JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

דרך מהירה ופשוטה ליצירת שורות תאים אנושיות עם מושרה וביטוי יתר הפיך cDNA או shRNA בתיווך עקום למטה של ​​הגן של עניין. שיטה זו מאפשרת לחוקרי שורות תאים ואמינים ביותר reproducibly מניפולציות שקשה לשנות בשיטות transfection חולפות או אסטרטגיות קונבנציונליות מציאה / נוקאאוט.

Abstract

גישה מרכזית בתחום הביולוגיה של תא יונקת היא המניפולציה של הביטוי של גנים של עניין שורות תאים נבחרות, במטרה לחשוף את אחד או כמה מתפקודו של הגן (ות) באמצעות ביטוי יתר או מציאה חולף / יציב של הגן של עניין. למרבה הצער, לחקירות ביולוגיות תאים שונות גישה זו אינה מתאימה כאשר תוצאת מניפולציות של ביטוי גנים בתאי פגמי צמיחה / שגשוג או התמיינות תאים לא רצויה. לכן, חוקרים התאימו את החלבון המדכא טטרציקלין (TetR), נלקח מE. coli התנגדות טטרציקלין 1 אופרון, לייצר מערכות ויסות יעילות מאוד וחזקות להביע cDNAs בתאי יונקי 2,3. בקיצור, TetR שונתה כדי או (1) ייזום בלוק של שעתוק באמצעות קשירה למפעיל ט (TO) באזור המקדם על תוספת של טטרציקלין (שמכונה מערכה ט הכבוי) או (2) לאגד ל לאהוא היעדר טטרציקלין (מכונה ט במערכת) (איור 1). בהתחשב באי הנוחות שהמערכה ט הפעמי דורשת נוכחות הרציפה של טטרציקלין (שבו יש זמן מחצית חיים של כ 24 שעות במדיום תרבית תאי רקמה) ט במערכת כבר מותאם באופן נרחב יותר, וכתוצאה מכך להתפתחות מאוד הדוק ומערכות וקטור יעילות לביטוי cDNA משמשות כאן.

זמן קצר לאחר הקמתה של התערבות RNA (RNAi) למציאת גנים בתאי יונקים 4, וקטורים המבטאים RNAs-מכבנה קצרה (shRNAs) תוארה שפונקציה דומה מאוד לsiRNAs 5-11. עם זאת, גישות מציאת shRNA בתיווך אלה יש להם מגבלה כאסטרטגיות נוקאאוט קונבנציונליות, שכן דלדול יציב הוא לא ריאלי כאשר מטרות גנים הן חיוניות להישרדות תאים. כדי להתגבר על מגבלה זו, ואן דה Wetering et al. שונים 12 shRNA ביטוי וקטור pSUPER 5 כאן, אנו מתארים שיטה יעילה להפקה יציבה אדם ט בשורות תאים שיניעו מהימן או ביטוי יתר מושרה או דלדול של הגן של עניין. באמצעות שיטה זו, יש לנו נוצרו בהצלחה ט בשורות תאים אשר הקלו באופן משמעותי על הניתוח של MST / hMOB / NDR המפל בcentrosome 13,14 ואפופטוזיס איתות 15,16. בדו"ח זה, אנו מתארים הווקטורים של בחירה שלנו, בנוסף לתיאור שני שלבי המניפולציה הרצופים הנדרשים ביעילות כדי ליצור אדם ט בשורות תאים (איור 2). יתר על כן, מלבד מתאר פרוטוקול עבור הדור של אדם ט בשורות תאים, נדונו היבטים קריטיים לגבי הנהלים הטכניים והאפיון של ט בתאים.

Protocol

1. שיבוט של pcDNA6_TetR_IRES_blast

  1. כפי שמודגם באיור 3, לבצע עיכול חלקי של pcDNA6/TR פלסמיד (V1025-20, Invitrogen) עם הגבלת אנזימי Xba אני והמש"ק להסיר את גן TetR והאמרגן של התנגדות blasticidin (BlastR) הגן. לבודד את בר 4.6 קילו הווקטור.
  2. כדי להסיר את רצף polyadenylation מגן TetR, להציג באמצעות PCR אני אתר Xho מייד לאחר קודון העצירה של TetR cDNA תוך שימור Xba האתר ב5'end של cDNA. Subclone בר שנוצר לpMigR1 17 באמצעות אנזימי ההגבלה Xba ואני Xho לייצר pMigR1_TetR פלסמיד.
  3. לעכל את וקטור pMigR1_TetR עם הגבלת אנזימי Xba ואני מש"ק לשחרר בר TetR_IRES. לבודד את בר 1.25 הק"ג להוסיף.
  4. לקשור 4.6 הק"ג pcDNA6/TR ו1.25 ברי kb TetR_IRES. Transform מוצר הקשירה לE.coli המוסמך ולזהות את מבנה pcDNA6_TetR_IRES_blast הרצוי באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולריות סטנדרטיות.

2. הדור של שורות תאי יציבות הבעת TetR

  1. ביום 1 ביום, זרעי 1x10 6 תאים לכל צלחת תרבית רקמה 10-סנטימטר באמצעות מדיום הגידול הרגיל שלך (למשל DMEM בתוספת 10% FCS). זרעי שתי צלחות, אחת לtransfection עם pcDNA6_TetR_IRES_blast ואחרות כמו שליטה שלילית לבחירת blasticidin. ודא להשתמש מעבר הנמוך ביותר האפשרי ומדיום גידול המומלץ.
  2. ביום 2, transfect צלחת אחת עם 2 מיקרוגרם של pcDNA6_TetR_IRES_blast באמצעות 6 Fugene (E2691, Promega) בעקבות הוראות היצרן. אל transfect הצלחת השנייה.
  3. ביום 3, להוסיף מדיום גידול המכיל סטנדרטי blasticidin 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​לשתי הצלחות. שים לב שריכוז הבחירה האופטימלית עשוי להשתנות בהתאם לקו תא נתון ואולי need שייקבע מראש.
  4. ביום 4, לפצל את התאים ב 1/5, 1/25, 1/50 ו1 / 100 באמצעות צלחות 10-סנטימטר ובינוני צמיחה סטנדרטית המכילים 5 מ"ג / המ"ל blasticidin. הקפד לתייג צלחות המכילות תאי untransfected או transfected כראוי. הכן שתי צלחות לצעד דילול.
  5. בדקו תאים יומיים, ולהבטיח כי כל התאים שעל צלחות untransfected מתו בתוך השבוע הראשון. שינוי תקשורת בחירה כל 2-3 ימים.
  6. לאחר 1-2 שבועות, מושבות blasticidin עמידות צריכות להתחיל להופיע. בחר צלחות המכילות 5-50 מושבות כדי להבטיח שמושבות בודדות יכולות להיות הרים.
  7. כשהגיעו למושבות בקוטר של כ 5 מ"מ (או גדול), לבודד לפחות 12 שיבוטים עצמאיים באמצעות צילינדרי שיבוט להרים מושבות בודדות. העבר כל שיבוט לתוך באר נפרד מצלחת תרבית רקמה 24 כן. כשמתלכד, לפצל את התאים מכל אחד ואחד גם לתוך היטב של צלחת תרבית רקמה 6-כן.
  8. המשך CL של התרבותאלה בתקשורת בחירה. כאשר, תאי confluent מפוצל מכל טובה לשתי בארות בודדות של צלחת תרבית רקמה 6-כן.
  9. לכל שיבוט להיבדק, להקפיא באר אחת של תאים ותאי confluent קטיף ובשני לבדיקה הבאה על ידי immunoblotting.
  10. זיהוי TetR ידי מערב סופג באמצעות נוגדן חד השבטי העכבר אנטי TET02 (MoBiTec GmbH). זכור לכלול lysate של שורת תאים ההוריות כביקורת שלילית.
  11. בחר 3 שיבוטים עם ביטוי TetR הגבוה ביותר ולהרחיב כל תרבות משובטת. הקפא מניות של כל שיבוט מבטיח בהקדם האפשרי. לבסוף, לבחון את הפרמטרים הביולוגיים המולקולריים ותא של עניין על ידי השוואה בין שורות תאים ההוריות עם שיבוטי TetR מבטאים-. בחר השיבוט "הכי הטוב" עם ביטוי TetR הגבוה ביותר שלא מציג את כל שינויים בפרמטרים הביולוגיים המולקולריים ותא של עניין.

3. בדיקת פיילוט של pTER וPT-Rex DEST30 וקטורים בטאing shRNA או cDNAs, בהתאמה

  1. צור pTER פלסמיד עם מוסיף shRNA כמתואר 12. לבנות PT-רקס DEST30 וקטור (12301-016, Invitrogen) המכיל cDNA של ריבית באמצעות טכנולוגית Gateway (Invitrogen). במקרה של ביטוי cDNA, תוספת של תג לcDNA יהיה מאוחר להקל זיהוי של חלבון בטא exogenously.
  2. Transiently transfect קו תא המטרה ההורית עם pTER או PT-רקס DEST30 פלסמידים (להביע או shRNAs או cDNAs עניין) באמצעות מגיב transfection של בחירה. לבדיקה של פלסמידים ביטוי shRNA, להבטיח יעילות transfection גבוהה יכולה להיות מושגת.
  3. קציר transfected תאים ותהליך לimmunoblotting באמצעות הנוגדנים המתאימים, מצפה לגילוי דלדול או ביטוי יתר של הגן של עניין שלך.

4. דור של שורות תאי יציבות עם טטרציקלין-מושרה (ט ב) ביטוי של shRNAs או cDNAs שימוש pTER או PT-Rex DEST30 וקטורים

  1. ביום 1 ביום, 1x10 6 תאי זרע של TetR-להביע השיבוט 'הטוב ביותר' לצלחת 10-סנטימטר באמצעות מדיום הגידול הרגיל שלך להשלים עם סרום מוסמך טטרציקלין חינם (לדוגמה מFBS Invitrogen; 16000-014). צלחת זרע אחד לtransfection עם pTER (או PT-רקס DEST30), וצלחת אחת כשליטה שלילית לבחירה כפולה. הקפד להשתמש במעבר הנמוך ביותר האפשרי.
  2. ביום 2, transfect צלחת אחת עם 2 מיקרוגרם של pTER (או PT-רקס DEST30) באמצעות 6 Fugene. אל transfect הצלחת השנייה.
  3. ביום 3, להוסיף מדיום גידול סטנדרטי המכיל 5 מיקרוגרם / המ"ל blasticidin ו500 מיקרוגרם / המ"ל zeocin (או 1 מ"ג / המ"ל G418).
  4. ביום 4, לפצל את התאים ב 1/5, 1/25, 1/50 ו1 / 100 באמצעות צלחות 10-סנטימטר ובינוני צמיחה סטנדרטית המכילות 5 מיקרוגרם / המ"ל blasticidin ו500 מיקרוגרם / המ"ל zeocin (או 1 מ"ג / מ"ל G418). הכן שתי צלחות לצעד דילול.
  5. בדקו את התאים יומיים, ולוודא כי בתוך השבוע הראשון כל התאים שעל צלחות untransfected מתו.לשנות את מדיום גידול המכיל blasticidin הסטנדרטי וzeocin (או G418) כל 3-4 ימים.
  6. לאחר 2-3 שבועות, blasticidin / zeocin (או blasticidin/G418) מושבות כפולות עמידות צריכות להתחיל להופיע. בחר צלחות המכילות 5-50 מושבות להרים מושבות בודדות.
  7. כשהגיעו למושבות בקוטר של כ 5 מ"מ (או גדול), השתמש צילינדרי שיבוט להרים מושבות בודדות. מבודד לפחות 24 שיבוטים בודדים. העבר כל שיבוט לתוך באר נפרד מצלחת תרבית רקמה 24 כן.
  8. שיבוטי תרבות בריכוזי תחזוקה המכילים בינוניים של blasticidin (5 מיקרוגרם / מ"ל) וzeocin (250 מיקרוגרם / מ"ל) [או G418 (0.5 מ"ג / מ"ל)]. כשמתלכד, לפצל את התאים מכל אחד ואחד גם לתוך היטב של צלחת תרבית רקמה 6-כן.
  9. לכל שיבוט להיבדק, מתחלק באחד מתלכד היטב של צלחת 6-טובה לשלוש בארות בודדות של צלחת 6-כן. כשמתלכד, להקפיא תאים מטיפוס אחד המוכר היטב. השתמש בשתי הבארות שנותרו לבדיקת tetracyclinביטוי דואר מושרה. הוסף טטרציקלין בריכוז של מיקרוגרם 1 / מ"ל ​​לטיפוס אחד המוכר היטב, תוך השארת טטרציקלין גם השנייה בחינם.
  10. אחרי 24-96 שעות של דגירה עם טטרציקלין, תאי קציר ותהליך לimmunoblotting באמצעות נוגדנים מתאימים. זמני דגירת טטרציקלין קצרים מומלצים כאשר מיון לאינדוקציה של ביטוי cDNA, בעוד טיפולי טטרציקלין ארוכים יותר יהיו צורך לקבוע דלדול shRNA בתיווך של חלבונים אנדוגניים.
  11. בחר לפחות שני שיבוטים עם הדלדול הרצוי / ביטוי יתר ולהרחיב כל תרבות. הקפא מניות של כל שיבוט מבטיח בהקדם האפשרי. כשגדל ט בשיבוטים לניסויים תמיד הקפד להשתמש באמצעי תקשורת בתוספת סרום טטרציקלין ללא אנטיביוטיקה ואת הבחירה המתאימה בריכוזי תחזוקה.

תוצאות

דוגמה לאפיון הראשוני של-1 RPE שורות תאי יציבות מבטאות TetR מוצגת באיור 4. שים לב כי כל שיבוטי רשתית-1 מביעים רמות שונות של TetR (השווה נתיבים 2 ו 5), ואילו קו התא ההורי (המשמש כשליטה שלילית) אינו מבטא את חלבון TetR אקסוגני (איור 4, 1 נתיב). וריאציה זו בביטוי TetR בין הר...

Discussion

אנו מאמינים כי ט במערכות להקל על הניתוח של תפקוד הגן באופן משמעותי, במיוחד במערכות תא שקשה לתמרן ו / או כאשר גן המניפולציות הוא חיוני להישרדות תא. יתר על כן, היכולת לשלוט על ביטוי גנים על ידי ט במערכות מאוד ספציפיות מציעה את ההזדמנות ללמוד פונקציות גנטיות בשלבים שונים (...

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

אנו מודים לכל החברים במעבדה שלנו לדיונים מועילים. אנו מודים ג'ואנה Lisztwan וכריסטינה Gewinner לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק BBSRC BB/I021248/1 וקרן Wellcome מענק 090090/Z/09/ZAH היא עמית קרן Wellcome מחקר פיתוח קריירה בUCL מכון הסרטן.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
שם המגיב חברה מספר קטלוגים תגובות (אופציונלי)
עוברי בסרום שור (FBS) Invitrogen 16000-044 בדוק ט החופשי
Blasticidin Invivogen נמלה-BL-1
Zeocin Invivogen נמלי Zn-5
G418 מעבדות Paa P31-011 100 מ"ג / מ"ל ​​בתקשורת
אנטי TET02 MoBiTec GmbH TET02 השתמש ב1 / 1000 עד 1/2000 WB
pcDNA6/TR Invitrogen V1025-20
PT-רקס DEST30 Invitrogen 12301-016
טטרציקלין סיגמא 87128 2 מ"ג / מ"ל ​​באתנול
דוקסיציקלין סיגמא D9891 2 מ"ג / מ"ל ​​במים
צילינדרי שיבוט Bellco הזכוכית בע"מ 2090-00808 מחדש שמיש

References

  1. Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
  2. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
  3. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
  4. Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
  5. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
  6. McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
  7. Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
  8. Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
  9. Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
  10. Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
  11. Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
  12. van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
  13. Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
  14. Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
  15. Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
  16. Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
  17. Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

73BioengineeringcDNADNAshRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved