ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך למבוגרים התחדשות זנב סנפיר דג הזברה

Summary

אנו מתארים שיטה תנאי מציאה ביטוי של חלבון המטרה במהלך רגנרציה דג הזברה למבוגרים סנפיר. טכניקה זו כוללת מיקרו הזרקה ו electroporating oligonucleotide morpholinos antisense לרקמת סנפיר, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של חלבון בשלבים שונים של התחדשות סנפיר, כולל ריפוי פצעים, יצירת blastema, ואת תוצאה רגנרטיבית.

Abstract

מינים מסוימים של urodeles ודגים teleost יכול לחדש רקמות שלהם. דג הזברה הפכו להיות מודל נפוץ ללמוד התחדשות ספונטנית של רקמות בוגרות, כמו הלב ^{1, 2} הרשתית, חוט השדרה ^3, עצב הראייה, ⁴ תאים שיער חושי ^{5, 6} ו סנפירים.

סנפיר דג הזברה הוא תוספת פשוטה יחסית, כי הוא לטפל בקלות ללמוד בשלבים מרובים התחדשות epimorphic. קלאסי, התחדשות סנפיר התאפיין בשלושה שלבים ברורים: ריפוי פצעים, יצירת blastema, ואת תוצאה סנפיר. לאחר קטיעת חלק סנפיר, האפיתל סביב proliferates ו נודד על פני הפצע. ב 33 מעלות צלזיוס, תהליך זה מתרחש בתוך שש שעות לאחר קטיעה (hPa, איור 1 ב) ^6,7. בשלב הבא, התאים הבסיסיים של שושלות שונות (שמות עצם, דם, גליה, פיברובלסטים) להזין מחדש את מחזור התא כדי ליצור blastema שגשוג, Wבשעה שהייתי האפידרמיס שמעליה ממשיך להתרבות (איור 1D) ^8. תוצאה מתרחשת כאשר התאים בקרבה blastema מחדש להתמיין שושלות של כל אחד מהם כדי ליצור רקמה חדשה (איור 1 ד) ^8. תלוי ברמה של קטיעה, התחדשות מלאה ניתנת תוך שבוע עד חודש.

ביטוי במספר רב של משפחות גנים, כולל Wnt, hox, FGF, MSX, חומצה רטינואית, ששש, חריץ, BMP ו-activin בטא גנים, הוא מעלה מוסדר בשלבים מסוימים של סנפיר התחדשות ^9-16. עם זאת, את התפקידים של גנים וחלבונים אלה מקודדים שלהן במהלך רגנרציה היה קשה להעריך, אלא אם כן מעכב ספציפי של חלבון קיים ^13, מוטציה הטמפרטורה רגיש קיים או בעל חיים מהונדס (או overexpressing חלבון wild-type או הדומיננטית שלילי חלבון) נוצר ^7,12. אנחנו develoPED טכניקה גנטית הפוכה במהירות ובקלות לבדוק את הפונקציה של הגן במהלך כל התחדשות סנפיר.

Oligonucleotides morpholino נמצאים בשימוש נרחב ללמוד אובדן חלבונים ספציפיים במהלך דג הזברה, Xenopus, אפרוח, עכבר ופיתוח ^17-19. Morpholinos basepair עם רצף RNA משלים splicing או לחסום מראש mRNA או תרגום ה-mRNA. אנו מתארים שיטה יעילה להציג את fluorescein-מתויג antisense morpholinos אל סנפירי דג הזברה התחדשות לביטוי מציאה של חלבון המטרה. Morpholino הוא מיקרו מוזרק blastema כל סנפיר זנב דג הזברה התחדשות ו electroporated לתוך התאים הסמוכים. Fluorescein מספק תשלום electroporate morpholino וכדי להמחיש morpholino ברקמת הסנפיר.

פרוטוקול זה מאפשר מציאה חלבון מותנה כדי לבחון את התפקיד של חלבונים ספציפיים במהלך תוצאה סנפיר רגנרטיבית. ב Discussion, אנו מתארים כיצד גישה זו ניתן להתאים ללמוד את התפקיד של חלבונים ספציפיים במהלך ריפוי פצעים או היווצרות blastema, כמו גם סמן הפוטנציאל של נדידת תאים במהלך היווצרות blastema.

Protocol

1. Resuspend morpholino

1. לדלל 300 ננומטר של fluorescein-מתויג morpholino אל μl 100 מים nuclease ללא להפוך את פתרון 3 מ"מ בערך. הפתרון הוא morpholino aliquoted אל פרפין חתום צינורות מרובים microcentrifuge ומאוחסנים בטמפרטורת החדר, הרחק מן האור.
2. כדי לקבוע את הריכוז המדויק morpholino, לדלל 5 μl של פתרון morpholino (או מים ריק) ב 95 μl של 0.1 N HCl. הגדרת הבסיס על ספקטרופוטומטר ב 265 ננומטר עם ריק מים ולאחר מכן לקבוע את קריאת פתרון morpholino בדילול מלא. להכפיל את ספיגת morpholino ידי קבוע שנקבע שלה על ידי גורם דילול כדי לקבוע את ריכוז ng / μl. קבוע morpholino מחושב:

   Morpholino קבוע = משקל מולקולרי של ספיגת X 1000/molar morpholino.

   משקל מולקולרי ספיגת טוחנת על morpholino ניתן למצוא באתר "Oligo מאפיינים "גיליון מסופק עם המוצר. מחלקים את ריכוז morpholino, ב ng / μl, לפי משקל מולקולרי כדי לקבוע את הריכוז מ"מ. מדולל morpholino, במידת הצורך, כדי ריכוז בעבודה מ"מ, 1.2 בדרך כלל.

2. סנפיר קטיעה

1. להרדים דג הזברה הבוגרת או Tricaine או 2-phenoxyethanol על 1.0 מ"ג / מ"ל ​​מים במיכל.
2. לכרות סנפיר באמצעות סכין גילוח או אזמל סטרילי הפרוקסימלי עד 1 הסתעפות lepidotrichial. זה צריך להיעשות במקום הפרוקסימלי / דיסטלי אותו על כל חיה (למשל 7 קטעים הגרומות דיסטלי מן המחוך סנפיר). חשוב: לוודא לחתוך לחלוטין בניצב למישור הקדמי / האחורי של החיה. קיצוצים זווית תגרום תוצאה סנפיר אחיד של חצאי הגב ואת הגחון של סנפיר.
3. להחזיר את הדגים לאקווריום. אנחנו בדרך כלל לשמור את הדגים על 33 ° C כדי להגביר את קצב התחדשות. בהתאם לעיצוב ניסיוני, WAIT 0-2 ימים שלאחר קטיעה (DPA) עבור התחדשות סנפיר להתחיל לפני מציגה morpholino. גישות חלופיות נדונים הדיון, להלן.

3. Morpholino Injection

1. יום לפני הזרקת morpholino, להפוך את הצלחת ההזרקה (איור 2). הקפד לחתוך חריץ בקצה אחד של טוב, שעוזר לייצב את הדגים עבור ההליך microinjection.
2. ב 2 DPA, להכין את מערך מיקרו הזרקה פתרון morpholino.
3. לדלל את morpholino fluorescein-מתויג לריכוז הנכון (ממליץ להתחיל עם 1.2 מ"מ) ומניחים באמבט מים C ° 65, במשך 5 דקות.
4. משוך את המחט זכוכית הזרקת מיקרו באמצעות מחט חולץ.
5. טען את מחט עם morpholino (הערה: תלוי אם אתה גב מילוי או הקדמי לטעון המחט שלך תקבע אם אתה טוען המחט הראשונה, או לחתוך את קצה 1).
6. חותכים את קצה המחט בn זווית.
7. בצע את ההוראות של המערכת מיקרו הזרקה להזריק בועה כ 5 NL של morpholino לכל זריקה. כמויות גדולות יותר של morpholino יכול לשבש את הרקמה.
8. להרדים את הדג ומניחים על צלחת ההזרקה. הסר את כל נוזל עודף לכוון את המחט למקום המתאים, דיסטלי רק כדי ray הגרמית (איור 3). באמצעות מיקרוסקופ ומכשירים microinjection מתאים morpholino זריקות (ר 'טבלה של חומרים כימיים מסוימים), להזריק לתוך morpholino סנפיר מן הקדמי אל האחורי, כפי שמוצג באיור 3. הזרקת מ האחורי אל הקדמי גורם רקמות סנפיר להפשיל במהלך ההזרקה הוא קשה מאוד.
9. הכנס את המחט בעדינות לתוך רקמת רגנרטיבית, דיסטלי רק כדי ray כל גרמי (מסומן "1" באיור 3) ולדחוף distally עד הממוקם blastema (מסומן "2" באיור 3). להיזהר לא לדחוף את המחט דרך enסנפיר הצמיג. כאשר מחט מותאמת בצורה נכונה, להזריק morpholino (כלומר ללחוץ פעם אחת). ב 1.2 מ"מ, הפתרון fluorescein-מתויג morpholino נראה צהוב, ירוק, גם בתנאי תאורה רגילים. עם כל הזרקה, "עלים" הצהוב של פתרון morpholino ניתן דמיינו, אשר מסייע לתהליך הלוקליזציה של זריקה כדי blastema. כ 75 NL (10-15 קליקים) של פתרון morpholino צריך להיות מוזרק לכל קרן גרמי. השהה ~ 1 שניות בין קליקים. אנחנו רק להזריק בצד הגב, באמצעות הגחון כביקורת electroporation בלבד. לחלופין, אפשר לחזור על התהליך כולו באמצעות morpholino שליטה על מחצית הגחון של סנפיר.

4. Electroporation של morpholino

1. מיד לאחר הזרקת morpholino, להסיר את הצלחת של מנגנון הזרקת מיקרו הזרקה. מלאו את הצלחת הזרקת היטב עם פתרון הרדמה עד דגים הוא מתחת למים. Electroporation מבוצע מתחת לקו המים.
2. פלטינה 3 מ"מ קוטר צלחת פינצטה האלקטרודה (CUY 650-P3 מלקטת, Protech הבינלאומי) localizes להבזקי למחצית בקירוב של סנפיר. היזהר שלא לגעת אלקטרודות לרקמות סנפיר. על מנת להבטיח כי האלקטרודות לא נוגעים רקמות סנפיר, לסובב את הדג על הצד הגבי שלה להישיר מבט אל קו האמצע של electroporation.
3. Electroporate הן את הגב ואת הגחון (כדי לשלוט על כמה תופעות לא ספציפיות electroporation) הצדדים של סנפיר באמצעות CUY21 כיכר גל Electroporator (Protech International, Inc). נגבו את האלקטרודות עם KimWipe לחה לאחר כל electroporation להסיר בועות שעלולות יצרו. אם הם לא יוסרו, מיני תשלום מצטבר, אשר ימשוך את הרקמות אל האלקטרודה. הפרמטרים electroporation יש להגדיר 10 ברציפות 50 msec קטניות, ב V עם 15 שניות הפסקה 1 בין הפולסים.
4. מניחים את הדגים על השקופית כוס או צלחת פטרי ובמהירות התמונה סנפיר, והקפד nOTE אוריינטציה הגב / הגחון. תמונה זו תשמש לצורך ניתוח לצמיחה מחודשת למחרת. להחזיר את הדגים לאקווריום.

5. אנליזה

1. אם חלבון ממוקד אשר הפילו בביטוי נדרש התחדשות סנפיר נכון, הבדל דרמטי בין חצאי הגב ועל הגחון של סנפיר צריך להיות ברור 1 ביום שלאחר electroporation (5 ב איור).
2. ב 3 DPA, לצלם תמונה נוספת של סנפיר דג זה ולהתאים את התמונה עם תמונה 2 המקביל DPA (5 ב איור). וריאציה טבעית במרקם סנפיר פיגמנטציה בין בעלי חיים יאפשר לך לזהות נכון דגים הפרט.
3. באמצעות תמונה NIH, להתחקות אחר 2 תחומים DPA DPA ו 3 של שני חצאים הגב ועל הגחון (איור 5 ב).
4. כדי לקבוע את תחום השימוש הגבי% לעומת הגחון את הנוסחה הבאה: (הגב _3dpa - הגב _2dpa) / (הגחון _3dpa - _2dpa הגחון) X 100% = שטח

6. נציג תוצאות

1. אנחנו תמיד assay עבור תוצאה סנפיר על hpe 3 DPA, או 24 (שעות electroporation הודעה). בשלב זה, fluorescein-מתויג morpholino צריך להיות נוכח 1/2 של סנפיר הגב (איור 1, איור משלים 6 א). זה נורמלי לראות כמה נגרר לרמה של קטיעה.
2. לא צריך להיות שום הבדל בין הצדדים ואת הגב סנפיר הגחון ב הזריק electroporated עם morpholinos הביקורת (איור 6 ב).
3. אם morpholino ניסיוני מטרות חלבון חיוני תוצאה סנפיר, ההבדל הדרמטי בין הצדדים ואת הגב הגחון יש לשים לב (איור 6C).
4. אם האלקטרודה נגע סנפיר במהלך electroporation, רקמות יופיע חום (כמעט שרוף בהופעה) ו נמקי.

"Src =" / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg "/>
באיור 1. סכמטי של האירועים השונים המתרחשים במהלך התחדשות סנפיר. פעמים את הבסיס עבור כל אירוע ניתנות שעות לאחר קטיעה (hPa), ומתאימים הטמפרטורה במיכל של 33 ° C.

איור 2. א סכמטי של הצלחת ההזרקה, אשר עשוי agarose ומכיל קטן גם להחזיק את הדגים במהלך microinjection של morpholino.

איור 3. סכמטי של microinjection morpholino. מקום א 'הדג בצלחת עם ראש של דג ב החריץ בנוי היטב, אשר יסייעו דגים להישאר יציב. ב בהגדלה נמוכה, לארגן את המחט כך היא קרובה רקמות התחדשות של סנפיר. ג ng בהגדלה גבוהה יותר, להזריק morpholino דיסטלי לקרן כל סנפיר גרמית (כלומר בכל blastema). המחט צריכה להזין את רקמת דיסטלי רק כדי ray הגרמית (1), ולאחר מכן להמשיך אל המיקום של blastema (2). הערה: את העיגולים ירוקים סכמטי נועדו רק כדי להראות את מיקום ההזרקה. Morpholino יכול בקצרה דמיינו כמו "עלים" ירוק / צהוב לאחר כל הזרקה, אך זה לא מתעקש כפי שמוצג סכמטית.

איור 4. סכמטי של electroporation סנפיר. א 'בעקבות microinjection, הצב את הדג בצלחת פטרי מלא הרדמה electroporate שני חצאים הגב ועל הגחון. ב הקפד שלא לגעת רקמות סנפיר. האלקטרודות צריך להיות ממוקם ~ 1 מ"מ מרקמות.

איור 5. סכמטי של האמצעים שננקטו כדי לחשב תוצאה עיכוב סנפיר. א 'קח תמונה של סנפיר דג אחד ב 2 DPA זריקה, morpholino או מיד לפני או אחרי ו electroporation. עקוב אחר רקמות רגנרטיבית של הגב הן (ירוק) ועל הגחון (כחול) חצאי הסנפיר באמצעות תמונה NIH, (קווים מקווקווים שחורים). ב 'בשעה 3 DPA, לצלם תמונה נוספת של סנפיר כל פעם לאתר את אזורי הגב ועל הגחון של לצמיחה מחודשת באמצעות תמונה NIH. ג להפחית את שטח של לצמיחה מחודשת על 2 מ DPA לצמיחה מחודשת על סך 3 DPA הן שיהיו ברשותך את הגב ואת הגחון. אזור אחוזים לעומת הגב הגחון מחדש את הצמיחה ניתן לחשב באמצעות הנוסחה: ((D _3dpa - ד _{2 DPA)} / (V _3dpa - V _2dpa)) X 100. אחוז עיכוב = 100 - שטח אחוז.

איור 6. דוגמאות צפויתוצאות. תמונה א פלורסנט מראה fluorescein-מתויג השליטה morpholino במחצית הגב של סנפיר, 24 שעות לאחר electroporation (hpe). ב brightfield דמותו של סנפיר אשר הזריק electroporated עם morpholino השליטה במחצית הגב . התמונה מראה צמיחה מחדש שווה של שני חצאים הגב ועל הגחון של סנפיר, 24 hpe. ג תמונה brightfield של סנפיר אשר הזריק electroporated עם morpholino ניסיוני במחצית הגב. התמונה מראה עיכוב לצמיחה מחודשת בצד הגב / מוזרק. הקו מציג את כמות לצמיחה מחודשת על 2 DPA, מיד לפני ההזרקה morpholino ו electroporation.

איור 7. סכמטי של הזרקה חלופי הליך electroporation לחלבונים היעד מעורב ריפוי הפצע והיווצרות blastema. א להזריק את morpholinoבין קרני סנפיר כל גרמי על 1/2 של סנפיר הגב. ב Electroporate morpholino לפי נורמלי. ג לקטוע את סנפיר בקרבה מיידית (~ 1 קטע גרמי) כדי הזריקה. ד fluorescein-מתויג morpholino ניתן לצפות ב האפיתל הפצע blastema ב hpe 24.

איור 8. שימוש בטכניקה זו כדי למקד האפיתל הפצע והיווצרות blastema. א תמונה brightfield של סנפיר על 24 hPa אשר הזריק electroporated עם morpholino הבקרה מיד לפני קטיעה. תמונה ב הניאון של סנפיר שמוצג הערה א 'לוח כי 1/2 הגב מוזרק של סנפיר מראה ספיגת טוב morpholino ברקמות רגנרטיבית. C -. C "הגדלה גבוהה של 1/2 של סנפיר הגב שמוצג לוחות A ו-B המוזרקים הם בדרך כלל גלויים עדיין (ראשי חץ), אבל התאים הממוקדים רבים היגרו להשתתף האפיתל הפצע והיווצרות blastema (החץ).

איור 9. שימוש בטכניקה זו כדי למקד את התאים הנודדים לטופס. Blastema א פלורסנט ותמונות brightfield הבלעה מראה סנפיר הזריק electroporated עם morpholino משני חצאים את הגב ואת הגחון. סנפיר נקטעה אז בשני מישורים. 1/2 הגב נחתך דיסטלי מיד את המוזרקים, שם כמו 1/2 הגחון נחתך 9-10 חלקים הגרומות דיסטלי לאתרים הזרקה. ב 'בשעה 24 hPa, התמונות הבלעה הניאון brightfield מראים כי morpholino העביר את הגב להתחדש (1), אך לא מתחדשים הגחון (2), המציין כי רק תא בקרבה מיידית לאתר את החתך להשתתף היווצרות blastema. שני סטים של ראשי חצים לבנים להראות את הרמה של כל קטיעההמטוס. לוחות מסומנים 1 ו 2 בקצה הימני של התמונה מראה נוף בהגדלה גבוהה יותר של חצאי הגב ועל הגחון של סנפיר, בהתאמה.

משלימה איור 1. וידאו של מחסנית-Z confocal האזור המתאים למיקום של blastema ב סנפיר הזריק electroporated עם morpholino שליטה. התמונה צולמה ב hpe 24. מאז מולקולה fluorescein אחד לא יכול להיות חזותי, לא כל morpholino ניתן דמיינו או לכמת. עם זאת, התמונות האלה נותנים מושג כלשהו על דרגות שונות של ספיגת שניתן דמיינו בתאים, מן נקודות punctate בודדים, לתאי שלמים מלאים morpholino ניאון. על התמונה עדיין, כיוון מוצג. סרגל קנה מידה: 25 מיקרון.

Discussion

כאן, נתאר גישה חזקה אובדן-of-פונקציה תנאי חלבונים מציאה של עניין במהלך רגנרציה של סנפיר דג הזברה מבוגר. טכניקה זו נעשה שימוש כדי ללמוד צומת גנים הפער, איתות קולטנים, גורמי תעתוק, וכן מיקרו RNA במהלך תוצאה סנפיר משובי ^{16, 20-22.}

אנו צופים כי טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד את הגנים הדרושים ריפוי הפצע והיווצרות blastema ידי התאמת הטכניקה. לדוגמה, אנו הזריק electroporated morpholino השליטה במרחב שבין קרני סנפיר הגרומות על 1/2 של סנפיר הגב לפני קטיעה (איור 7). אנחנו קטוע אז סנפיר דיסטלי מיד למטוס ההזרקה. 24 hPa, צפינו כי morpholino במיקוד התאים נדדו distally להקים גם אפיתל הפצע blastema (איור 8), המציין כי תאים בשלבים הראשונים של התחדשות ניתן טארגeted.

הטכניקה יש כמה מגבלות בולטות מעט. כך, למשל, הקרינה מ תג fluorescein לא מתעקש קיבוע עיבוד הבאה ועל אימונוהיסטוכימיה, מה שהופך את זה בלתי אפשרי לקשר בין פנוטיפ הסלולר בפרט (כלומר ריבוי תאים) עם כמות של morpholino הנוכחי בתא. בנוסף, אנו לא הצליחו באופן עקבי להשיג את electroporation של פלסמידים לתוך סנפיר הזנב התחדשות, אם כי הקבוצה הקודמת לא לדווח electroporation מוצלח של ה-DNA לתוך רקמת הסנפיר ^23. לבסוף, יש לנו לציין כי morpholino הוא יעיל רק עבור 48 שעות ~~~HEAD=NNS electroporation הודעה ^21, האוסר על שימוש בטכניקה זו במתכונתה הנוכחית לבדיקת גנים המעורבים בידול של סוגי תאים חדשים. בדיקות שינוי נוסף של ההליך עשוי להתגבר על המגבלות האלה הנוכחי.

בנוסף, ייתכן כי טכניקה זו יכולה לשמשכדי לבדוק את החלבונים המעורבים נדידת תאים מרקמות הבסיס כדי blastema. לדוגמה, אנו הזריק electroporated השליטה morpholino לתוך שני הצדדים של סנפיר (כמתואר באיור 7) לפני קטיעה. אנחנו נקטעה ואז 1/2 של סנפיר הגב דיסטלי מיד למטוס הזרקת ואנחנו קטוע סנפיר הגחון הרבה יותר distally. בגיל 24 hPa, את morpholino חיובי תאים בצד הגבי נדדו מאתר ההזרקה כדי האפיתל שמעליה הפצע blastema. עם זאת, כי לא היה המקרה בצד הגחון (איור 9). זה תומך ברעיון רק את התאים העומדים בבסיס מטוס קטיעה להשתתף בתגובה רגנרטיבית. נתונים אלה מראים גם כי חלבונים שיערו להידרש נדידת תאים ניתן לבדוק באמצעות טכניקה זו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
CUY21-edit או CUY21-SC Square גל electroporator	PROTECH הבינלאומי	CUY21EDIT או CUY21SC	יחידות שניהם עובדים על פרוטוקול זה
3 מ"מ בקוטר ההנעה אלקטרודות	PROTECH הבינלאומי	CUY 650-P3
Morpholino	GeneTools, LLC		Morpholino יש מנהג שנועד חלבון העניין שלך
2-Phenoxyethanol	סיגמא	77861-1 ליטר	הרדמה: 1:1000 לדלל במים המערכת דגים ההליך, 1:500 על המתת חסד
מיקרו injectiעל המשאבה	Precision של מכשירים בעולם	PV830 אוויר PicoPump	רבים מערכות microinjection שונים יכול לשמש
מיקרו מניפולטור	Precision של מכשירים בעולם	MMJR	ימני (MMJL עבור שמאלי)
מיקרו הזרקה, מחטים 1.0 מ"מ קוטר חיצוני	Precision של מכשירים בעולם	1B100F-4	אלה הם ההתכה של זכוכית בורו הנימים, נכנס מחט
מחט בעל	Precision של מכשירים בעולם	5430-ALL	פיקו Nozzle Kit, הקפד הבלעה מ"מ 1.0 פיפטה אטם
מחט חולץ	סאטר	P-97	אחרים micropipette / מחט מושכי צריך גם לעבוד
מיקרוסקופ	לייקה, ניקון, Zeisשל	מספר משתנה בהתאם ליצרן	כל סטראו עם 20x אופטיקה ואת היכולת לעבוד עם micromanipulators