Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وهناك طريقة سريعة وبسيطة لتوليد خطوط الخلايا البشرية مع محرض و overexpression [كدنا] أو عكسها shRNA بوساطة ضرب أسفل من الجينات في المصالح. هذه الطريقة تمكن الباحثين من خطوط الخلايا موثوق للغاية والتلاعب بتكاثر التي يصعب تغيير بالطرق التقليدية ترنسفكأيشن عابرة أو ضربة قاضية استراتيجيات / خروج المغلوب.

Abstract

A نهج الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية الثديية هو التلاعب في التعبير عن الجينات ذات الأهمية في خطوط الخلايا المحددة، وذلك بهدف الكشف عن واحد أو عدة من وظيفة الجين (ق) باستخدام overexpression عابر / مستقر أو ضربة قاضية من الجين من الفائدة. للأسف، لإجراء تحقيقات الخلية البيولوجية المختلفة هذا النهج غير مناسب عندما تلاعب بنتيجة التعبير الجيني في النمو العيوب / تكاثر الخلايا غير المرغوب فيها أو تمايز الخلايا. ولذلك، تكيفت الباحثون بروتين التتراسيكلين كاظمة (TetR)، المأخوذ من E. القولونية المقاومة التتراسيكلين OPERON 1، لتوليد نظم تنظيمية فعالة جدا وضيقة للتعبير عن cDNAs في خلايا الثدييات 2،3. وباختصار، تم تعديل TetR لبدء إما كتلة (1) من النسخ عن طريق الربط إلى تيت-المشغل (TO) في منطقة المروج إضافة إلى التتراسيكلين (وهو ما يسمى تيت حالا النظام) أو ربط (2) إلى TO في رانه غياب التتراسيكلين (وهو ما يسمى تيت على نظام) (الشكل 1). نظرا للإزعاج أن النظام تيت لمرة ويتطلب استمرار وجود التتراسيكلين (التي لديها نصف عمر حوالي 24 ساعة في الخلية الأنسجة ثقافة المتوسط) وتيت على نظام تم على نطاق واسع أكثر الأمثل، مما أدى إلى تطوير ضيق جدا ونظم فعالة لمكافحة ناقلات التعبير كما هو مستخدم هنا [كدنا].

بعد وقت قصير من إنشاء تدخل الحمض النووي الريبي (رني) لضربة قاضية الجينات في خلايا الثدييات 4، معربا ناقلات قصيرة دبوس الشعر الرناوات (shRNAs) وصفت تلك الوظيفة مشابهة جدا لsiRNAs 5-11. ومع ذلك، هذه النهج ضربة قاضية shRNA بوساطة لها نفس القيد عن استراتيجيات خروج المغلوب التقليدية، منذ استنفاد مستقرة ليس ممكنا عندما الجينات الأهداف ضرورية لبقاء الخلوية. للتغلب على هذا القيد، فان دي Wetering وآخرون 12 تعديل التعبير shRNA ناقلات pSUPER 5 هنا، نحن تصف طريقة لتوليد بكفاءة مستقرة الإنسان تيت على خطوط الخلايا التي تدفع إما موثوق overexpression محرض أو استنزاف الجين في المصالح. باستخدام هذه الطريقة، ونحن قد ولدت بنجاح تيت على خطوط الخلايا التي سهلت كثيرا من تحليل سلسلة MST / hMOB / NDR في الجسيم المركزي 13،14 15،16 إشارة وموت الخلايا المبرمج. في هذا التقرير، ونحن لدينا وصف ناقلات الاختيار، بالإضافة إلى وصف خطوتين متتاليتين التلاعب والتي هي ضرورية لتوليد بكفاءة الإنسان تيت على خطوط الخلايا (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، إلى جانب وضع الخطوط العريضة لبروتوكول لتوليد تيت الإنسان على خطوط الخلايا، سوف نناقش الجوانب الحاسمة بشأن الإجراءات الفنية وتوصيف تيت على الخلايا.

Protocol

1. استنساخ pcDNA6_TetR_IRES_blast

  1. كما هو موضح في الشكل (3)، نفذ خلاصة جزئية للpcDNA6/TR بلازميد (V1025-20، إينفيتروجن) مع I تقييد الانزيمات وXba راس I لإزالة الجين TetR والمروج للمقاومة blasticidin (BlastR) الجينات. عزل ناقلات KB 4،6 جزء.
  2. لإزالة تذييل بعديد الأدينيلات تسلسل الجين من TetR، وإدخال من قبل PCR لI Xho الموقع فورا بعد كودون إيقاف من [كدنا] TetR مع المحافظة على موقع I Xba في 5'end من [كدنا]. Subclone جزء مما أدى إلى تقييد pMigR1 17 استخدام الإنزيمات وXba I I Xho لتوليد pMigR1_TetR البلازميد.
  3. هضم ناقلات pMigR1_TetR مع I تقييد الانزيمات Xba وأنا راس لاطلاق سراح جزء TetR_IRES. عزل إدراج جزء KB 1.25.
  4. Ligate قدره 4.6 كيلوبايت pcDNA6/TR و1،25 KB TetR_IRES شظايا. TRansform المنتج في ربط القولونية المختصة وتحديد المطلوب بناء pcDNA6_TetR_IRES_blast باستخدام معيار تقنيات البيولوجيا الجزيئية.

2. جيل من خطوط الخلايا ستابلي تعرب عن TetR

  1. في يوم 1، 1x10 6 خلايا البذور بنسبة 10 سم، نسيج لوحة الثقافة المتوسطة باستخدام معيار النمو الخاص بك (على سبيل المثال DMEM تستكمل مع FCS 10٪). البذور لوحين، واحدة للترنسفكأيشن مع pcDNA6_TetR_IRES_blast، والآخر كعنصر تحكم سلبية على اختيار blasticidin. ضمان استخدام أقل إمكانية انتقال والمتوسطة النمو الموصى بها.
  2. في يوم 2، لوحة واحدة مع بالنقل 2 ميكروغرام من pcDNA6_TetR_IRES_blast باستخدام باستخدام الدهن 6 (E2691، Promega) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. لا بالنقل لوحة ثانية.
  3. في اليوم 3، إضافة معيار المتوسطة النمو تحتوي على 5 ميكروغرام / مل على كل من لوحات blasticidin. يرجى ملاحظة أن تركيز الاختيار الأمثل قد تختلف عن خط معين والخلايا قد نعيد يحدد مسبقا.
  4. في يوم 4، تقسيم الخلايا في 5/1، 1/25، 1/50 و 1/100 باستخدام 10-سم لوحات ومستوى النمو المتوسط ​​تحتوي على 5 ملغ / مل blasticidin. تأكد بشكل صحيح لتسمية لوحات تحتوي على خلايا untransfected أو خلايا. إعداد صفيحتين في الخطوة التخفيف.
  5. تحقق الخلايا اليومية، وضمان أن جميع الخلايا على لوحات untransfected لقوا حتفهم خلال الأسبوع الأول. تغيير وسائل الاعلام اختيار كل 2-3 أيام.
  6. بعد 1-2 أسابيع، وينبغي blasticidin مقاومة المستعمرات تبدأ في الظهور. حدد لوحات تحتوي على 5 حتي 50 المستعمرات لضمان أن يمكن التقاطها المستعمرات واحد.
  7. عندما وصلت إلى المستعمرات قطر حوالي 5 مم (أو أكبر)، عزل لا يقل عن 12 استنساخ باستخدام اسطوانات مستقلة الاستنساخ لاختيار المستعمرات واحد. نقل كل نسخة منفصلة في بئر من لوحة زراعة الأنسجة 24 أيضا. عندما متموجة، وتقسيم الخلايا من كل بئر واحد في بئر لوحة زراعة الأنسجة 6 أيضا.
  8. تواصل CL الثقافةمنها في وسائل الإعلام التحديد. عندما متموجة، تقسيم الخلايا من كل بئر في بئرين واحد من لوحة زراعة الأنسجة 6 أيضا.
  9. ليتم اختبار كل استنساخ، تجميد بئر واحد من الخلايا والخلايا متموجة الحصاد في البئر الأخرى للاختبار اللاحقة التي immunoblotting.
  10. كشف TetR بواسطة الغربية النشاف باستخدام الماوس وحيدة النسيلة المضادة للأجسام المضادة TET02 (MoBiTec شركة محدودة). تذكر أن تشمل المحللة من خط الخلية الأبوية كعنصر تحكم سلبية.
  11. حدد 3 استنساخ مع التعبير أعلى TetR وتوسيع كل ثقافة نسيلي. تجميد أرصدة كل استنساخ واعدة في أقرب وقت ممكن. وأخيرا، دراسة المعلمات البيولوجية الجزيئية والخلوية ذات الاهتمام بمقارنة خطوط الخلايا الأبوية مع الحيوانات المستنسخة، معربا عن TetR. حدد 'أفضل' استنساخ مع التعبير أعلى TetR أن لا يعرض أي تغييرات في المعلمات البيولوجية الجزيئية والخلوية في المصالح.

3. الاختبار التجريبي للpTER وPT-ريكس المتجهات DEST30 عبر عنجي shRNA أو cDNAs، على التوالي

  1. توليد pTER البلازميد مع تدرج shRNA كما هو موضح 12. بناء PT-ريكس DEST30 ناقلات (12301-016، إينفيتروجن) يحتوي على [كدنا] من الاهتمام باستخدام التكنولوجيا عبارة (إينفيتروجن). في حالة التعبير [كدنا]، وإضافة علامة إلى [كدنا] في وقت لاحق تسهيل الكشف عن البروتين المعبر عنه خارجيا.
  2. عابر بالنقل الخلية الهدف الوالدين تمشيا مع البلازميدات أو DEST30 pTER حزب العمال ريكس-(إما معربا عن shRNAs أو cDNAs من الفائدة) باستخدام كاشف ترنسفكأيشن في الاختيار. لاختبار التعبير البلازميدات shRNA، لا يمكن أن يتحقق ضمان الكفاءة ترنسفكأيشن عالية.
  3. تقاس الخلايا الحصاد وعملية immunoblotting باستخدام الأجسام المضادة المناسبة، متوقعا الكشف عن نضوب أو الجينات overexpression من اهتمامك.

4. جيل من خطوط الخلايا مستقرة مع محرض-التتراسيكلين (تيت-on) أو التعبير عن shRNAs cDNAs طريق pTER أو PT-ريكس المتجهات DEST30

  1. في يوم 1، البذور 1x10 6 خلايا من 'أفضل' استنساخ-TetR معربا عن نسبة 10 سم، باستخدام لوحة متوسطة النمو القياسية الخاصة بك تستكمل مع مصل التتراسيكلين خالية مصدق (على سبيل المثال FBS من إينفيتروجن؛ 16000-014). البذور لوحة واحدة لترنسفكأيشن مع pTER (أو PT-ريكس DEST30)، ولوح واحد والمراقبة السلبية لاختيار مزدوج. تأكد من استخدام مرور أقل ممكن.
  2. في يوم 2، لوحة واحدة مع بالنقل 2 ميكروغرام من pTER (أو PT-ريكس DEST30) باستخدام باستخدام الدهن 6. لا بالنقل لوحة ثانية.
  3. في اليوم 3، إضافة معيار المتوسطة النمو تحتوي على 5 ميكروغرام / مل و 500 blasticidin ميكروغرام / مل zeocin (أو 1 ملغ / مل G418).
  4. في يوم 4، تقسيم الخلايا في 5/1، 1/25، 1/50 و 1/100 باستخدام 10-سم لوحات ومستوى النمو المتوسط ​​تحتوي على 5 ميكروغرام / مل وblasticidin ميكروغرام / 500 مل zeocin (أو 1 ملغ / مل G418). إعداد صفيحتين في الخطوة التخفيف.
  5. تحقق من الخلايا اليومية، والتأكد من أنه في غضون الأسبوع الأول كل الخلايا على لوحات untransfected لقوا حتفهم.تغيير المتوسطة النمو القياسية التي تحتوي على blasticidin وzeocin (أو G418) كل 3-4 أيام.
  6. بعد 2-3 أسابيع، blasticidin / zeocin (أو blasticidin/G418) ينبغي ضعف المقاومة للمستعمرات تبدأ في الظهور. حدد لوحات تحتوي على 5 حتي 50 مستعمرات لاختيار المستعمرات واحد.
  7. عندما وصلت إلى المستعمرات قطر حوالي 5 مم (أو أكبر)، استخدم اسطوانات استنساخ لاختيار المستعمرات واحد. عزل الحيوانات المستنسخة لا يقل عن 24 فرد. نقل كل نسخة منفصلة في بئر من لوحة زراعة الأنسجة 24 أيضا.
  8. استنساخ الثقافة في المتوسط ​​تحتوي على تركيزات الصيانة من blasticidin (5 ميكروغرام / مل) وzeocin (250 ميكروغرام / مل) [أو G418 (0.5 ملغ / مل)]. عندما متموجة، وتقسيم الخلايا من كل بئر واحد في بئر لوحة زراعة الأنسجة 6 أيضا.
  9. ليتم اختبار كل استنساخ، تقسيم واحد متموجة بشكل جيد من لوحة 6 جيدا إلى ثلاثة آبار واحدة من لوحة 6 أيضا. عندما متموجة، وتجميد الخلايا من بئر واحد. استخدام ما تبقى من بئرين لاختبار تتراسايكلينالبريد محرض التعبير. إضافة التتراسيكلين عند تركيز من 1 ميكروغرام / مل واحد أيضا، مع ترك التتراسيكلين البئر الثانية مجانا.
  10. بعد 24 إلى 96 ساعة من الحضانة مع الخلايا التتراسيكلين الحصاد، وعملية immunoblotting باستخدام الأجسام المضادة المناسبة. ويوصى أقصر الأوقات الحضانة التتراسيكلين عند فحص للتحريض التعبير [كدنا]، في حين يعد العلاج التتراسيكلين سوف يكون من الضروري تحديد shRNA بوساطة نضوب البروتينات الذاتية.
  11. حدد اثنين على الاقل من الحيوانات المستنسخة مع نضوب المطلوب / overexpression وتوسيع كل ثقافة. تجميد أرصدة كل استنساخ واعدة في أقرب وقت ممكن. عندما تزايد تيت على استنساخ للتجارب دائما التأكد من استخدام وسائل الإعلام تستكمل مع التتراسيكلين خالية المصل والمضادات الحيوية بتركيزات اختيار منها الصيانة.

النتائج

يتم عرض مثال لتوصيف الأولي للRPE-1 خطوط الخلايا معربا عن ثابت TetR في الشكل 4. علما أن جميع الحيوانات المستنسخة RPE-1 تعبر عن مستويات متفاوتة من TetR (قارن ممرات 2 و 5)، في حين أن خط الخلية الأبوية (التي هي بمثابة المراقبة السلبية) لا يعبر عن البروتين TetR الخارجية (الش...

Discussion

نعتقد أن على أنظمة تيت يسهل إلى حد كبير في تحليل وظائف الجينات، ولا سيما في نظم الخلايا التي يصعب التلاعب و / أو عندما يكون الجين التلاعب أمر ضروري لبقاء الخلية. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على التحكم في التعبير الجيني من قبل أنظمة تيت على محددة للغاية يتيح الفرصة لدراس...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر جميع أعضاء مختبرنا لإجراء مناقشات مفيدة. نشكر جوانا Lisztwan وGewinner كريستينا لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل BB/I021248/1 منحة BBSRC ويلكوم ترست منحة 090090/Z/09/ZAH هو البحث يلكوم ترست الوظيفي زميل التنمية في معهد السرطان UCL.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
الجنين المصل البقري (FBS) إينفيتروجن 16000-044 اختبار تيت خالية
Blasticidin Invivogen النمل BL-1
Zeocin Invivogen النمل والزنك-5
G418 PAA المختبرات P31-011 100 ملغ / مل في وسائل الإعلام
مكافحة TET02 MoBiTec شركة محدودة TET02 استخدام في 1/1000 إلى 2000/1 لWB
pcDNA6/TR إينفيتروجن V1025-20
PT-ريكس DEST30 إينفيتروجن 12301-016
التتراسيكلين سيجما 87128 2 ملغ / مل في الإيثانول
الدوكسيسيكلين سيجما D9891 2 ملغ / مل في الماء
استنساخ الاسطوانات Bellco زجاج شركة 2090-00808 إعادة صالحة للاستخدام

References

  1. Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
  2. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
  3. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
  4. Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
  5. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
  6. McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
  7. Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
  8. Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
  9. Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
  10. Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
  11. Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
  12. van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
  13. Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
  14. Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
  15. Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
  16. Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
  17. Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

73 DNA shRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved