항원 특정 규제 트랜스 생체 지연 형 과민 분석

요약

우리는 잠재적으로 이식 거부의 높은 위험없이 이식 후 면역 억제제의 철수를 결정하는 데 사용할 수있는 유용한 진단 분석을 설명합니다. 분석은 지연 형 과민 반응의 원리를 사용하여받는 사람이 탑재 된 두 기증자 특정 이펙터 및 규제 면역 반응의 정확한 평가를 제공합니다.

초록

지연 형 과민 반응 (DTH)은 숙주 면역 시스템은 최근 과거에 경험있는 외국 항원 (자세)에 대한 T 세포 의존 면역 반응의 생체 징후의 급격한입니다. DTH 반응은 종종 일반적으로 감작 후 몇 일 뒤에 초기 항원 경험과 도전 단계를 참조 감작 단계로 구분됩니다. 피부 테스트에 의해 입증 리콜 AG의 지연 형 과민 반응의 부족은 종종 anergy의 증거로 간주됩니다. 기존의 DTH 분석을 효과적으로 많은 미생물 감염을 진단하는 데 사용되었습니다.

이러한 림프구 침윤, 부종 및 조직 괴사와 유사한 면역 기능을 공유에도 불구하고, 직접 D​​TH 때문에 기증자의 항원 및 이식 손실 감작의 결과로 직접 분사의 가능성 이식 환자에서 가능한 진단 기술이 아니다. 이 문제를 방지하려면, 험투 마우스 "트랜스 생체"DTH 분석은 ^1,2 개발되었다. 이 테스트는 인간의 말초 혈액 단핵 세포 (말초 혈액) 및 특정 항원 pinnae에 피하 주사 또는 순진 마우스와 DTH와 같은 부종의 노상 18-24 시간 후 ³ 측정 된에 기본적으로 전송 DTH 분석이다. 식세포 나 높은 혈관 마우스 조직에서 T 세포 수지상 인간 항원 제시 세포에 의해 항원 프레 젠 테이션 염증 폭포를 트리거하고 붓기 반응의 결과로 마우스 면역 세포를 끈다. 반응은 항원 특이하고 사전 항원 감작이 필요합니다. TV-DTH 분석에 긍정적 인 기증자 반응 DTH 반응은 이식 환자는 이식 alloantigens 향해 염증성 면역 처리를 개발했다고 반영합니다.

이 분석의 가장 중요한 기능은 또한 방관자 억제를 일으키는 원인이 규제 T 세포를 감지하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 의 방관자 억제기증자의 항원의 존재 DTH 리콜 응답 허용 이식 ^2,4-14와 이식의 특징입니다. TV-DTH에 의해 alloreactivity 및 규제에 대한 이식의 모니터링은 거부 또는 악화 신장 기능의 높은 위험없이 면역 억제제의 감소 혜택을 누릴 수있는 환자의 하위 집합을 식별 할 수 있습니다.

유망한 지역은자가 면역 ^15,16의 모니터링 또한 종양 면역학 ¹⁷ TV-DTH 분석의 응용 프로그램입니다.

프로토콜

1. 림프구의 준비

1. ACD (산성 구연산 포도당) 튜브에 혈액을 수집합니다.
2. 표준 방법에 따라 림프구 분리 매체를 사용하여 신선한 인간의 말초 혈액에서 PBMC를 분리합니다.
3. 오염 혈소판을 제거하는 PBS로 PBMC 세 번 씻으십시오. 혈소판은 트랜스 생체 DTH 분석을 방해 발견되었다. PBMC 준비의 최대 허용 혈소판 오염 ≤ 1X10 ⁷ / 주입이다.
4. 눈에 띄는 적혈구 오염이있는 경우, 첫 번째 세척 후 ACK 용해 버퍼를 사용하여 적혈구의 용해를 수행합니다. PBS로 2 회 세척하여 ACK 버퍼를 제거합니다.

2. Alloantigen의 준비

1. 위와 같이 프로 시저를 사용하여 기증자의 말초 혈액에서 PBMC를 분리합니다.
2. 120x10 ⁶ 세포 / ㎖의 농도 (4X10 ⁶ 세포 / 30 μL)에서 PBS에서를 Resuspend 기증자 PBMC.
3. 단백질을 방지하기 위해 혼합물에 1 μM PMSF 추가분해.
4. 2 MM-프로브 sonicator로 일곱 1 초 펄스를 사용하여 세포 현탁액을 초음파 처리. (주 : 물자 감기를 유지하고 과도한 거품을 방지 거품이 발생하면, 세포 현탁액은 2 ~ 3 분 동안 얼음에 앉아 보자..)
5. 혈구를 사용하여 세포의> 90 %의 중단을 확인합니다.
6. 냉장의 microfuge에서 20 분 동안 4 ° C에서 14,000 rpm으로 혼합물을 원심 분리기.
7. 새로운 2.0 ML 안전 잠금 튜브에 뜨는을 전송하고 단백질 농도를 결정한다.

3. 주사에 대한 세포의 준비

1. 2.0 ML 안전 잠금 튜브에 각각 주입 나누어지는 7X10 ⁶ PBMC합니다.
2. 의 microfuge에서 분 동안 6,000 rpm으로 원심 분리하여 그 상등액을 제거합니다.
3. PBS에서 함께 또는 항원이없는 세포를 resuspend을. PBS로 35 μL를 주입 볼륨을 조정합니다. 다음 계획은 주사에 사용됩니다 :
   부정적인 제어 : PBMC + PBS
   긍정적 인 제어 : PBMC + TT / DT (25 & 무; G / 주입)
   실험 항원 특정 응답 : PBMC + 시험 자세 (4-8 ㎍ / 주입)
   실험 항원 특정 규정 : PBMC + 시험 자세 + TT / DT

4. 사전 측정, 주입 및 사후 측정

1. isoflurane을 함께 CB17 SCID 마우스를 마취. 스프링 캘리퍼스를 사용하여 후면 발바닥의 두께를 측정한다. 측정 부위의 일관성을 유지하기 위해 벤치 마크를 제공하기 위해, 하나의 가장자리 다리의 마지막 산책 패드를 만지고, 발바닥의 중심에서 캘리퍼를 넣어. 게이지 판독 값이 안정 될 때 발바닥의 두께가 기록됩니다.
2. 천천히 28 게이지 바늘 ½ CC 인슐린 주사기를 사용하여 쥐의 발바닥에 피하 세포 현탁액을 주입. 바늘 발가락 향하게하고, 경사가 위를 향하도록 주입을 수행합니다. (참고 : 누수가 없는지 확인).
3. 주사 후 18 ~ 24 시간은, 발바닥 부종의 isoflurane을 반복 측정에 마우스를 마취.
4. Subtr발바닥 부종 값을 가져 포스트 분사 값에서 주입 전 각 발바닥의 두께 행동, 10 ^-4 인치의 단위로 데이터를 표현한다. 치료 (PBMC + 기증자 alloantigen, TT / DT, 또는 기증자 alloantigen + TT / DT)에서 얻은 발바닥 부종 값에서 제어 발바닥 부종 (PBMC + PBS)를 뺀 항원 특이 그물 붓기를 계산합니다. PBS에 배경 응답을 통해 ≥ 25X10 ^-4 인치의 항원 TT / DT를 호출하는 긍정적 인 제어 응답이 유효한 것으로 간주되는 테스트가 필요합니다.
5. 다음 공식을 사용하여 각 주사의 순 붓기를 비교하여 기증자의 항원의 존재 리콜 반응의 억제를 확인합니다 :
   

결과

1. TV-DTH 분석을 사용하여 기증자의 항원에 특정한 응답 신장 이식의 평가

신장 이식 기증자 반응 세포 성 면역을 테스트하기 위해 우리는 기증자의 항원 단독으로 또는 리콜 항원 파상풍 톡소이드 (TT)를 가진 환자의 PBMC를 주입했다. 양성 대조군 세포는 TT 형과 주입으로. 우리는 이식 지연 형 과민 반응의 세 가지 패턴 (그림 1)을 관찰합니다. 모든 환자는 자세 (TT)를...

토론

트랜스 생체 DTH 분석은 이식, 암,자가 면역 질환 환자에서 세포 매개 반응을 평가하는 잠재적 인 임상 응용 프로그램과 새로운 진단 테스트입니다. 이 리콜 T 이펙터 반응을 모니터링하는 데 유용뿐만 아니라 때문에 가치가있다,뿐만 아니라 그것은 T 규제 응답을 검색 할 수 있습니다. 인간의 DTH 규제를 감지하는 신뢰할 수있는 방법은 단독 요법 또는 내성 시험에 대한 후보자 환자에서 면역 억제 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACD tube for blood collection	BD	02-684-26
Lymphocyte Separation Medium	Cellgro	25-072-CV
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Cellgro	21-031-CM	Without calcium & magnesium
ACK Lysis Buffer	BioWhittaker	10-548E
TT/DT or EBV	Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc.		TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection
Protease inhibitor PMSF	Sigma-Aldrich	78830
Eosine for cell count	Sigma-Aldrich	E-6003
Alloantigen			Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates
50 ml sterile centrifuge tubes	Fisher Scientific	06-443-18
10 ml pipettes and pipettor	BD Falcon	13-675-20
2 ml safe-lock tubes	Costar	3213
1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Full size centrifuge and microfuge	Beckman Coulter/Eppendorf
1/2cc or 1cc insulin syringes	Becton Dickinson	14-826-79	28 gauge
Vibracell sonicator	Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc		2 mm probe
Dial thickness gauge	Mitutoyo, Japan
SCID mice	Harlan
Isoflurane	Piramal Healthcare		Inhalant anesthesia