생성중 성인 Zebrafish 테일 핀으로 Morpholinos의 생체내 Electroporation에

요약

우리는 조건부 성인 zebrafish 지느러미 재생 중에 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 마이크로 주사와 상처 치유, 아체 형성 및 재생 파생물을 포함하여 지느러미 재생의 다양한 단계에서 단백질의 역할을 테스트하고 있습니다 지느러미 조직,에 안티 센스 oligonucleotide의 morpholinos를 electroporating을 포함한다.

초록

urodeles 및 teleost 생선의 일부 종족은 그들의 조직을 재생하실 수 있습니다. Zebrafish는 심장 ^1, 망막 ^2, 척수 ^3, 시신경 ^4, 감각 세포 ^5, 지느러미 ⁶ 등 성인 조직의 자발적인 재생을 연구하기 위해 널리 사용되는 모델이되었습니다.

zebrafish 지느러미는 쉽게 epimorphic 재생에 여러 단계를 공부하기 위해 조작되는 비교적 간단한 부위요입니다. 상처 치유, 아체 형성하고, 지느러미 파생물 : 고전, 지느러미 재생은 세 개의 서로 다른 단계의 특징되었습니다. 지느러미의 일부를 자르기 후, 주변의 상피는 proliferates과 상처를 통해 마이 그 레이션합니다. 33 ° C에서이 프로세스는 ^6,7 (고전력 증폭기, 그림 1B) 육시간 포스트 절단 내에 발생합니다. 다른 lineages (예 뼈, 피, glia, fibroblast)에서 다음, 기본 전지는 다시 입력해야 세포주기 proliferative 아체, W를 형성overlying의 표피는 (그림 1D) ⁸ 분아 따위에 의해 중식 계속 hile. 아체에 근위 세포가 새로운 세포 (그림 1E) ^8을 형성 각각 lineages로 다시 차별화로 가지가 발생합니다. 절단의 수준에 따라 모든 중생은 한달에 일주일 만에 완료됩니다.

wnt, hox, fgf, MSX, retinoic 산성, 쉬, 노치, BMP 및 activin - 베타 유전자를 포함한 유전자 가정의 큰 숫자의 표현이 지느러미 재생 ^9-16의 특정 단계 동안 최대 - 규제입니다. 단백질에 대한 특정 억제제가 ¹³ 존재하지 않는 그러나, 재생하는 동안이 유전자와 그 인코딩된 단백질의 역할은 평가하기 어려울되었습니다, 온도에 민감한 돌연변이가 존재하거나 유전자 변형 동물 (중 overexpressing은 야생 형 단백질 또는 지배 - 부정적인 단백질)은 ^7,12가 생성되었습니다. 우리 developed는 반대로 유전 기법을 빠르고 쉽게 지느러미 재생 중에 어떤 유전자의 기능을 테스트합니다.

Morpholino의 oligonucleotides 널리 zebrafish, Xenopus, 여자, 및 마우스 개발 ^17-19시 특정 단백질의 손실을 공부하는 데 사용됩니다. 블록 사전 mRNA의 접합 또는 mRNA 번역 중으로 보완 RNA 시퀀스로 Morpholinos의 basepair. 우리는 효율적으로 타겟 단백질의 분해가되는 표현까지 재생 zebrafish의 지느러미로 플루오레신 태그가 추가된 안티 센스 morpholinos을 소개하는 방법을 설명합니다. morpholino는 재생 zebrafish 꼬리 지느러미의 각 아체에 마이크로 주입 및 주변 세포에 electroporated있다. 플루오레신는 morpholino을 electroporate하고 지느러미 조직에서 morpholino을 시각화하기 위해 요금을 제공합니다.

이 프로토콜은 재생 지느러미 가지 중 특정 단백질의 역할을 검토하는 조건부 단백질 분해를 허용합니다. Discussio에서N, 우리는이 접근 방식은 상처 치유 또는 아체 형성뿐만 아니라, 아체 형성시 세포 이주의 잠재적인 마커 중에 특정 단백질의 역할을 공부하고 적응하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

1. Resuspend Morpholino

1. 약 3 밀리미터 솔루션을 만들기 위해 nuclease없는 물 100 μl로 플루오레신-태그를 morpholino 300 NM을 희석. morpholino 솔루션은 여러 파라핀 - 밀봉된 microcentrifuge 튜브로 aliquoted 및 실내 온도에서 그리고 멀리 빛과 저장됩니다.
2. 정확한 morpholino 농도를 확인하려면, 0.1 N HCL의 95 μl에 morpholino 용액 5 μl (또는 빈과 같은 물) 희석. 물의 빈과 265 nm의에서 분광 광도계에 대한 기준을 설정하고 희석 morpholino 솔루션의 독서를 결정한다. μl / NG의 농도를 결정하기 위해 결정 상수 의해 희석 요소별로 morpholino의 흡광도를 곱하면됩니다. morpholino의 상수로 계산됩니다 :

   Morpholino 상수 morpholino X 1000/molar의 흡광도의 = 분자량.

   morpholino 대한 분자량과 어금니 흡광도가 "에서 찾을 수 있습니다제품과 함께 제공 Oligo 등록 정보 "시트. MM의 농도를 결정하기 위해 분자량에 의해, μl / NG. morpholino을 희석 필요한 경우 작업 농도로, 일반적으로 1.2 밀리미터에서 morpholino 농도를 나누십시오.

2. 지느러미 절단

1. Tricaine 또는 탱크 물 속에 1.0 밀리그램 / ML에서 2 phenoxyethanol 어느 성인 zebrafish를 마취.
2. 첫 lepidotrichial 분기 지점 근위 무균 메스이나 면도기 칼날을 사용하여 지느러미를 절단. 이것은 각각의 동물에서 같은 말초 / 근위 위치 (지느러미 띠에서 말초 예 : 7 골질 세그먼트)에서 수행되어야합니다. 중요 : 동물의 후부 / 앞부분은 비행기로 완벽하게 수직 절단해야합니다. 각도 인하는 지느러미 지느러미와 복부 반쪽의 고르지 지느러미 가지가 높아집니다.
3. 탱크에 물고기를 반환합니다. 우리는 일반적으로 33에서 물고기를 유지 ° C의 재생 속도를 증가합니다. W, 실험 설계에 따라지느러미 재생을위한 호수 가운데의 작은 섬 0~2일 포스트 절단이 (DPA) morpholino을 도입하기 전에 시작합니다. 대체 접근법은 아래의 토론에서 논의됩니다.

3. Morpholino 분사

1. 이전 morpholino을 주입에 하루, 사출 플레이트 (그림 2)를 확인하십시오. microinjection 절차 물고기를 안정화하는 데 도움이 글쎄, 한 끝에 노치 잘라해야합니다.
2. 이 DPA에서 마이크로 사출 장치와 morpholino 솔루션을 준비합니다.
3. 5 분, 적절한 농도 (1.2 밀리미터로 시작하는 것이 좋습니다)와 65 ° C의 물을 욕조에있는 곳으로 플루오레신 태그가 추가된 morpholino을 희석.
4. 바늘 풀러를 사용하여 마이크로 사출을 위해 유리 바늘을 당기세요.
5. morpholino 같이 바늘을로드합니다 (참고 : 귀하의 바늘을하면 바늘이 처음로드, 또는 먼저 끝을 잘라 여부를 확인하는 것입니다 당신이 채울 또는 프론트로드했는지 여부에 따라).
6. 에서 바늘 오프 팁을 잘라N 각도.
7. 사출 당 morpholino의 약 5 NL 기포를 주입하기 위해 마이크로 분사 시스템의 지시를 따릅니다. morpholino의 더 큰 볼륨 조직을 방해 수 있습니다.
8. 사출 접시의 생선과 장소​​를 마취. 모든 과잉 액체와 적절한 위치에 동양 바늘, 골질 레이 (그림 3)에 단지 말초를 제거합니다. morpholino 주사 (특정 시약의 표 참조)에 적합한 현미경과 microinjection 장치를 사용하여 그림 3에서와 같이 사후에 앞부분의 지느러미로 morpholino 투입. 앞부분에 후부에서 주입하면 지느러미 조직은 주사하는 동안 잠깐 붙였다 인해 매우 어렵습니다.
9. 각 뼈다귀 레이 단지 말초 재생 휴지, (그림 3에서 "1"표시)에 부드럽게 바늘을 삽입하고 (그림 3에서 "2"로 표시) 아체에 위치까지 밀어 distally. EN을 통해 바늘을 밀어하지 않도록주의타이어 지느러미. 바늘이 제대로 현지되면 (즉, 한 번 클릭) morpholino 투입. 1.2 밀리미터에서 플루오레신 태그가 추가된 morpholino 솔루션은 심지어 정상적인 빛 조건에서 황록색 나타납니다. 각 주사로 morpholino 솔루션의 노란색 "퐁퐁"는 시각이 될 수있는가 아체에 주사를 집중하는 데 도움이됩니다. morpholino 솔루션의 약 75 NL (10-15 클릭수는) 뼈다귀 선 당 주입해야합니다. 일시 정지 ~ 클릭 사이의 1 초. 우리는 electroporation 전용 컨트롤로 복부를 사용하여 지느러미 측면만을 주입. 양자 택일로, 하나는 지느러미 복부 이분의 일에 컨트롤 morpholino를 사용하여이 모든 절차를 반복 수 있습니다.

4. Morpholino의 Electroporation

1. 즉시 morpholino의 주입에 따라, 마이크로 분사 장치에서 분사 판을 제거합니다. 물고기 빠져들 때까지 마취 용액과 잘 사출 접시를 채우십시오. electroporation은 물 선 아래 수행됩니다.
<리> 3mm 직경 플래티넘 플레이트 트위터 전극은 (CUY 650-P3 족집게, Protech 국제) 지느러미의 약 절반에 펄스를 localizes. 지느러미 조직에 전극을 만지지 않도록주의하십시오. 전극은 지느러미 조직을 건드리지 않도록하려면 해당 지느러미쪽으로 물고기를 회전하고 바로 electroporation을위한 중간선에 깔고.
2. Electroporate 양쪽 지느러미와 복부 지느러미 측면 CUY21 스퀘어 웨이브 Electroporator을 (Protech 인터내셔널 주식 회사)를 사용하여 (비 특정 electroporation 효과를위한 조종하는). 형성했을 수있는 모든 거품을 제거하기 위해 각 electroporation 후 젖은 KimWipe으로 전극을 닦아주십시오. 그들이 제거되지 않으면 미니 수수료가 발생하고, 전극쪽으로 조직을 유치할 수 있습니다. electroporation 매개 변수는 펄스 사이의 1 초의 일시 정지와 15 V에서, 열 연속 50 밀리초 펄스로 설정되어야합니다.
3. N을 확인하고, 유리 슬라이드 또는 배양 접시에 생선과 빠르게 이미지 지느러미를 배치지느러미 / 복부 방향을 ote. 이 이미지는 다음 날에 regrowth 분석에 사용됩니다. 탱크에 물고기를 반환합니다.

5. 분석

1. 식에 무너 뜨 렸어되었다 타겟 단백질이 적절한 지느러미 재생에 필요한 경우, 지느러미 지느러미와 복부 반쪽 사이 극적인 차이는 분명해야 일일 포스트 electroporation (그림 5B).
2. 3 DPA에서는 각 물고기의 지느러미의 다른 사진을 가지고 대응이 DPA 이미지 (그림 5B)으로 해당 이미지를 매치할. 동물 사이에 지느러미 착색 패턴의 자연스러운 변화는 정확하게 각각의 물고기를 식별할 수 있습니다.
3. NIH 이미지를 사용하여 양쪽 지느러미와 복부 반쪽 (그림 5B)의 2 DPA와 3 DPA 영역을 추적.
4. 지느러미 대 복부 사용 다음 수식의 % 면적 확인하려면 : (- 지느러미 _2dpa 지느러미 _3dpa) /을 _(3dpa 복부 - 복부 _2dpa) X 100 = % 지역

6. 대표 결과

1. 3 DPA, 24 hpe (시간 포스트 electroporation)에서 지느러미 파생물에 대해 우리는 항상 분석. 이때 플루오레신 태그가 추가된 morpholino는 지느러미 지느러미 이분의 일 (보충 그림 1과 그림 6A)에 존재해야합니다. 그것은 일부가 절단 수준 아래로 후행보고 정상입니다.
2. 주입 및 제어 morpholinos (그림 6B)와 electroporated 지느러미의 지느러미와 복부 양측 사이에 차이점이 없어야합니다.
3. 실험 morpholino는 지느러미 파생물을위한 필수적인 단백질을 대상으로하는 경우 지느러미와 복부 양측 간의 극적인 차이는 (그림 6C) 관찰해야합니다.
4. 전극은 electroporation 동안 지느러미를 건드리지 않으면 조직은 갈색 (거의 외모에 소실)과 괴사가 나타납니다.

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그림 1. 지느러미 재생하는 동안 발생하는 다양한 이벤트의 도식. 각 이벤트에 대한 기본 시간은 시간 후 절단 (고전력 증폭기)에 주어진 33의 탱크 온도에 대응 ° C를하고 있습니다

그림 2. A. 아가로 오스에서 만들어 morpholino의 microinjection 동안 물고기를 잡아 두 기엔 잘 소형을 포함하는 사출 접시의 개략도.

그림 3. morpholino의 microinjection의 도식. A.이 장소 노치에서 생선 머리 접시에 물고기가 물고기가 안정적으로 유지하는 데 도움이됩니다 자, 밖으로 했네요. B. 낮은 배율에서 바늘을 마련 그러세요 그것은 지느러미 재생 조직 가까운 거리에 있습니다. C.이 는 각 골질 지느러미 선 (각 아체의 예)에 말초 morpholino 투입. 바늘은 골질 레이 (1) 단지 말초 조직을 입력한 다음 아체 (2)의 위치를​​ 계속해야합니다. 참고 : 회로도에서 녹색 동그라미에만 분사의 위치를​​ 보여주기위한 것입니다. morpholino 간단히 각 분사에 따라 노란색 / 녹색 "퐁퐁"로 시각이 될 수 있으며, 설계도를 같이하지만, 이것은 유지되지 않습니다.

그림 4. 지느러미 electroporation의 개략도. A. microinjection 따라 마취 가득찬 배양 접시에있는 생선을 배치하고 지느러미 및 복부 반쪽을 모두 electroporate. 하군요 지느러미 조직을 건드리지해야합니다. 전극은 조직에서 ~ 1mm를 배치해야합니다.

그림 5. 지느러미 가지 억제를 계산하는 데 사용되는 방법의 도식. A. 2 DPA, 바로 앞 또는 뒤에 중 morpholino 주입과 electroporation 각 물고기의 지느러미 사진 찍어봐. 지느러미 (녹색)와 3 DPA에서 NIH 이미지 (검정색 점선 라인). B를 사용하여 지느러미 복부 (파란색) 반쪽 모두의 재생 조직을 추적하고, 각 지느러미의 또 다른 사진을 찍을 다시 지느러미와 복부 부분을 더듬다 NIH 이미지를 사용 regrowth으로. C.는 지느러미와 복부 분리 모두 3 DPA에서 총 regrowth에서 2 DPA에서 regrowth의 영역을 뺍니다. 지느러미 대 재 성장 복부의 퍼센트 영역은 수식을 사용하여 계산할 수 : ((D _3dpa - D _{DPA 2)} / (V _3dpa - V _2dpa)) X 100. %의 억제 = 100 - 퍼센트 지역.

기대의 그림 6. 예결과. 지느러미 지느러미 반으로 플루오레신 태그가 추가된 컨트롤 morpholino을 보여주는 A. 형광 이미지, 지느러미 반으로 주입 및 제어 morpholino로 electroporated되었다 지느러미 24 시간 이후 electroporation (hpe). B. Brightfield 이미지 . 이미지는 지느러미, 24 hpe의 지느러미와 복부 반쪽 모두 동등 regrowth를 보여줍니다. 지느러미 반으로 실험 morpholino 주사와 electroporated되었다 지느러미 C. Brightfield 이미지입니다. 이미지 주입 / 지느러미쪽에 regrowth의 억제를 보여줍니다. 라인은 morpholino 주입과 electroporation ~ 2 DPA, 즉시 이전의 regrowth의 양을 보여줍니다.

그림 7. 상처 치유와 아체 형성에 관여 대상 단백질에 대한 대체 분사와 electroporation 절차 도식. 대답 morpholino을 주사지느러미 지느러미 이분의 일의 각 골질 지느러미 선 사이. B.는 정상에 따라 morpholino을 Electroporate. C.는 주사 사이트 (~ 1 골질 세그먼트) 즉시 근위 지느러미를 절단. 디 플루오레신 태그가 추가된 morpholino을 볼 수 있습니다 24 hpe의 상처 상피와 아체 인치

지느러미의 바로 전에 절단에 주입 및 제어 morpholino로 electroporated되었다 24 고전력 증폭기의 지느러미 그림 8. 상처 상피와 아체 형성을 타겟으로하는 기술을 사용합니다. A. Brightfield 이미지입니다. B. 형광 이미지는 패널 A. 참고로 표시 지느러미의 주입 지느러미 절반 재생 조직의 morpholino을 잘 이해를 보여줍니다. C -. 패널에 표시된 지느러미 지느러미 절반 C "를 높은 배율와 B 사출 사이트는 종종 여전히 볼 수 있습니다 (화살촉)하지만, 많은 타겟 세포는 상처의 상피와 아체 형성 (화살표)에 참여하도록 마이 그 레이션했습니다.

그림 9. 아체. A. 형광등과 지느러미와 복부 반쪽 모두에서 주입하고 morpholino 함께 electroporated 지느러미를 보여주 brightfield 삽입된 페이지 이미지를 형성하도록 마이 그 레이션하는 세포를 대상으로 기술을 사용합니다. 지느러미 그런 다음 두 비행기에서 절단되었다. 지느러미 절반 복부 절반 사출 사이트에 대한 말초 9-10 골질 세그먼트를 잘라 어디로로 주입 사이트에 즉시 말초 절단되었다. B. 24 고전력 증폭기에서 형광 및 brightfield 삽입된 페이지 이미지 morpholino가 지느러미으로 이전했음을 보여주 (1)하지만, 복부 재생 (2), 컷 사이트에 즉시 근위만이 세포 아체 형성에 참여한다는 의미가 아닌 재생. 하얀 화살촉의 두 세트는 각 절단의 수준을 보여비행기. 패널은 각각 지느러미 지느러미와 복부 반쪽의 높은 배율의 전경을 보여주 이미지의 맨 오른쪽에 1과 2를 표시했습니다.

보충 그림 1. 주입 및 제어 morpholino로 electroporated 지느러미에있는 아체의 위치에 해당하는 지역의 공촛점 Z-스택의 비디오. 이미지 24 hpe에서 찍은. 단일 플루오레신 분자를 시각적으로 될 수 있기 때문에 모든 morpholino 중 시각적으로 계량이 될 수 있습니다. 그러나 이러한 이미지는 형광등 morpholino의 전체 전체 세포에 대한 개별적인 작은 반점이있는 점들의 세포에서 시각이 될 수있는 이해의 괴팍한도 몇 가지 아이디어를 제공합니다. 정지 영상에서 오리 엔테이션이 나타납니다. 스케일 바 : 25 마이크론.

토론

여기서는 성인 zebrafish의 지느러미 재생 중에 관심 조건부 최저의 단백질에 대한 강력한 손실 함수 접근법을 설명합니다. 이 기술은 재생 지느러미 파생물 ^{16, 20-22시} 수용체, 전사 요인과 microRNAs 신호, 갭 접합 유전자를 연구하는 데 사용되었습니다.

우리는이 기법도 기법을 채택하여 상처 치유와 아체 형성에 필요한 유전자를 연구하는 데 사용될 수 있다고 기대하고 있습니다. 예를 들어, 우리는 주입하고 (그림 7) 이전에 절단까지 지느러미 지느러미 이분의 일에 골질 지느러미 선 사이의 공간에서 컨트롤 morpholino을 electroporated. 그러면 주사 비행기로 즉시 말초 지느러미를 절단. 24 고전력 증폭기, 우리는 중생의 이러한 초기 단계 동안에 세포는 또한 targ 수 나타내는 morpholino 타겟 세포가 상처의 상피와 아체 (그림 8)을 모두 형성 distally 마이 그 레이션 것을 관찰eted.

기술은 몇 가지 중요한 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 플루오레신 태그의 형광은 불가능 세포에 존재 morpholino의 금액으로 특정 세포 표현형 (예 : 세포 증식) 신원을 확인하도록하게 immunohistochemistry을 위해 다음과 같은 고정 및 처리를 유지하지 않습니다. 이전 그룹 지느러미 조직 ^23로 DNA의 성공적인 electroporation을 신고했지만 이외에도, 우리는 일관되게 재생 꼬리 지느러미에 plasmids의 electroporation을 달성하지 못하고 있어요. 마지막으로, 우리는 morpholino가 ~ 48시간 새로운 세포 유형의 분화에 관련된 유전자를 테스트하기 위해 현재의 형태로이 기술을 사용 금지 포스트 electroporation ^21에만 효과가 있다고 지적했습니다. 절차의 추가적인 테스트와 수정이 현재의 한계를 극복 있습니다.

또한,이 기술이 사용될 수있는 가능성이기본 조직에서 아체까지 셀 마이 그 레이션과 관련된 단백질을 테스트합니다. 예를 들어, 주입 및 절단 이전 지느러미의 양쪽합니다 (그림 7에 설명되어)로 제어 morpholino을 electroporated. 그러면 주사 비행기로 즉시 말초 지느러미 지느러미 절반을 절단하고 우리는 훨씬 더 distally 복부 지느러미를 절단. 24 고전력 증폭기에서 지느러미쪽에 morpholino-긍정 세포 주사 사이트에서 overlying 상처의 상피와 아체로 마이 그 레이션했다. 그러나, 복부 측면 (그림 9)에서 사건 아니었어요. 이것은 절단 평면을 기초에만 세포가 재생 반응에 참여한다는 생각을 지원합니다. 이러한 데이터는 또한 세포 마이 그 레이션 요구하는 가상 단백질이이 기술을 사용하여 테스트할 수있는 것이 좋습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CUY21-EDIT 또는 CUY21-SC 광장 물결 electroporator	Protech 국제	CUY21EDIT 또는 CUY21SC	두 단위는이 프로토콜을 위해 일하는
3 밀리미터 직경 패들 전극	Protech 국제	CUY 650-P3
Morpholino	GeneTools, LLC		Morpholino은 관심의 단백질에 맞춤 설계되어야
2 - Phenoxyethanol	시그마	77861-1L	마취; 절차 생선 시스템 물에 묽은 1:1000, 안락사에 대한 1:500
마이크로 injecti펌프에서	세계 정밀 계측기	PV830 공압 PicoPump	다양한 microinjection 시스템은 사용할 수
마이크로 조작하는 사람	세계 정밀 계측기	MMJR	오른손잡이 (왼손잡이를위한 MMJL)
미세 분사 바늘, 직경 외부 1.0 mm	세계 정밀 계측기	1B100F-4	이들은 주사 바늘로 뽑았 borosilicate 유리 모세관입니다
니들 홀더	세계 정밀 계측기	5430 - ALL	피코 노즐 키트, 삽입된 페이지 1.0 mm 피펫 가스켓으로 확인
니들 풀러	셔터	P-97	기타 micropipette / 바늘 pullers도 작동합니다
현미경	Leica, 니콘, Zeis의	숫자는 제조 업체에 따라 다름	20X 광학을 가진 stereomicroscope과 마이크로 작업할 수있는 능력