테트라싸이클린-inducible (Tet-에서) shRNA 또는 cDNA 표현과 안정적인 인간 세포 라인의 생성

요약

inducible과 관심의 유전자의 치료 cDNA overexpression 또는 shRNA로 인한 똑 다운과 인간의 세포 라인을 생성하기 위해 신속하고 간단한 방법. 이 방법은 일시적 transfection 방법 또는 기존 최저 / 한방 전략에 의해 변경하기가 어렵 안정적으로 높은 reproducibly 조작 세포 라인에 연구자 수 있습니다.

초록

포유류의 세포 생물학 분야의 주요 접근 방식은 공개 할 목적으로, 선택한 셀 라인에 대한 관심의 유전자의 표현의 조작이 하나 이상의 유전자의 과도 / 안정 overexpression 또는 분해를 사용하여 유전자의 기능 (들)의 여러 관심. 불행하게도, 다양한 세포 생물 조사에 대해이 방법은 적합 할 때 세포의 성장 / 확산 결함이나 원치 않는 세포 분화의 유전자 발현 결과의 조작. 따라서, 연구자들은 E.에서 가져온 테트라싸이클린 억제 단백질을 (TetR), 적응 대장균의 테트라 사이클린 내성 오페론 ^1,2,3 포유류의 세포에 cDNAs을 표현하는 매우 효율적이고 긴밀한 규제 시스템을 생성합니다. 즉, TetR은의 TO에 테트라 사이클린 (Tet - 오프 시스템이라고한다)의 추가시 발기인 지역의 Tet-연산자 (TO)에 바인딩 또는 (2) 바인드에 의해 전사 (1) 블록 개시 하나에 수정되었습니다 티테트라 사이클린의 그 부재 (시스템 Tet 기능이라고한다) (그림 1). Tet - 오프 시스템은 테트라 사이클린의 지속적인 존재를 (이는 조직 세포 배양 매체에 약 24 시간의 반감기가) 필요하다는 불편을 끼쳐 드려 감안할 때 Tet는 -에서 시스템보다 폭이 매우 촉박 개발의 결과, 최적화 된 및 cDNA 표현 효율적인 벡터 시스템은 여기에 사용 된.

바로 짧은 머리 핀의 자형 RNAs (shRNAs)를 표현하는 ⁴ 포유류 세포 벡터에서 유전자 최저에 대한 RNA 간섭 (RNAi)의 설립 이후 siRNAs ^5-11와 매우 유사한이 기능은 설명했다. 유전자 타겟 세포 생존을 위해 필수적입니다 때 안정적으로 고갈이 적합하지 않을 때문에 그러나, 이러한 shRNA로 인한 최저의 접근 방법은 기존의 한방 전략과 같은 제한이 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 밴 드 Wetering 외. ¹² shRNA 표현 벡터 pSUPER에게 수정 ⁵ 여기, 우리는 효율적으로 생성하는 방법을 설명 안정된 인간 Tet-inducible에 안정적으로의 overexpression 또는 관심의 유전자의 고갈 중 하나를 운전 세포 라인. 이 방법 사용, 우리는 성공적으로 생성했습니다 Tet-에 크게 중심체 ^{13,14과 15,16 신호를} apoptosis에 산악 표준시 / hMOB / NDR 폭포의 분석을 촉진 세포 라인. 이 보고서에서 우리는 선택의 우리의 벡터를 설명 효율적으로 생성하는 데 필요한 두 개의 연속 조작 단계를 설명뿐만 아니라 인간의 Tet-에 세포 라인 (그림 2). 또한,의 생성을위한 프로토콜을 요약 외에 인간의 Tet-에 세포 라인, 우리는 중요한 기술적 절차에 관한 부분 및 특성화 세포 Tet 기능을 설명합니다.

프로토콜

1. pcDNA6_TetR_IRES_blast의 복제

1. 그림 3에 도시 된 바와 같이, 제한 효소 Xba I 및 NCO 나는 TetR 유전자와 blasticidin 저항 (BlastR) 유전자의 프로모터를 제거 할 수있는 플라스미드 pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen)의 일부 다이제스트를 수행합니다. 4.6 킬로바이트 벡터 조각을 분리합니다.
2. TetR 유전자에서 polyadenylation 순서를 제거하려면 Xho I 사이트는 즉시 TetR의 정지 코돈 cDNA의 5'end의 보존 Xba I 사이트 잠시 후 cDNA PCR에서 소개합니다. pMigR1_TetR이 플라스미드 생성하기 위해 제한 효소 Xba I과 Xho I을 사용하여 pMigR1 ^17으로 인한 조각을 Subclone.
3. TetR_IRES 조각을 출시 할 제한 효소 Xba I 및 NCO I로 pMigR1_TetR 벡터를 소화. 1.25 이하 삽입 조각을 분리합니다.
4. 4.6 킬로바이트 pcDNA6/TR와 1.25 킬로바이트 TetR_IRES 조각을 Ligate. TR관할 E.coli에 결합 제품을 ansform 및 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 원하는 pcDNA6_TetR_IRES_blast의 구조를 확인합니다.

2. 세포 라인의 생성 안정적으로 TetR을 표현

1. 1 일, 씨 1x10에서 표준 성장 매체를 사용하여 10 cm 조직 배양 접시 당 ⁶ 셀 (예 : DMEM 10 % FCS와 보충). 종자 두 개의 플레이트, pcDNA6_TetR_IRES_blast과 transfection 한, 그리고 blasticidin 선택을위한 대조군으로 다른. 가능한 가장 낮은 통로 및 권장 성장 매체를 사용하여 확인하십시오.
2. 2 일에서 transfect 제조업체의 지침에 따라 Fugene 6 일 (E2691, Promega)를 사용하여 pcDNA6_TetR_IRES_blast 2 μg과 하나가 판. 두 번째 판을 transfect하지 마십시오.
3. 3 일에 두 접시에 5 μg / ML blasticidin를 포함하는 표준 성장 매체를 추가 할 수 있습니다. 최적의 선택 농도가 주어진 셀 라인에 따라 다를 수 있습니다 및 주시기 바랍니다 수도 N사전에 결정해야 eed.
4. 일 4 일, 10 cm 접시 5 MG / ML blasticidin를 포함하는 표준 성장 매체를 사용하여 50분의 1과 1 / 100, 25분의 1, 1 / 5 셀을 분할. 제대로 untransfected 또는 transfected 세포를 포함하는 접시에 라벨을해야합니다. 희석 단계마다 두 개의 플레이트를 준비합니다.
5. untransfected 접시에있는 모든 세포는 첫 번째 주일 이내에 사망 있도록 매일 셀을 선택합니다. 모든 2-3일 선택 미디어를 변경합니다.
6. 1-2주 후, blasticidin 방지 식민지가 표시 될 것입니다. 하나의 식민지가 침투 할 수 있도록 5-50 식민지를 포함하는 접시를 선택합니다.
7. 식민지는 약 5mm (또는 더 큰)의 직경에 도달했을 때, 단일 식민지을 선택 복제 실린더를 사용하여 적어도 12 독립적 인 클론을 분리. 24 잘 조직 배양 플레이트 별도의 잘으로 각 복제를 전송합니다. 때 합류, 잘 6 잘 조직 배양 플레이트의 하나에 각도에서 세포를 분리.
8. 문화 CL로 이동선택 미디어들. 6 잘 조직 배양 플레이트의 두 단일 우물에 각도에서 때 합류, 분할 세포.
9. 각 클론을 테스트하기 위해서는 immunoblotting의 후속 테스트를 위해 다른 잘에 합류 셀 및 수확 세포의 잘 하나를 동결.
10. 서양은 마우스 단클론 항 TET02 항체 (MoBiTec GmbH가)를 사용 blotting에 의해 TetR 감지. 대조군으로 부모 세포 라인의 lysate를 포함해야합니다.
11. 가장 높은 TetR 식으로 3 클론을 선택하고 각 clonal 문화를 확장합니다. 가능한 한 빨리 각 유망 클론의 주식을 멈춰 봐. 마지막으로, TetR - 표현 클론과 함께 부모 세포 라인을 비교하여 관심의 분자 및 세포 생물학적 매개 변수를 검사합니다. 관심의 분자 및 세포 생물학적 매개 변수에 변경을 표시하지 않습니다 가장 높은 TetR 표현으로 '최고'클론을 선택합니다.

3. pTER와 PT-렉스 DEST30 벡터의 파일럿 테스트 표현각각 ING shRNA 또는 cDNAs,

1. ^12에 설명 된대로 shRNA 삽입과 플라스미드 pTER를 생성 할 수 있습니다. PT-렉스 DEST30 벡터 (12301-016, Invitrogen) 게이트웨이 기술 (Invitrogen)를 사용하여 관심있는 cDNA를 포함하는를 구성합니다. cDNA 표현의 경우, cDNA에 태그 추가 나중에 exogenously 표현 단백질의 검출을 용이하게합니다.
2. Transiently 선택의 transfection 시약을 사용하여 pTER 또는 PT-렉스 DEST30 plasmids (shRNAs 또는 관심 cDNAs 중 하나를 표현)와 부모 대상 셀 라인을 transfect. shRNA 표현 plasmids의 테스트를 위해 높은 transfection 효율을 달성 할 수 있는지 확인합니다.
3. 수확 관심의 유전자의 고갈이나 overexpression을 감지하는 기대, 해당 항체를 사용하여 immunoblotting을위한 세포와​​ 과정을 transfected.

4. 테트라싸이클린-inducible (Tet-에서) pTER 또는 PT-렉스 DEST30 벡터를 사용하여 shRNAs 또는 cDNAs의 표현과 안정적인 세포 라인의 생성

1. 1 일, 공인 테트라싸이클린 무료 혈청 (; 16000-014 Invitrogen에서 예를 들어 FBS)을 함께 보충 표준 성장 매체를 사용하여 10 cm 판 당 '최고'TetR - 표현 클론의 씨앗 1x10 ⁶ 셀 있습니다. pTER (또는 PT-렉스 DEST30) 및 더블 선정 대조군과 같은 하나 판과 transfection을위한 씨앗이 한 판. 가능한 가장 낮은 통로를 이용해야합니다.
2. 2 일에서 transfect Fugene 6을 사용 pTER 2 μg (또는 PT-렉스 DEST30)과 하나 판. 두 번째 판을 transfect하지 마십시오.
3. 일 3, 5 μg / ML blasticidin 500 μg / ML zeocin (또는 1 MG / ML G418)이 포함 된 표준 성장 매체를 추가 할 수 있습니다.
4. 일 4 일, 5 μg / ML blasticidin 500 μg / ML zeocin (또는 1 MG / ML 포함 10 cm 플레이트 및 표준 성장 매체를 사용하여 50분의 1과 1 / 100, 25분의 1, 1 / 5 셀을 분할 G418). 희석 단계마다 두 개의 플레이트를 준비합니다.
5. 첫 번째 주일 이내에 untransfected 접시에있는 모든 세포가 죽었을 확인하고, 매일 셀을 선택합니다.blasticidin 및 zeocin (또는 G418) 모든 3~4일를 포함하는 표준 성장 매체를 변경합니다.
6. 2-3주 후, blasticidin / zeocin (또는 blasticidin/G418)를 두 번 방지 식민지가 표시 될 것입니다. 하나의 식민지를 선택 5-50 식민지를 포함하는 접시를 선택합니다.
7. 식민지는 약 5mm (또는 더 큰)의 직경에 도달했을 때, 단일 식민지을 선택 복제 실린더를 사용합니다. 최소 24 개인 클론을 분리합니다. 24 잘 조직 배양 플레이트 별도의 잘으로 각 복제를 전송합니다.
8. blasticidin (5 μg / ML)와 zeocin (250 μg / ML)의 중간 포함 된 유지 보수 농도의 문화 클론 [또는 G418 (0.5 MG / ML)]. 때 합류, 잘 6 잘 조직 배양 플레이트의 하나에 각도에서 세포를 분리.
9. 각 클론을 테스트하기 위해서는 잘 6 잘 플레이트의 세 한 우물에 6 잘 판 중 하나가 합류 분할. 때 합류 잘 하나에서 세포를 동결. tetracyclin을 테스트 나머지 2 우물을 사용하여전자 inducible 표현. 두 번째 잘 테트라 사이클린 무료로 떠난 동안 잘 ... 1 μg / ML의 농도에서 테트라 사이클린을 추가합니다.
10. 적절한 항체를 사용하여 immunoblotting을위한 테트라 사이클린, 수확 셀 및 절차에 부화의 24-96 시간 후. cDNA 표현의 유도에 대한 심사 할 때 더 이상 테트라 사이클린 치료는 내생 단백질의 shRNA로 인한 고갈을 결정해야 할 것입니다 동안 짧은 테트라 사이클린의 배양 시간을 권장합니다.
11. 원하는 고갈 / overexpression과 적어도 2 클론을 선택하고 각각의 문화를 확장합니다. 가능한 한 빨리 각 유망 클론의 주식을 멈춰 봐. 실험 클론 Tet-에 성장하는 경우가 항상 테트라싸이클린 무료 혈청 및 유지 보수 농도에서 각각의 선택 항생제로 보충 미디어를 사용해야합니다.

결과

안정적 TetR을 표현 RPE-1 세포 라인의 초기 특성에 대한 예는 그림 4에 표시됩니다. 부모 셀 라인 (대조군 역할을 함) 외인성 TetR 단백질을 표현하지 않는 동안 모든 RPE-1 클론은 (그림 4 차선 1), (레인 2, 5 비교) TetR의 수준을 다양한 표현합니다. RPE-1 중 TetR 식의이 유사 Tet이 기능 세포 클론 예상되며, plasmids을 표현 TetR의 표현부터 플라스미드 통합 사이트에 크게 의존합니다. ...

토론

우리는 Tet-에 시스템이 크게 특히 조작 유전자가 세포 생존에 필수적인 경우 조작 및 / 또는하기가 어렵 전지 시스템에서 유전자 기능의 분석을 용이하게 있다고 생각합니다. 또한, 매우 구체적인 Tet-에 시스템에 의해 유전자 발현을 제어 할 수있는 능력은 다른 단계 (세포주기의 진행이나 ​​잘 정의 된 차별화 프로세스 동안 예를 들어)에 유전자 기능을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 여기...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
태아 소 혈청 (FBS)	Invitrogen	16000-044	테스트 Tet 무료
Blasticidin	Invivogen	개미-BL-1
Zeocin	Invivogen	개미 - 아연-5
G418	PAA 실험실	P31-011	미디어 100 MG / ML
안티 TET02	MoBiTec GmbH의	TET02	WB에 1,000분의 1 to 2천분의 1에서 사용
pcDNA6/TR	Invitrogen	V1025-20
PT-렉스 DEST30	Invitrogen	12301-016
테트라싸이클린	시그마	87,128	2 밀리그램 / 에탄올에 ML
Doxycycline	시그마	D9891	2 밀리그램 / 물에 ML
복제 실린더	Bellco 유리 주식회사	2090-00808	다시 사용 가능한