Генерация стабильных клеточных линий человека с Тетрациклин-индуцируемых (Тет-на) ShRNA или кДНК выражений

Резюме

Быстрый и простой способ создания клеточных линий человека с индуцибельной и обратимым кДНК гиперэкспрессией или ShRNA-опосредованной нокдаун гена интереса. Этот метод позволяет исследователям надежно и высоко воспроизводимо управлять клеточными линиями, которые трудно изменить переходным методов трансфекции или обычные нокдаун / нокаут стратегии.

Аннотация

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon¹, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells^2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.

Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells⁴, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs^5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.¹² modified the shRNA expression vector pSUPER⁵ by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.

Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome^13,14 and apoptosis signaling^15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

протокол

1. Клонирование pcDNA6_TetR_IRES_blast

1. Как показано на рисунке 3, выполнить частичную дайджест pcDNA6/TR плазмиды (V1025-20, Invitrogen) рестриктазами Xba я и сержантского я, чтобы удалить ген TetR и промоутером сопротивление бластицидин (BlastR) гена. Изолировать 4,6 Кб фрагмент вектора.
2. Чтобы удалить последовательность полиаденилирования от гена TetR, ввести с помощью ПЦР Xho я сайте сразу же после стоп-кодона из TetR кДНК при сохранении сайте Xba я на 5'-кДНК. Субклона полученный фрагмент в pMigR1 ^{17 с} использованием ферментов рестрикции Xba я и Xho I для создания pMigR1_TetR плазмиды.
3. Дайджест pMigR1_TetR вектор с рестриктаз Xba я и сержантского я, чтобы освободить TetR_IRES фрагмент. Изолировать 1,25 кб вставки фрагмента.
4. Лигируют 4,6 Кб pcDNA6/TR и 1,25 кб TetR_IRES фрагментов. Transform перевязки продуктов в компетентные E.coli и определить желаемую pcDNA6_TetR_IRES_blast конструкция с использованием стандартных методов молекулярной биологии.

2. Генерация клеточных линий, стабильно экспрессирующих TetR

1. На 1-й день, Seed 1x10 ⁶ клеток на 10-сантиметровом культуре ткани пластины с помощью стандартной среде роста (например, DMEM с добавлением 10% FCS). Семенной двух пластин, одна для трансфекции pcDNA6_TetR_IRES_blast, а другой в качестве отрицательного контроля для отбора бластицидин. Убедитесь, использовать низкие проход возможен и рекомендуемый средний рост.
2. На 2-й день трансфекции одна пластина с 2 мкг pcDNA6_TetR_IRES_blast использованием Fugene 6 (E2691, Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Не трансфекции второй пластины.
3. На 3-й день, добавить стандартную питательную среду, содержащую 5 мкг / мл бластицидин для обеих пластин. Обратите внимание, что выбор оптимальной концентрации могут варьироваться для данной линии клеток и могущество пEED должны быть определены заранее.
4. На 4-й день, разделили клетки на 1/5, 1/25, 1/50 и 1/100 с помощью 10-см пластины и стандартной питательной среде, содержащей 5 мг / мл бластицидин. Убедитесь в том, чтобы правильно маркировать пластин, содержащих нетрансфецированные или трансфекции клеток. Приготовьте две пластины на разведение шаг.
5. Проверьте клетки ежедневно, гарантируя, что все клетки на нетрансфицированных пластин умерли в течение первой недели. Измените выделение средств массовой информации каждые 2-3 дня.
6. Через 1-2 недели, бластицидин устойчивых колоний должны начать появляться. Выберите пластины, содержащие от 5 до 50 колоний для обеспечения одной колонии могут быть выбраны.
7. Когда колонии достигли диаметром около 5 мм (или больше), выделить по крайней мере 12 независимых клонов использованием клонирования цилиндров, чтобы выбрать одну колонии. Передача каждого клона в отдельную лунку в 24-луночный планшет для культивирования тканей. Когда сливающиеся, разделить клетки из каждой лунки в одну лунку 6-луночный планшет для культивирования тканей.
8. Продолжайте культуры CLте, в выборе средств массовой информации. Когда сливающиеся, разбиение ячеек из каждой лунки на две одиночных скважин из 6-луночный планшет для культивирования тканей.
9. Для каждого клона должны быть протестированы, заморозить одну скважину вырожденных клеток и урожай клеток в другие хорошо для последующего тестирования с помощью иммуноблоттинга.
10. Обнаружение TetR помощью Вестерн-блоттинга с помощью мыши моноклональные анти-TET02 антител (Mobitec GmbH). Не забудьте включить лизат родительской клеточной линии в качестве отрицательного контроля.
11. Выберите 3-х клонов с высокой TetR выражения и расширения каждого клональный культуры. Замораживание акций каждой перспективных клонов как можно скорее. Наконец, изучение молекулярных и клеточных биологических параметров, представляющих интерес, сравнивая родительских линий клеток с TetR-экспрессирующих клонов. Выберите "лучший" клон с высокой TetR выражение, которое не выводит никаких изменений в молекулярной и клеточной биологических параметров, представляющих интерес.

3. Пилотное тестирование pTER и PT-Rex DEST30 векторы ЭкспрессING ShRNA или кДНК, Соответственно

1. Создание pTER плазмиды со вставками ShRNA, как описано ^12. Построить PT-Rex DEST30 вектор (12301-016, Invitrogen), содержащей кДНК интерес использовании шлюза технологий (Invitrogen). В случае кДНК выражения, добавление тегов к кДНК позже облегчения обнаружения экзогенно выразил белка.
2. Временно трансфекции родительской линии клеток-мишеней с pTER или PT-Rex DEST30 плазмиды (выражение либо shRNAs или кДНК интерес) с помощью трансфекции реагента выбор. Для тестирования плазмид ShRNA выражения, обеспечить высокую эффективность трансфекции может быть достигнута.
3. Урожай трансфицированных клеток и процесс иммуноблоттинга помощью соответствующих антител, ожидая обнаружить истощения или избыточная экспрессия гена ваших интересов.

4. Генерация стабильных клеточных линий с Тетрациклин-индуцируемых (Тет-на) Выражение shRNAs или кДНК Использование pTER или PT-Rex DEST30 векторы

1. На 1-й день, семена 1x10 ⁶ клеток из «лучших» TetR-экспрессирующих клонов в 10-см пластины с помощью стандартной среде роста дополнить сертифицированных Тетрациклин без сыворотки (например FBS от Invitrogen; 16000-014). Семенной одна пластина для трансфекции pTER (или PT-Rex DEST30), и одну пластину в качестве отрицательного контроля за двухместный выбор. Убедитесь, что используется низкий проход возможен.
2. На 2-й день трансфекции одна пластина с 2 мкг pTER (или PT-Rex DEST30) с помощью Fugene 6. Не трансфекции второй пластины.
3. На 3-й день, добавить стандартную питательную среду, содержащую 5 мкг / мл бластицидин и 500 мкг / мл зеоцин (или 1 мг / мл G418).
4. На 4-й день, разделили клетки на 1/5, 1/25, 1/50 и 1/100 с помощью 10-см пластины и стандартной питательной среде, содержащей 5 мкг / мл бластицидин и 500 мкг / мл зеоцин (или 1 мг / мл G418). Приготовьте две пластины на разведение шаг.
5. Проверьте клетки ежедневно, убедившись, что в течение первой недели все клетки на нетрансфицированных пластин умерли.Изменение стандартной питательной среде содержащей бластицидин и зеоцин (или G418) каждые 3-4 дня.
6. Через 2-3 недели, бластицидин / зеоцин (или blasticidin/G418) дважды устойчивых колоний должны начать появляться. Выберите пластины, содержащие от 5 до 50 колоний, чтобы выбрать одну колонии.
7. Когда колонии достигли диаметром около 5 мм (или больше), используют клонирование цилиндров, чтобы выбрать одну колонии. Изолировать по меньшей мере 24 индивидуальных клонов. Передача каждого клона в отдельную лунку в 24-луночный планшет для культивирования тканей.
8. Культура клонов в среде, содержащей обслуживания концентрации бластицидин (5 мкг / мл) и зеоцин (250 мкг / мл) [или G418 (0,5 мг / мл)]. Когда сливающиеся, разделить клетки из каждой лунки в одну лунку 6-луночный планшет для культивирования тканей.
9. Для каждого клона должны быть протестированы, разделить один сливной колодец 6-луночный планшет на три одиночных скважин из 6-луночный планшет. Когда сливающиеся, замораживание клеток из одной скважины. Используйте оставшиеся две скважины для тестирования тетрациклиномE-индуцируемой экспрессии. Добавить тетрациклин в концентрации 1 мкг / мл в одной скважине, оставляя вторую и тетрациклин бесплатно.
10. После 24 до 96 ч инкубации с тетрациклин, урожай клеток и процесс иммуноблоттинга с помощью соответствующих антител. Сокращение времени тетрациклин инкубации рекомендуется при скрининге для индукции кДНК выражении, в то время как больше тетрациклин лечение будет необходимо определить ShRNA-опосредованной истощения эндогенных белков.
11. Выберите по крайней мере, двух клонов с нужными истощение / гиперэкспрессии и расширение каждой культуры. Замораживание акций каждой перспективных клонов как можно скорее. При выращивании на Тет-клонов для экспериментов всегда убедитесь, что используете среде с добавлением тетрациклина без сыворотки и соответствующих антибиотиков выбора на поддержание концентрации.

Результаты

Например для начальных характеристик ПЭС-1 клеточные линии, стабильно экспрессирующие TetR показано на рисунке 4. Отметим, что все НПП-1 клонов выражать различные уровни TetR (сравните дорожки 2 и 5), в то время как родительская клеточная линия (которая служит в качестве отрицательно?...

Обсуждение

Мы считаем, что Тет-систем значительно облегчить анализ функции генов, особенно в клеточных системах, которые трудно манипулировать и / или при манипуляции генов необходима для выживания клеток. Кроме того, способность контролировать экспрессию генов весьма специфический Тет-систем п...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS)	Invitrogen	16000-044	Протестировано Тет-бесплатно
Бластицидин	Invivogen	Муравей-BL-1
Зеоцина	Invivogen	Муравей-Zn-5
G418	PAA лабораторий	P31-011	100 мг / мл в СМИ
анти-TET02	Mobitec GmbH	TET02	Используйте на 1/1000 до 1/2000 для WB
pcDNA6/TR	Invitrogen	V1025-20
PT-Rex DEST30	Invitrogen	12301-016
Тетрациклин	Сигма	87128	2 мг / мл в этаноле
Доксициклин	Сигма	D9891	2 мг / мл в воде
Клонирование цилиндров	Bellco стекла Инк	2090-00808	повторного использования