Tetrasiklin-indüklenebilir (Tet-on) shRNA veya cDNA Expression Durağan İnsan Hücre Üretimi

Marta Gomez-Martinez; Debora Schmitz; Alexander Hergovich

doi:10.3791/50171

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

Özet
Özet
Protokol
Sonuçlar
Tartışmalar
Açıklamalar
Teşekkürler
Malzemeler
Referanslar
Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Indüklenebilir ve ilgilenilen genin reversibl cDNA aşırı veya shRNA aracılı knock-down ile insan hücre hatları oluşturmak için bir hızlı ve kolay yolu. Bu yöntem geçici transfeksiyon yöntemleri veya konvansiyonel knockdown / nakavtla stratejileri değiştirmek zordur güvenilir ve son derece tekrarlanabilir işlemek hücre hatları için araştırmacılar sağlar.

Özet

Memeli hücre biyolojisi alanında önemli bir yaklaşımı gösterir etmek amacı ile, seçilen hücre hatları ilgi genlerinin ifadesi manipülasyon bir ya da bu genin geçici / kararlı ekspresyonu ya da devirme kullanılarak gen fonksiyonu (ler) in çeşitli ilgi. Ne yazık ki, çeşitli hücre biyolojik araştırmalar için bu yaklaşımın uygun olduğunda hücre büyümesi / çoğalması kusurları veya istenmeyen hücre farklılaşmasında gen ekspresyonu sonucu manipülasyonlar. Bu nedenle, araştırmacılar E. alınan Tetrasiklin repressör proteini (Tetr), adapte olması coli, tetrasiklin direnci operon ^{1, 2,3,} memeli hücrelerinde cDNA ifade etmek için çok verimli ve sıkı düzenleyici sistemleri üretmek için. Kısacası, Tetr de TO tetrasiklin (Tet-off sistemi olarak adlandırılır) ilavesinden sonra yükseltici bölgesinde Tet-operatör (TO) bağlanarak veya (2) bağlama ile transkripsiyon (1) blok başlatma ya da için modifiye edilmiştir ttetrasiklin onun yokluğunda (sistem Tet-on adlandırılır) (Şekil 1). Tet-off sistemi tetrasiklin sürekli varlığı (hangi doku hücre kültürü ortamında yaklaşık 24 saat bir yarılanma ömrüne sahiptir) gerektirir rahatsızlık Verilen Tet-sistem daha kapsamlı çok sıkı geliştirme sonuçlanan optimize edilmiştir ve cDNA ifade vektörü için etkili sistemler burada kullanılan şekliyle.

Yakında kısa saç tokası RNA'lar (shRNAs) eksprese ⁴ memeli hücrelerinde, vektörler gen demonte için RNA interferans (RNAi) kurulması sonrası siRNA'lar ^5-11 çok benzer işlevi tanımlanmıştır. Gen hedefleri hücresel hayatta kalmak için gerekli olan zaman stabil tükenmesi mümkün değildir Bununla beraber, bu shRNA aracılı knockdown yaklaşımları, konvansiyonel nakavt stratejiler aynı sınırlama var. Bu sınırlandırmayı aşmak için, van de Wetering ark. ^12. shRNA ekspresyon vektörü pSUPER modifiye ⁵ Burada, biz verimli üretmek için bir yöntem tarif istikrarlı insan Tet-on güvenilir indüklenebilir aşırı veya ilgi gen tükenmesi ya götürmek hücre hatları. Bu yöntemi kullanarak, başarılı yarattı Tet-önemli ölçüde sentrozom ^13,14 ve ^15,16 sinyalizasyon apoptoz MST / hMOB / NDR çağlayan analizi kolaylaştırdı hücre hatları. Bu yazıda, tercih edilen bizim vektörleri tarif verimli üretilmesi için gerekli olan iki ardışık işleme adımları tanımlayan ek olarak insan Tet-on hücre hatları (Şekil 2). Dahası, nesil için bir protokol taslağını yanısıra insan Tet-on hücre hatları, biz kritik teknik prosedürleri ile ilgili yönlerini ve karakterizasyonu hücreleri Tet-üzerinde görüşecek.

Protokol

1. PcDNA6_TetR_IRES_blast klonlanması

Şekil 3 'de gösterildiği üzere, kısıtlama enzimleri xba I ve NCO bir gen ve Tetr blasticidin direnci (BlastR) gen promoter çıkarmak için birlikte plazmid pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen) kısmi bir özet gerçekleştirir. 4.6 kb vektör fragmanı ayırın.
Tetr geninden poliadenilasyon sekansı kaldırmak için, bir Xho I site hemen Tetr bir stop kodonu cDNA 5'end de muhafaza xba I site süre sonra cDNA, PCR ile getirmektedir. PMigR1_TetR plazmid üretmek için kısıtlama enzimlerinin xba I ve Xho I ile pMigR1 ¹⁷ içine sonuçtaki fragman Subclone.
TetR_IRES fragmanı serbest restriksiyon enzimleri xba I ve Astsubay ben pMigR1_TetR vektör sindirmek. 1.25 kb ekleme parçası ayırın.
4.6 kb pcDNA6/TR ve 1.25 kb TetR_IRES parçaları Arter. TrYetkili E.coli içine ligasyon ürünü ansform ve standart moleküler biyoloji teknikleri kullanarak istenen pcDNA6_TetR_IRES_blast yapı tanımlar.

2. Hücre Hatları Nesil stabil Tetr ifade

Günde 1, Tohum 1x10 Açık standart büyüme ortamı kullanılarak 10 cm doku kültürü plaka başına ⁶ hücre (örneğin DMEM% 10 FCS ile takviye). Tohum iki levha, pcDNA6_TetR_IRES_blast ile transfeksiyon için, diğeri ise blasticidin seçimi için bir negatif kontrol olarak, diğer. Mümkün olan en düşük geçiş ve tavsiye edilen büyüme ortamında kullanmak için emin olun.
Günde 2 üzerinde, transfekte üreticinin yönergelerini izleyerek Fugene 6 (E2691, Promega) kullanılarak pcDNA6_TetR_IRES_blast 2 mikrogram ile bir tabak. Ikinci plaka transfekte etmeyin.
3. günde, iki tabak için 5 mg / ml blasticidin içeren standart büyüme ortamı ekleyin. Optimum seçimi konsantrasyonu belirli bir hücre hattı için farklı olabileceğini lütfen unutmayın olabilir nönceden belirlenecek eed.
4. günde, 10 cm tabak ve 5 mg / ml blasticidin içeren standart büyüme ortamı kullanılarak 1/50 ve 1/100, 1/25, 1/5 de hücreleri bölme. Düzgün untransfected veya transfekte hücreler içeren plakalar etiketlemek için emin olun. Seyreltme adım başına iki tabak hazırlayın.
Untransfected plakalar üzerinde tüm hücreleri ilk hafta içinde öldüğü sağlanması, günlük hücreleri denetleyin. 2-3 günde bir seçim ortamı değiştirin.
1-2 hafta sonra, blasticidin dayanıklı koloniler görünmeye başlaması gerekir. Tek koloniler toplandı olmasını sağlamak için 5-50 ihtiva eden koloniler plakalar seçin.
Koloniler yaklaşık olarak 5 mm (ya da daha büyük) bir çapa ulaştığı zaman, tek koloniler almak için klonlama silindir kullanılarak, en az 12 bağımsız klon izole eder. 24 iyi doku kültürü plaka ayrı bir kuyuya her klon aktarın. Ne zaman birleşmiş, iyi bir 6-doku kültür plakasının tek tek her bir kuyu gelen hücreleri ayrıldı.
Kültür cl DevamSeçimi medya olanları. 6-iyi doku kültürü plaka iki tek kuyulara her kuyudan zaman konfluent, split hücreler.
Her klon test edilmesi için immunblotting sonraki test için başka bir kuyuya confluent hücreleri ve hasat hücreleri de bir dondurma.
Batı fare monoklonal anti-TET02 antikor (Mobitec GmbH) kullanarak blotting ile Tetr algıla. Bir negatif kontrol olarak ebeveyn hücre hattının bir lizat dahil unutmayınız.
Yüksek Tetr ifade ile 3 klon seçin ve her klonal kültür genişletin. En kısa sürede, her umut verici klonu stokları dondurun. Son olarak, tetr-salgılayan klonlar ile karşılaştırarak ana hücre soyu ile, ilgilenilen ve moleküler biyolojik hücre parametreleri inceleyin. Ilgi moleküler ve hücre biyolojisi parametrelerinde herhangi bir değişiklik göstermez yüksek Tetr ifadesi ile 'en iyi' klon seçin.

3. Pter ve pT-Rex DEST30 Vektörler Pilot Test ExpressSırasıyla ing shRNA veya cDNA,

¹² açıklandığı gibi shRNA ekler ile plazmid pter oluşturun. Pt-Rex DEST30 vektör (12301-016, Invitrogen) ve ağ geçidi teknolojisi (Invitrogen) kullanılarak ilgi cDNA içeren Construct. CDNA ifade etmesi halinde, cDNA ile bir etiketin ilave daha sonra ifade edilmiş protein Eksojen olarak tespit kolaylaştıracaktır.
Geçici seçim transfeksiyon reaktif kullanılarak pter veya pT-Rex DEST30 plazmidler (shRNAs veya ilgi cDNAlarının da ifade) ile Ebeveyn hedef hücre hattı transfekte. ShRNA ifade plazmid test için, yüksek transfeksiyon verimlilik elde edilebilir sağlamak.
Hasat ilgi gen tükenmesi veya aşırı algılamak için bekliyor, uygun antikorlar kullanılarak immunoblotting için hücreleri ve süreç transfekte.

4. Tetrasiklin-indüklenebilir (Tet-on) pter veya pT-Rex DEST30 Vektörler kullanma shRNAs veya cDNAlann Expression Kararlı Hücre Hatları Üretimi

Günde 1, sertifikalı Tetrasiklin serbest serum (; 16000-014 Invitrogen örneğin FBS için) ile desteklenmiş standart büyüme besiyeri kullanılarak 10 cm plaka başına 'en iyi' Tetr-ifade klonu tohum 1x10 ⁶ hücre üzerinde. Pter (veya pT-Rex DEST30), ve çift seçimi için negatif kontrol olarak bir plaka ile transfeksiyon için Tohum bir tabak. Mümkün olan en düşük geçiş kullandığınızdan emin olun.
Günde 2 üzerinde, transfekte Fugene 6 kullanarak pter 2 mikrogram (veya pT-Rex DEST30) ile bir tabak. Ikinci plaka transfekte etmeyin.
3. günde, 5 ug / ml blasticidin ve 500 ug / ml zeocin (ya da 1 mg / ml G418) ihtiva eden standart büyüme ortamı ilave edin.
4. günde, 5 mg / ml blasticidin ve 500 mg / ml zeocin (veya 1 mg / ml içeren 10 cm tabak ve standart büyüme ortamı kullanılarak 1/50 ve 1/100, 1/25, 1/5 de hücreleri bölme G418). Seyreltme adım başına iki tabak hazırlayın.
Ilk hafta içinde untransfected tabaklar üzerindeki ölenlerin emin, günlük hücreleri denetleyin.Blasticidin ve zeocin (veya G418) her 3-4 günde içeren standart büyüme ortamı değiştirin.
2-3 hafta sonra, blasticidin / zeocin (veya blasticidin/G418) çift dayanıklı koloniler görünmeye başlaması gerekir. Tek koloniler almak için 5 ila 50 koloni içeren plakalarda seçin.
Koloniler yaklaşık 5 mm (veya daha büyük) bir çapa ulaştığında, tek koloniler almak için klonlama silindir kullanın. En az 24 ayrı klonlar ayırın. 24 iyi doku kültürü plaka ayrı bir kuyuya her klon aktarın.
Blasticidin (5 ug / ml) ve zeocin (250 ug / ml) ihtiva eden bakım ortamı konsantrasyonları kültür klonlar [G418 ya da (0.5 mg / ml)]. Ne zaman birleşmiş, iyi bir 6-doku kültür plakasının tek tek her bir kuyu gelen hücreleri ayrıldı.
Her bir klon test edilmesi için, iyi bir 6-kuyulu plakanın kuyularına üç tek bir 6-kuyulu plakanın bir konfluent ayrıldı. Zaman konfluent, iyi biri hücreleri dondurmak. Tetrasiklin test için kalan iki kuyu kullanınE-indüklenebilir ifade. Ikinci da tetrasiklin serbest bırakırken, iyi bir ila 1 ug / ml 'lik bir konsantrasyonda tetrasiklin ekleyin.
Uygun antikorlar kullanılarak immunoblotting için Tetrasiklin, hasat hücreleri ve süreç ile inkübasyondan 24 ila 96 saat sonra. CDNA ifadesinin indüksiyonu için tarama yaparken uzun tetrasiklin tedavisi endojen proteinlerin shRNA aracılı tükenmesi belirlemek için gerekli olacak ise kısa tetrasiklin inkübasyon sürelerinde, tavsiye edilir.
İstenen tükenmesi / aşırı ekspresyonu ile en az iki klon seçim ve her bir kültür genişletmek. En kısa sürede, her umut verici klonu stokları dondurun. Deneyler için klonlar Tet-büyüyen daima Tetrasiklin serbest serum ve bakım konsantrasyonlarda ilgili seçim antibiyotik ile desteklenmiş ortam kullandığınızdan emin olun.