JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن تصف مقايسة التشخيص القيمة التي يمكن استخدامها لاتخاذ قرار الانسحاب من كبت المناعة بعد زرع من دون مخاطر مرتفعة من رفض الكسب غير المشروع. يستخدم فحص مبادئ تأخر نوع فرط الحساسية ويوفر تقييم دقيق لكلا المانحة محددة المستجيب والتنظيمية الاستجابات المناعية التي شنت من قبل المستفيدين.

Abstract

تأخر استجابة من نوع فرط الحساسية (DTH) هو سريع في مظهر الجسم الحي من T الاستجابة المناعية التي تعتمد على خلية لمستضد الأجنبية (AG) أن النظام المناعي المضيف شهدت في الماضي القريب. غالبا ما تنقسم التفاعلات DTH إلى مرحلة التوعية، مشيرا إلى التجربة الأولية مستضد، ومرحلة التحدي، والذي يتبع عادة بعد عدة أيام التوعية. يعتبر كثير من الأحيان لعدم وجود تأخر من نوع فرط الحساسية استجابة إلى حج استدعاء يتبين من اختبار الجلد كدليل على استعطال. وقد تم فحص البيوت التقليدية المستخدمة بشكل فعال في تشخيص العديد من الالتهابات الجرثومية.

على الرغم من تقاسم ميزات المناعة مماثلة مثل تسلل لمفاوية، وذمة، ونخر الأنسجة، وDTH المباشرة ليست تقنية التشخيص ممكنا في مرضى زرع بسبب إمكانية الحقن المباشر مما أدى إلى توعية لمستضدات المانحة وفقدان الكسب غير المشروع. لتجنب هذه المشكلة، وهمهمةتم وضع إلى الفأر "عبر الجسم الحي" DTH مقايسة 1،2. هذا الاختبار هو في جوهره نقل DTH الفحص، التي تم حقن الخلايا البشرية في الدم المحيطي وحيدات النوى (PBMCs) ومستضدات محددة تحت الجلد في pinnae أو قاطع الطريق على فأرة الحاسوب السذاجة والبيوت مثل تورم يقاس بعد 18-24 ساعة 3. عرض المستضد بواسطة الخلايا مستضد تقديم الإنسان مثل الضامة أو البلدان النامية إلى خلايا T في الأنسجة الوعائية للغاية الماوس يتسبب في تتالي التهابات وتجذب الخلايا المناعية الماوس مما أدى إلى ردود التورم. الرد هو مستضد محددة ويتطلب توعية مستضد قبل. A إيجابية استجابة DTH المانحة التفاعلي في مقايسة تلفزيون DTH يعكس أن مريض زرع وضعت التصرف المناعة الموالية للالتهابات نحو alloantigens الكسب غير المشروع.

الميزة الأكثر أهمية من هذا الاختبار هو أنه يمكن أيضا أن تستخدم لكشف الخلايا التائية التنظيمية، التي تتسبب في قمع المارة. قمع المارة منDTH استجابة نذكر في وجود مستضد المانحة هو سمة من متلقى مع المغايرة المقبولة 2،4-14. قد رصد متلقى للalloreactivity والتنظيم من قبل تلفزيون DTH تحديد مجموعة فرعية من المرضى الذين يمكن أن يستفيدوا من تخفيض المناعة من دون مخاطر مرتفعة من الرفض أو تدهور وظائف الكلى.

ثمة مجال واعد هو تطبيق للمقايسة تلفزيون DTH في رصد المناعة الذاتية 15،16 وأيضا في ورم المناعة 17.

Protocol

1. إعداد الخلايا اللمفاوية

  1. جمع الدم إلى ACD (حمض سترات الدكستروز) أنابيب.
  2. عزل PBMC من الدم المحيطي الإنسان الطازجة باستخدام فصل الخلايا الليمفاوية متوسطة وفقا للأساليب القياسية.
  3. غسل PBMC ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة الصفائح الدموية تلويث. تم العثور على الصفائح الدموية لتتداخل مع الجسم الحي عبر فحص البيوت. الحد الأقصى المسموح به من التلوث الصفائح الدموية إعداد PBMC هو ≤ 1X10 7 / الحقن.
  4. إذا كان هناك تلوث خلايا الدم الحمراء ملحوظ، نفذ تحلل من الخلايا الحمراء باستخدام العازلة تحلل ACK بعد غسل الأولى. إزالة العازلة ACK عن طريق غسل 2 مرات مع برنامج تلفزيوني.

2. إعداد مستضد خيفي

  1. عزل PBMC من الدم المحيطي المانحة باستخدام الإجراء هو موضح أعلاه.
  2. Resuspend المانحة PBMC في برنامج تلفزيوني في تركيز 120x10 6 خلية / مل (4x10 6 خلايا / 30 ميكرولتر).
  3. إضافة 1 ميكرومتر PMSF إلى الخليط لمنع البروتينتدهور.
  4. يصوتن تعليق الخلية باستخدام سبعة البقول 1 الثانية مع 2 مم مسبار sonicator. (ملاحظة: حافظ على البارد المادية وتجنب فقاعات المفرط في حالة حدوث الرغوة، والسماح للتعليق خلية الجلوس على الجليد لمدة 2-3 دقيقة.)
  5. تحقق من اختلال> 90٪ من الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
  6. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 14،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة في microfuge مبردة.
  7. طاف لنقل 2.0 مل أنبوب آمن للقفل جديد وتحديد تركيز البروتين.

3. إعداد الخلايا لحقن

  1. لكل قسامة حقن 7x10 6 PBMC إلى 2.0 مل أنابيب آمنة للقفل.
  2. الطرد المركزي في 6،000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة في microfuge وإزالة طاف.
  3. resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني مع أو بدون المضادات. ضبط حجم الحقن إلى 35 ميكرولتر مع برنامج تلفزيوني. يتم استخدام مخطط التالية لحقن:
    السيطرة السلبية: PBMC + PBS
    مراقبة إيجابية: PBMC + TT / DT (25 و مو؛ ز / الحقن)
    التجريبية مولدة استجابة محددة: PBMC + اختبار AG (4-8 ميكروغرام / الحقن)
    التجريبية مولدة تنظيم محدد: PBMC + اختبار + حج TT / DT

4. قبل القياس، حقن، وبعد قياس

  1. تخدير CB17 الماوس SCID مع isoflurane و. قياس سماكة قاطع الطريق الخلفي باستخدام بنابض الفرجار. وضع الفرجار في وسط قاطع الطريق، مع حافة واحدة لمس لوحة المشي مشاركة في القدم، لتوفير معيارا للحفاظ على موقع قياس متسقة. وسجلت سماكة قاطع الطريق عندما استقر قراءة قياس.
  2. حقن ببطء تعليق خلية تحت الجلد في قطاع الطرق من الفئران باستخدام محاقن الأنسولين ½ سم مكعب مع إبرة عيار 28. أداء حقن مع إبرة لافتا نحو أصابع القدم، وشطبة مواجهة. (ملاحظة: تأكد من عدم وجود تسرب).
  3. 18-24 ساعة بعد الحقن، وتخدير الماوس مع isoflurane وقياس وتكرار قاطع الطريق التورم.
  4. Subtrالتصرف سمك كل قاطع الطريق قبل الحقن من قيمة حقن آخر للحصول على قيمة تورم قاطع الطريق، وتعرب عن البيانات في وحدات من 10 بوصة -4. حساب محددة مستضد تورم صافي بطرح التحكم قاطع الطريق تورم (PBMC + PBS) من القيم تورم قاطع الطريق تم الحصول عليها من العلاجات (PBMC + المانحة مستضد خيفي، TT / DT، أو المانحة مستضد خيفي + TT / DT). مطلوب استجابة مراقبة إيجابية للتذكير مستضد TT / DT من ≥ 25x10 بوصة -4 أكثر استجابة خلفية برنامج تلفزيوني لمدة الاختبار أن تعتبر صالحة.
  5. تحديد تثبيط الاستجابات نذكر في وجود مستضدات المانحة من خلال مقارنة تورم الصافي لكل الحقن باستخدام الصيغة التالية:
    figure-protocol-4377

النتائج

1. تقييم متلقي زرع الكلى للاستجابة المانحين مستضد محددة باستخدام مقايسة تلفزيون DTH

لاختبار المانحة التفاعلي المناعة الخلوية في متلقي زرع الكلى نحن حقن PBMC من هؤلاء المرضى مع مستضدات المانحة وحدها أو مع إستدعاء مستضد التيتانوس (TT). ك?...

Discussion

وDTH مقايسة عبر الجسم الحي هو اختبار تشخيصي الرواية مع التطبيق السريري المحتملة في تقييم الاستجابات الخلية بوساطة في زرع والسرطان ومرضى المناعة الذاتية. ومن المفيد لأنه مفيد ليس فقط في رصد استدعاء استجابات المستجيب T، ولكن أيضا فإنه يمكن الكشف عن استجابات التنظيمية T....

Disclosures

واضعو هذا المخطوط ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أنوه مساهمات AM VanBuskirk في تطوير فهمنا للاستجابة DTH التنظيم في متلقى. وأيد هذا العمل منح المعاهد الوطنية للصحة PO1AI084853 وR01AI066219-06، والتي ترعاها الاتحاد الأوروبي دراسة واحدة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ACD tube for blood collectionBD02-684-26
Lymphocyte Separation MediumCellgro25-072-CV
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineCellgro21-031-CMWithout calcium & magnesium
ACK Lysis BufferBioWhittaker10-548E
TT/DT or EBVSanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc.TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection
Protease inhibitor PMSFSigma-Aldrich78830
Eosine for cell countSigma-AldrichE-6003
AlloantigenPurified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates
50 ml sterile centrifuge tubesFisher Scientific06-443-18
10 ml pipettes and pipettorBD Falcon13-675-20
2 ml safe-lock tubesCostar3213
1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips
HemocytometerFisher02-671-10
Full size centrifuge and microfugeBeckman Coulter/Eppendorf
1/2cc or 1cc insulin syringesBecton Dickinson14-826-7928 gauge
Vibracell sonicatorDivtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc2 mm probe
Dial thickness gaugeMitutoyo, Japan
SCID miceHarlan
IsofluranePiramal HealthcareInhalant anesthesia

References

  1. Carrodeguas, L., et al. Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity. Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).
  2. VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).
  3. Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay. Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).
  4. Burlingham, W. J., et al. Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis. Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).
  5. Geissler, F., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay': In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression. Transplantation. 72, 571-580 (2001).
  6. Jankowska-Gan, E., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay'. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH. Hum. Immunol. 63, 862 (2002).
  7. Cai, J., et al. Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance. J. Exp. Med. 199, 1017-1023 (2004).
  8. Rodriguez, D. S., et al. Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching. Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).
  9. Xu, Q., et al. Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance. J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).
  10. Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1. J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).
  11. Jankowska-Gan, E., et al. Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation. Transplantation. 88, 533-541 (2009).
  12. Jankowska-Gan, E., et al. Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs. Transplantation. 93, 283-290 (2012).
  13. Knechtle, S. J., et al. Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring. Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).
  14. Haynes, L. D., et al. Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients. Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).
  15. Burlingham, W. J., et al. IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants. J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).
  16. Bobadilla, J. L., et al. TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).
  17. Olson, B. M., et al. Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade. J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

75 DTH PBMC T SCID T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved