Generación de líneas celulares estables Humanos (Tet-on) inducible por tetraciclina o shRNA expresión cDNA

Resumen

Una manera rápida y sencilla para generar líneas celulares humanas con sobreexpresión inducible y reversible de ADNc o shRNA mediada derribar-del gen de interés. Este método permite a los investigadores a las líneas celulares altamente fiable y reproducible manipular que son difíciles de modificar por métodos de transfección transitoria o estrategias convencionales desmontables / knockout.

Resumen

Un enfoque importante en el campo de la biología de células de mamíferos es la manipulación de la expresión de genes de interés en líneas celulares seleccionadas, con el fin de revelar una o varias de la función del gen (s) mediante la sobreexpresión transitoria / estable o caída del gen de interés. Desafortunadamente, para las investigaciones de células biológicas diferentes este enfoque no es adecuado cuando las manipulaciones del resultado de la expresión génica en células de crecimiento / proliferación de defectos o la diferenciación celular, no deseada. Por lo tanto, los investigadores han adaptado la proteína represora de tetraciclina (TetR), tomada de la E. coli resistencia a la tetraciclina operón ^1, para generar sistemas de regulación eficientes y muy estrecho para expresar ADNc en células de mamífero ^2,3. En resumen, TetR se ha modificado para cualquiera de iniciación bloque (1) de la transcripción mediante la unión al operador Tet-(A) en la región del promotor tras la adición de tetraciclina (Tet-off denomina sistema) o bind (2) a la A en tél ausencia de tetraciclina (Tet-on denomina sistema) (Figura 1). Teniendo en cuenta el inconveniente de que el sistema Tet-off requiere la presencia continua de tetraciclina (que tiene una vida media de aproximadamente 24 horas en medio de cultivo de tejido de células) el sistema Tet-on ha sido más ampliamente optimizada, lo que resulta en el desarrollo de muy apretado y sistemas eficientes de vector para la expresión de ADNc tal como se usa aquí.

Poco después del establecimiento de la interferencia de ARN (RNAi) para knockdown gen en células de mamífero ^4, vectores que expresan corto horquilla RNAs (shRNAs) se describe que la función muy similar a siRNAs ^5-11. Sin embargo, estos enfoques shRNA mediada desmontables tienen la misma limitación como estrategias knockout convencionales, ya que el agotamiento estable no es factible cuando los objetivos de genes son esenciales para la supervivencia celular. Para superar esta limitación, van de Wetering et al. ¹² modificó la expresión shRNA vector pSUPER ⁵ Aquí se describe un método para generar eficientemente humano estable Tet-en líneas celulares que conducen fiable sobreexpresión inducible o el agotamiento del gen de interés. Usando este método, se han generado con éxito Tet-en líneas celulares que facilita considerablemente el análisis de la cascada de MST / hMOB / NDR en centrosoma ^13,14 y ^15,16 apoptosis de señalización. En este reporte se describe nuestros vectores de elección, además de describir los dos pasos consecutivos de manipulación que son necesarios para generar eficientemente humano Tet-en líneas celulares (Figura 2). Por otra parte, además de plantear un protocolo para la generación de recursos humanos Tet-en líneas celulares, vamos a discutir los aspectos críticos relacionados con los procedimientos técnicos y la caracterización de Tet-en las células.

Protocolo

1. Clonación de pcDNA6_TetR_IRES_blast

1. Como se ilustra en la Figura 3, realizar una digestión parcial del plásmido pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen) con las enzimas de restricción Xba I y Nco I para eliminar el gen TetR y el promotor de la resistencia a blasticidina (BlastR) de genes. Aislar el fragmento de 4,6 kb del vector.
2. Para eliminar la secuencia de poliadenilación del gen TetR, introducir por PCR un sitio Xho I inmediatamente después del codón de parada de la TetR cDNA mientras se conserva el sitio Xba I en el extremo 5 'del ADNc. Subclonar el fragmento resultante en pMigR1 ¹⁷ usando las enzimas de restricción Xba I y Xho I para generar el plásmido pMigR1_TetR.
3. Se digiere el vector pMigR1_TetR con las enzimas de restricción Xba I y Nco I para liberar el fragmento TetR_IRES. Aislar el fragmento de 1,25 kb de inserción.
4. Se liga el 4,6 kb pcDNA6/TR y los fragmentos de 1,25 kb TetR_IRES. Transform el producto de ligamiento en E. coli competente e identificar el constructo pcDNA6_TetR_IRES_blast deseada utilizando técnicas estándar de biología molecular.

2. Generación de líneas celulares que expresan establemente TetR

1. En el día 1, Semillas 1x10 ⁶ células por 10-cm placa de cultivo de tejidos utilizando el medio de crecimiento estándar (por ejemplo, DMEM suplementado con 10% FCS). Semilla dos placas, una para la transfección con pcDNA6_TetR_IRES_blast, y el otro como control negativo para la selección blasticidina. Asegúrese de utilizar la menor posible paso y el medio de crecimiento recomendada.
2. En el día 2, transfectar una placa con 2 g de pcDNA6_TetR_IRES_blast utilizando Fugene 6 (E2691, Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. No transfectar la segunda placa.
3. El día 3, se añade medio de crecimiento estándar que contiene 5 mg / ml blasticidin a ambas placas. Tenga en cuenta que la concentración óptima selección puede variar de una línea celular determinada y podría need a ser determinado de antemano.
4. El día 4, dividir las células en 1/5, 1/25, 1/50 y 1/100 utilizando placas de 10 cm y el medio de cultivo estándar que contiene 5 mg / ml de blasticidina. Asegúrese de etiquetar correctamente las placas que contienen las células no transfectadas o transfectadas. Prepare dos planchas por el paso de dilución.
5. Compruebe diariamente las células, lo que garantiza que todas las células en las placas no transfectadas murieron en la primera semana. Cambie medio de selección cada 2-3 días.
6. Después de 1-2 semanas, las colonias resistentes a blasticidina deben comenzar a aparecer. Seleccione placas que contienen 5 a 50 colonias para asegurar que las colonias individuales se pueden recoger.
7. Cuando las colonias han alcanzado un diámetro de aproximadamente 5 mm (o mayor), aislar al menos 12 clones independientes usando cilindros de clonación para recoger colonias individuales. Transferir cada clon en un pocillo separado de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos. Cuando confluente, dividir las células de cada pocillo en un solo pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos.
8. Siga cl culturaen los medios de selección. Cuando las células confluentes, se separó de cada pocillo en dos pocillos individuales de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos.
9. Para cada clon a analizar, congelar un pocillo de células confluentes y las células de la cosecha en el bien, para un control posterior por inmunotransferencia.
10. Detectar TetR por transferencia Western utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón anti-TET02 anticuerpo (MoBiTec GmbH). Recuerde incluir un lisado de la línea celular parental como un control negativo.
11. Seleccione 3 clones con la más alta expresión TetR y ampliar cada cultivo clonal. Congelar las existencias de cada clon prometedor tan pronto como sea posible. Finalmente, examine los parámetros de biología molecular y celular de interés mediante la comparación de las líneas celulares de sus padres con los clones que expresan TetR. Seleccione el "mejor" clon con la más alta expresión TetR que no muestra alteraciones en los parámetros de biología molecular y celular de interés.

3. Prueba piloto de PTER y pT-Rex Vectores DEST30 ExpreseING shRNA o ADNc, Respectivamente

1. Generar PTER plásmido con insertos shRNA como se ha descrito ^12. Construir pT-Rex DEST30 vector (12,301-016, Invitrogen) que contiene el cDNA de interés utilizando la tecnología de Gateway (Invitrogen). En caso de expresión de ADNc, la adición de una etiqueta con el ADNc más adelante facilita la detección de la proteína exógena expresada.
2. Transitoriamente transfectar la línea de blanco celular de sus padres o con PTER pT Rex-DEST30 plásmidos (que manifieste shRNAs o ADNc de interés) utilizando el reactivo de transfección de elección. Para el ensayo de plásmidos de expresión de shRNA, garantizar una alta eficiencia de transfección se puede lograr.
3. Cosecha de las células transfectadas y el proceso para la inmunotransferencia utilizando los anticuerpos apropiados, esperando para detectar un agotamiento o sobreexpresión de su gen de interés.

4. Generación de líneas celulares estables con inducible por tetraciclina (Tet-on) Expresión de shRNAs o cDNAs usando PTER o pT-Rex Vectores DEST30

1. El día 1, semillas 1x10 ⁶ células de la "mejor" TetR que expresan clon por 10 cm de la placa utilizando el medio estándar de crecimiento suplementado con tetraciclina certificado libre de suero (FBS por ejemplo de Invitrogen; 16,000-014). Seed una placa para la transfección con PTER (o pT-Rex DEST30), y una placa como control negativo para selección doble. Asegúrese de utilizar el pase más bajo posible.
2. En el día 2, transfectar una placa con 2 g de PTER (o Pt-Rex DEST30) usando Fugene 6. No transfectar la segunda placa.
3. El día 3, se añade medio de crecimiento estándar que contiene 5 mg / ml blasticidin y 500 ug / ml de zeocina (o 1 mg / ml de G418).
4. El día 4, dividir las células en 1/5, 1/25, 1/50 y 1/100 utilizando placas de 10 cm y el medio de cultivo estándar que contiene 5 mg / ml y blasticidin 500 mg / ml de zeocina (o 1 mg / ml G418). Prepare dos planchas por el paso de dilución.
5. Ver las células diariamente, asegurándose de que dentro de la primera semana todas las células en las placas no transfectadas han muerto.Cambiar el medio de crecimiento estándar que contiene blasticidina y zeocina (o G418) cada 3-4 días.
6. Después de 2-3 semanas, blasticidin / zeocina (o blasticidin/G418) doble colonias resistentes deberían comenzar a aparecer. Seleccione placas que contienen 5 a 50 colonias a recoger colonias individuales.
7. Cuando las colonias han alcanzado un diámetro de aproximadamente 5 mm (o mayor), utilizar cilindros de clonación para recoger colonias individuales. Aislar al menos 24 clones individuales. Transferir cada clon en un pocillo separado de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos.
8. Clones de cultivo en medio de mantenimiento que contienen concentraciones de blasticidina (5 mg / ml) y zeocina (250 ug / ml) [o G418 (0,5 mg / ml)]. Cuando confluente, dividir las células de cada pocillo en un solo pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos.
9. Para cada clon a analizar, dividir un confluente pocillo de una placa de 6-así en tres pocillos individuales de una placa de 6-así. Cuando confluente, congelar las células de un pozo. Utilice los restantes dos pozos para probar la tetraciclinae-inducible de expresión. Añadir tetraciclina a una concentración de 1 mg / ml a un pocillo, mientras que deja el segundo tetraciclina bien libre.
10. Después de 24 a 96 horas de incubación con células de tetraciclina cosecha, y el proceso para inmunotransferencia utilizando anticuerpos apropiados. Reducción de los tiempos de incubación de tetraciclina se recomiendan cuando la detección de la inducción de la expresión de cDNA, mientras que los tratamientos más prolongados tetraciclina será necesario determinar shRNA mediada por el agotamiento de las proteínas endógenas.
11. Seleccione al menos dos clones con el agotamiento deseado / sobreexpresión y expandir cada cultura. Congelar las existencias de cada clon prometedor tan pronto como sea posible. Al crecer Tet-on clones para experimentos asegúrese siempre de utilizar medios de comunicación complementado con tetraciclina libre de suero y los antibióticos de selección correspondientes a las concentraciones de mantenimiento.

Resultados

Un ejemplo para la caracterización inicial de RPE-1 líneas celulares que expresan establemente TetR se muestra en la Figura 4. Tenga en cuenta que todos los clones de RPE-1 expresan niveles variables de TetR (compárense las calles 2 y 5), mientras que la línea celular parental (que sirve como control negativo) no expresa la proteína TetR exógeno (Figura 4, carril 1). Esta variación en la expresión entre TetR RPE-1 Tet-on clones de células que se espera, puesto que la expresión...

Discusión

Creemos que Tet-On sistemas facilitan en gran medida el análisis de la función génica, particularmente en sistemas de células que son difíciles de manipular y / o cuando el gen manipulado es esencial para la supervivencia celular. Además, la capacidad de controlar la expresión de genes altamente específicos por Tet-On sistemas ofrece la oportunidad de estudiar las funciones de genes en diferentes etapas (por ejemplo durante la progresión del ciclo celular o bien definidos los procesos de diferenciación). El m?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Suero bovino fetal (FBS)	Invitrogen	16000-044	Probado Tet-libre
Blasticidina	Invivogen	ant-bl-1
Zeocina	Invivogen	ant-zn-5
G418	PAA laboratorios	P31-011	100 mg / ml en los medios de comunicación
anti-TET02	MoBiTec GmbH	TET02	Use a 1/1000 a 1/2000 para WB
pcDNA6/TR	Invitrogen	V1025-20
pT-Rex DEST30	Invitrogen	12301-016
La tetraciclina	Sigma	87128	2 mg / ml en etanol
Doxycycline	Sigma	D9891	2 mg / ml en agua
Cilindros de clonación	Bellco Glass Inc.	2090-00808	reutilizable