Trans-vivo de type hypersensibilité retardée test pour le règlement spécifique de l'antigène

Résumé

Nous décrivons un test de diagnostic précieux qui pourrait être utilisé pour décider du retrait de l'immunosuppression après transplantation sans risque élevé de rejet du greffon. Le test utilise les principes de type hypersensibilité retardée et fournit une évaluation précise de ces deux réponses immunitaires effectrices et réglementaires spécifiques donneur supporté par les bénéficiaires.

Résumé

Réponse d'hypersensibilité de type retardé (DTH) est une rapide manifestation vivo de la réponse immunitaire des cellules T dépendantes à un antigène étranger (Ag) que le système immunitaire de l'hôte a connu dans un passé récent. Réactions SRD sont souvent divisés en une phase de sensibilisation, se référant à l'expérience initiale de l'antigène, et une phase de défi, qui suit généralement plusieurs jours après la sensibilisation. L'absence d'une réaction d'hypersensibilité de type retardé à un Ag rappel démontré par des tests cutanés est souvent considéré comme une preuve d'anergie. Le test de SRD traditionnel a été effectivement utilisé dans le diagnostic de nombreuses infections microbiennes.

Bien qu'ils partagent des caractéristiques immunitaires similaires tels que l'infiltration lymphocytaire, l'œdème et une nécrose des tissus, le DTH directe n'est pas une technique de diagnostic possible chez les patients transplantés en raison de la possibilité d'une injection directe entraîne une sensibilisation à des antigènes du donneur et la perte du greffon. Pour éviter ce problème, le bourdonnementun-à-souris de test DTH "trans-vivo" a été développé ^1,2. Ce test est essentiellement un test de DTH de transfert, dans lequel les cellules humaines mononucléées du sang périphérique (CMSP) et les antigènes spécifiques ont été injectés par voie sous cutanée dans le coussinet plantaire pennes ou d'une souris naïve et gonflement DTH-like est mesurée après 18-24 h ^3. La présentation de l'antigène par les cellules présentatrices d'antigènes humains telles que les macrophages ou DCS pour les cellules T dans un tissu très vasculaire de la souris déclenche la cascade inflammatoire et attire les cellules du système immunitaire de la souris dans les réponses résultant de gonflement. La réaction est spécifique de l'antigène et nécessite une sensibilisation préalable de l'antigène. Une réponse DTH donateurs réactive positive dans le dosage Tv-SRD reflète le fait que le patient transplanté a développé une disposition pro-inflammatoire immunitaire vers alloantigènes greffe.

La caractéristique la plus importante de ce test est qu'il peut également être utilisé pour détecter les cellules T régulatrices, qui provoquent la suppression du spectateur. suppression du spectateur d'unRéponse de rappel DTH en présence de l'antigène de donneur est caractéristique des greffés avec des allogreffes acceptées ^2,4-14. Le suivi des patients transplantés pour alloréactivité et la régulation par la télévision DTH peut identifier un sous-ensemble de patients qui pourraient bénéficier de la réduction de l'immunosuppression sans risque élevé de rejet ou de détérioration de la fonction rénale.

Un domaine prometteur est l'application du test Tv-DTH dans le suivi de l'auto-immunité ^15,16 et également en immunologie tumorale ^17.

Protocole

1. Préparation des lymphocytes

1. Recueillir le sang dans des tubes ACD (acide citrate dextrose).
2. Isoler PBMC du sang périphérique humain frais en utilisant des lymphocytes milieu de séparation selon les méthodes classiques.
3. Laver les CMSP trois fois avec PBS pour éliminer les plaquettes contaminantes. Les plaquettes ont été trouvés pour interférer avec dosage de SRD trans-vivo. Maximal admissible de contamination plaquettaire préparation des CMSP est ≤ 1x10 ⁷ / injection.
4. S'il ya une contamination des globules rouges visibles, effectuer la lyse des globules rouges en utilisant un tampon de lyse ACK après le premier lavage. Retirer tampon ACK par lavage 2 fois avec PBS.

2. Préparation de alloantigène

1. Isoler PBMC du sang périphérique des bailleurs de fonds en utilisant la procédure ci-dessus.
2. Remettre en suspension donateurs PBMC dans PBS à une concentration de 120x10 ⁶ cellules / ml (4x10 ⁶ cellules / 30 pi).
3. Ajouter 1 uM PMSF au mélange pour empêcher la protéinedégradation.
4. Soniquer la suspension de cellules à l'aide de sept impulsions de 1 seconde avec un sonicateur 2 mm-sonde. (Remarque: Conservez le froid de matériel et éviter les bulles excessives Si de la mousse se produit, laissez la suspension cellulaire assis sur la glace pour un 2-3 min.).
5. Vérifier la perturbation de> 90% des cellules en utilisant un hémocytomètre.
6. Centrifuger à 14000 rpm à 4 ° C pendant 20 min dans microfuge réfrigéré.
7. Transférer le surnageant dans un nouveau tube Safe-Lock 2,0 ml et déterminer la concentration en protéines.

3. Préparation des cellules pour préparations injectables

1. Pour chaque aliquote d'injection 7x10 ⁶ PBMC en ml tubes Safe-Lock 2.0.
2. Centrifuger à 6000 rpm pendant une minute à centrifuger et éliminer le surnageant.
3. Reprendre les cellules dans du PBS avec ou sans antigènes. Réglez le volume d'injection à 35 pi avec PBS. Le schéma suivant est utilisé pour les injections:
   Contrôle négatif: CMSP + PBS
   Contrôle positif: CMSP + TT / DT (25 & mu; G / injection)
   Experimental Antigène spécifique Réponse: CMSP + test Ag (4-8 mg / injection)
   Règlement spécifique de l'antigène expérimental: CMSP + test Ag + TT / DT

4. Pré-mesure, Injection et Post-mesure

1. Anesthésier CB17 souris SCID avec isoflurane. Mesurer l'épaisseur de la patte arrière à l'aide d'un ressort étrier. Mettez curseur au centre de la patte, avec un bord de toucher le dernier pad de marche du pied, afin de fournir un point de référence pour maintenir le site de mesure constante. Épaisseur du talon est constatée lorsque la lecture de la jauge s'est stabilisée.
2. Injecter lentement suspensions cellulaires sous-cutanée dans les pattes des souris en utilisant ½ cc seringues à insuline avec aiguille de calibre 28. Effectuer injection avec pointant l'aiguille vers les orteils et le biseau vers le haut. (Note: assurez-vous qu'il n'ya pas de fuite).
3. 18-24 h après l'injection, anesthésier la souris avec mesure isoflurane et répétition de patte gonflement.
4. Subtragir l'épaisseur de chaque pied avant l'injection de la valeur post-injection pour obtenir la valeur de gonflement du coussinet plantaire, exprime les données en unités de 10 pouces ^-4. Calculer l'antigène spécifique de gonflement net en soustrayant le contrôle du coussinet plantaire gonflement (CMSP + PBS) à partir des valeurs de gonflement coussinet plantaire obtenus à partir des traitements (CMSP + donateur alloantigène, TT / DT, ou donateur alloantigène + TT / DT). Une réponse du contrôle positif de rappeler antigène TT / DT de ≥ 25x10 pouces ^-4 plus de réponse de fond à PBS est nécessaire pour que le test soit considéré comme valide.
5. Déterminer l'inhibition des réponses de rappel en présence d'antigènes de donneur en comparant le gonflement net de chaque injection à l'aide de la formule suivante:
   

Résultats

1. Évaluation des receveurs de transplantation rénale pour une réponse spécifique de l'antigène donneur en utilisant un dosage Tv-DTH

Pour tester le donneur réactif immunité cellulaire chez les transplantés rénaux nous avons injecté PBMC de ces patients avec des antigènes du donneur seul ou avec un rappel antigène anatoxine tétanique (TT). En tant que cellules de contrôle positif ont été injectés avec TT seul. Nous observons trois grandes tendances de l'hypersensibilit?...

Discussion

Le test DTH trans-vivo est un test diagnostique roman avec une application clinique potentielle dans l'évaluation des réponses à médiation cellulaire en transplantation, le cancer et les patients auto-immunes. Il est précieux car il n'est pas seulement utile dans le suivi rappel réponses effectrices T, mais il peut aussi détecter des réponses T régulatrices. Un moyen fiable de détecter la réglementation DTH humain peut prédire la sécurité du retrait de l'immunosuppression chez les patients qui ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACD tube for blood collection	BD	02-684-26
Lymphocyte Separation Medium	Cellgro	25-072-CV
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Cellgro	21-031-CM	Without calcium & magnesium
ACK Lysis Buffer	BioWhittaker	10-548E
TT/DT or EBV	Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc.		TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection
Protease inhibitor PMSF	Sigma-Aldrich	78830
Eosine for cell count	Sigma-Aldrich	E-6003
Alloantigen			Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates
50 ml sterile centrifuge tubes	Fisher Scientific	06-443-18
10 ml pipettes and pipettor	BD Falcon	13-675-20
2 ml safe-lock tubes	Costar	3213
1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Full size centrifuge and microfuge	Beckman Coulter/Eppendorf
1/2cc or 1cc insulin syringes	Becton Dickinson	14-826-79	28 gauge
Vibracell sonicator	Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc		2 mm probe
Dial thickness gauge	Mitutoyo, Japan
SCID mice	Harlan
Isoflurane	Piramal Healthcare		Inhalant anesthesia