجديد زعنفة الذيل، على الرغم من أن المجموعة السابقة لم تبلغ عن electroporation ناجح من الحمض النووي في أنسجة فنلندا ^23. أخيرا، لاحظنا أن morpholino فعالة فقط لمدة 48 ساعة ~ electroporation آخر ^{القرن 21،} الذي يحظر استخدام هذه التقنية في شكلها الحالي لاختبار الجينات المسؤولة عن التفريق بين أنواع الخلايا الجديدة. قد يتم إجراء اختبارات إضافية وتعديل إجراءات التغلب على هذه القيود الحالية.

وبالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن أنه يمكن استخدام هذه التقنيةلاختبار البروتينات التي تنطوي عليها الهجرة خلية من النسيج الأساسي للمأرمة. على سبيل المثال، نحن وحقن electroporated تحكم morpholino إلى جانبي الزعنفة (كما هو موضح في الشكل 7) قبل بتر. نحن بتر ثم النصف الظهري من الزعنفة البعيدة مباشرة إلى الطائرة الحقن ونحن بتر الزعنفة البطنية أكثر من ذلك بكثير بشكل أقصى. في 24 HPA، كانت الخلايا morpholino إيجابية على الجانب الظهري هاجروا من موقع حقن لالمغطي ظهارة الجرح ومأرمة. ومع ذلك، كان هذا لا ينطبق على الجانب البطني (الشكل 9). هذا يدعم الفكرة القائلة بأن فقط الخلايا التي تكمن وراء طائرة بتر المشاركة في استجابة التجدد. هذه البيانات تشير أيضا إلى أن يمكن اختبار البروتينات افترض أن تكون هناك حاجة للهجرة الخلية باستخدام هذه التقنية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
CUY21-EDIT أو CUY21-SC ساحة electroporator موجة	بروتك الدولية	CUY21EDIT أو CUY21SC	على حد سواء وحدات العمل لهذا البروتوكول
3 مم أقطاب قطر مجداف	بروتك الدولية	CUY 650-P3
Morpholino	GeneTools، ذ م م		وينبغي Morpholino مصممة خصيصا لبروتين اهتمامك
2-فينوكسي ايثانول	سيغما	77861-1L	التخدير، مخفف 1:1000 في الماء الأسماك لنظام الداخلي، 1:500 للقتل الرحيم
الدقيقة injectiعلى مضخة	الآلات الدقيقة العالم	PV830 هوائي PicoPump	ويمكن استخدام العديد من أنظمة مختلفة microinjection
الدقيقة مناور	الآلات الدقيقة العالم	MMJR	اليد اليمنى (MMJL لالوفاض اليسار)
الدقيقة حقن الإبر، 1.0 ملم خارج القطر	الآلات الدقيقة العالم	1B100F-4	هذه هي البورسليكات الزجاج الشعيرات الدموية، وانسحبت إلى إبرة
إبرة حامل	الآلات الدقيقة العالم	5430-ALL	بيكو كيت الخرطوم، للتأكد من أن أقحم طوقا 1.0 مم ماصة
إبرة مجتذب	سوتر	P-97	وينبغي الأخرى micropipette / إبرة جر العمل أيضا
مجهر	لايكا، نيكون، زايسق	عدد يختلف باختلاف الشركة المصنعة	أي stereomicroscope مع 20x البصرية والقدرة على العمل مع micromanipulators