テトラサイクリン誘導性（テトオン）shRNAまたはcDNA発現で安定ヒト細胞株の世代

要約

誘導性と目的の遺伝子のcDNAを過剰発現可逆またはshRNA媒介ノックダウンしたヒト細胞株を生成するために迅速かつ簡単な方法です。この方法は、確実に研究を可能にし、高度な再現性一過性トランスフェクションの方法または従来のノックダウン/ノックアウト戦略によって変更することは困難である細胞株を操作します。

要約

哺乳類の細胞生物学の分野での主要なアプローチは、遺伝子の安定/一過性過剰発現またはノックダウンを使用して、1つ以上の遺伝子の機能のいくつか（複数可）を明らかにする目的で、選択された細胞株において、目的の遺伝子の発現の操作です興味のある。残念なことに、様々な細胞生物学的研究のためにこのアプローチは、細胞の成長/増殖欠陥や不要な細胞分化における遺伝子発現結果の不適切な操作です。したがって、研究者は、 大腸菌から取らテトラサイクリンリプレッサータンパク質（TetRを）、適応している大腸菌のテトラサイクリン耐性オペロン^1、2,3、哺乳動物細胞でのcDNAを表現するために非常に効率的かつタイトな規制制度を生成する。要するに、TetRをINにするテトラサイクリン（Tet-オフシステムと呼ばれる）を添加した際のプロモーター領域におけるテト - オペレーター（TO）に結合すること、または（2）に結合することにより転写のブロック（1）開始のいずれかに変更されましたトンテトラサイクリンの彼が不在（システムテトオンと呼ばれる）（ 図1）。テトオフシステムは非常にタイトなの開発で、その結果、テトラサイクリンの連続的な存在（組織細胞培養培地中で約24時間の半減期を持っている）テトオンシステムがより広範囲に最適化されているが必要であることを不便与えとcDNA発現のための効率的なベクター系は、ここで使用される。

まもなく、哺乳動物細胞における⁴遺伝子ノックダウンのためのRNA干渉（RNAi）の設立後、ショートヘアピンRNA（shRNA）を発現ベクターは、siRNAは^5月11日と非常によく似て、その関数を記述した。遺伝子標的は、細胞の生存に必須であるときに安定枯渇が現実的ではありませんので、しかし、これらのshRNAによるノックダウンのアプローチは、従来のノックアウト戦略と同じ制限があります。この制限を克服するために、バン·デ·ウェテリンクらは¹²のshRNA発現ベクターpSUPER ^5変更 ここでは、効率的に安定した人間テトオンを生成するために、確実に目的の遺伝子の過剰発現誘導または枯渇のどちらかを駆動する細胞株の方法を説明します。この方法を使用すると、我々は正常に生成したテトオン著しく中心体^13,14と^15,16シグナリングアポトーシスのMST / hMOB / NDRカスケードの解析を容易にした細胞株。本稿では、選択した私たちのベクトルを記述し、効率的に生成するために必要な2つの連続した操作手順を記述することに加えて、人間テトオン細胞株（ 図2）。さらに、ヒトテトオン細胞株を樹立するためのプロトコルを概説に加えて、我々は技術的な手順およびTet-上の細胞の特性に関する重要な側面について説明します。

プロトコル

1。 pcDNA6_TetR_IRES_blastのクローニング

1. 図3に示すように、私はTetRを遺伝子とブラストサイジン耐性（BlastR）遺伝子のプロモーターを除去するために、制限酵素 XbaIとNCOとプラスミドpcDNA6/TRの部分ダイジェスト（V1025-20、Invitrogen）を実行します。 4.6kbのベクター断片を分離します。
2. TetRを遺伝子からポリアデニル化配列を削除するには、すぐに、cDNAの5 '末端に節約XbaI部位間のcDNA TetRのストップコドンの後、PCRによりXhoI部位をご紹介します。サブクローンプラスミドpMigR1_TetRを生成するために、制限酵素 XbaI 及び XhoIを用いてpMigR1 ¹⁷に得られた断片。
3. 私はTetR_IRESの断片を放出するために、制限酵素 XbaIとNCOとpMigR1_TetRベクトルを消化。 1.25キロバイトの挿入断片を分離します。
4. 4.6キロバイトpcDNA6/TRと1.25キロバイトTetR_IRESフラグメントをライゲーションする。 TR有能なE.coliにライゲーション産物をansformと標準的な分子生物学的技術を用いて、所望のpcDNA6_TetR_IRES_blastコンストラクトを識別します。

2。安定的TetRを発現する細胞株の生成

1. 1日目、シード標準の成長培地（ 例えば、DMEM、10％FCSを補充した）を使用して、10cmの組織培養プレートあたり^{1×10 6}細胞。シード2プレート、pcDNA6_TetR_IRES_blastを用いたトランスフェクションのためのもの、とブラストの選択のための陰性対照として他のを。可能な限り低い通路と推奨成長培地を使用することを確認します。
2. 2日目に、製造元の指示に従ってFUGENE 6（E2691、Promega）を用いてpcDNA6_TetR_IRES_blast2μgのトランスフェクションと1プレート。第二のプレートをトランスフェクトしないでください。
3. 3日目に、両方のプレートに5μg/ mlのブラストサイジンを含む標準的な増殖培地を追加します。最適な選択濃度が与えられた細胞株ごとに異なり、そしてnかもしれない場合がありますのでご了承くださいあらかじめ決定されてEED。
4. 4日目に、10cmのプレートと5 mg / mlのブラストサイジンを含む標準的な増殖培地を用いて1/50、1/100、1/25、1/5でセルを分割する。正しく非トランスフェクトまたはトランスフェクトされた細胞を含むプレートにラベルを付けていることを確認してください。希釈段階ごとに2つのプレートを準備します。
5. トランスフェクトされていないプレート上のすべてのセルが1週間以内に死亡していることを確認し、毎日の細胞をチェックしてください。 2〜3日ごとに選択培地を変更します。
6. 1-2週間後、ブラストサイジン耐性コロニーが現れ始めるべきである。シングルコロニーをピックアップすることができることを保証するために5から50コロニーを含むプレートを選択します。
7. コロニーは約5mm（またはより大きい）の直径に達したときは、シングルコロニーをピックアップするクローニングシリンダを使用して少なくとも12の独立したクローンを分離する。 24ウェル組織培養プレートの別々のウェルに各クローンを転送します。ときに合流、6ウェル組織培養プレートのウェル1つ1つに、各ウェルから細胞を分割します。
8. 文化CLに続ける選択培地のもの。 6ウェル組織培養プレートの2つの単一のウェルに各ウェルからすると合流、分割細胞。
9. 各クローンがテストされるためには、免疫ブロット法によるその後のテストのために他の井の中のコンフルエントの細胞と細胞の収穫だけでなく1を凍結。
10. 西洋は、マウスモノクローナル抗TET02抗体（MoBiTec GmbH）を用いてブロッティングによりTetRを検出します。陰性対照として親細胞株のライセートを含めることを忘れないでください。
11. 最高TetRを式を使って3つのクローンを選択し、各クローン培養を展開します。できるだけ早く各クローンの有望株を凍結。最後に、TetRを発現クローンと親細胞株を比較することにより、目的の分子および細胞生物学的パラメータを調べます。興味のある分子細胞生物学的パラメーターに変更を加える場合には表示されません最高TetRを発現と '最高'クローンを選択します。

3。 pTERとPT-レックスのパイロットテストDEST30ベクトルエクスプレスそれぞれるshRNAまたはcDNAは、

1. ^12に記載され^ているよう^にするshRNAインサートとプラスミドpTERを生成します。 PT-レックスDEST30ベクトル（12301から016、インビトロジェン）ゲートウェイ技術（Invitrogen）を用いて、目的のcDNAを含むを構築します。 cDNA発現の場合には、cDNAへのタグの追加は後で外因的に発現されたタンパク質の検出を容易にするでしょう。
2. 一過性の選択のトランスフェクション試薬を用いpTERまたはPT-レックスDEST30プラスミド（shRNAのや目的のcDNAのいずれかを発現する）を持つ親の標的細胞系をトランスフェクト。 shRNA発現プラスミドのテストのために、高いトランスフェクション効率を達成することができることを確認してください。
3. 収穫は、目的の遺伝子の枯渇または過剰発現を検出するために期待して、適切な抗体を用いたイムノブロッティング用の細胞およびプロセスをトランスフェクションした。

4。テトラサイクリン誘導性（テトオン）pTERまたはPT-レックスDEST30ベクトルを用いたshRNAまたはcDNAの発現で安定細胞株の作製

1. 1日目、シード認定テトラサイクリン無血清（例えばInvitrogenからFB用、16000から014）を補充したあなたの標準的な増殖培地を用いて10 cmのプレートあたり'最高' TetRを発現クローンの^{1×10 6}細胞。 pTER（またはPT-レックスDEST30）、二重選択のための陰性対照として、一枚の板を用いたトランスフェクションのための種1プレ​​ート。可能な限り低い通路を使用してください。
2. 2日目に、トランスフェフェクション6を使用してpTER2μgの（またはPT-レックスDEST30）と1プレート。第二のプレートをトランスフェクトしないでください。
3. 3日目、5μg/ mlのブラストおよび500μg/ mlのゼオシン（または1 mg / mlのG418）を含む標準培地を追加します。
4. 4日目、5μg/ mlのブラストおよび500μg/ mlのゼオシン（または1 mg / mlの含む10cmのプレートと標準的な増殖培地を用いて1/50、1/100、1/25、1/5でセルを分割するG418）。希釈段階ごとに2つのプレートを準備します。
5. 1週間以内にトランスフェクトしていないプレート上の全ての細胞が死亡していることを確認しながら、毎日の細胞をチェックしてください。3〜4日ごとにブラストとゼオシン（またはG418）を含む標準培地を変更します。
6. 2-3週間後、ブラストサイジン/ゼオシン（またはblasticidin/G418）二重耐性コロニーが現れ始めるべきである。シングルコロニーをピックアップし5から50コロニーを含むプレートを選択します。
7. コロニーは約5mm（またはより大きい）の直径に達したときは、シングルコロニーをピックアップしクローニングシリンダーを使用しています。少なくとも24個々のクローンを単離する。 24ウェル組織培養プレートの別々のウェルに各クローンを転送します。
8. ブラストサイジン（5μg/ ml）をとゼオシン（250μg/ ml）を含む培地メンテナンス濃度の培養クローン[またはG418（0.5 mg / ml）を]。ときに合流、6ウェル組織培養プレートのウェル1つ1つに、各ウェルから細胞を分割します。
9. 各クローンがテストされるためには、6ウェルプレートの3つの単一のウェルに6ウェルプレートの1がコンフルエントに分割。コンフルエント時、よく1から細胞を凍結。テトラサイクリンをテストするために、残りの2ウェルを使用電子誘導発現。無料第2ウェルテトラサイクリンを残しながら、よく1〜1μg/ mlの濃度でテトラサイクリンを追加します。
10. 適切な抗体を用いたイムノブロッティング用のテトラサイクリン、収穫細胞やプロセスとのインキュベーションの24から96時間後。 cDNA発現の誘導のためにスクリーニングする際に長くテトラサイクリン治療が内因性タンパク質のshRNA媒介枯渇を決定することが必要になりますしながら短いテトラサイクリンのインキュベーション時間は、推奨されています。
11. 希望の枯渇/過剰発現を有する少なくとも2つのクローンを選択し、それぞれの文化を展開します。できるだけ早く各クローンの有望株を凍結。実験用クローンのTet-に生育する場合は必ずテトラサイクリン無血清およびメンテナンス濃度で各選択抗生物質を添加した培地を使用してください。

結果

安定TetRを発現し、RPE-1細胞株の初期特性の例を図4に示します。親細胞ラインは（ネガティブコントロールとしても機能します）外因TetRタンパク質を発現しない間、すべてのRPE-1クローンは（ 図4、レーン1）、（レーン2および5を比較）TetRのレベルを変えることで表現することに注意してください。発現プラスミドTetRの発現プラスミドの組込み部位に大きく依存して?...

ディスカッション

我々はテトオンシステムが大幅に特に操作遺伝子は細胞の生存に必須であるときに操作および/またはすることが困難である細胞系において、遺伝子機能の解析を容易にすると信じています。さらに、高度に特異的なテトオンシステムによって遺伝子発現を制御する能力は、様々な段階（細胞周期の進行や、明確に定義された分化プロセス中など）で遺伝子の機能を研究する機会を提供してい...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
ウシ胎児血清（FBS）	インビトロジェン	16000-044	テストされたテトフリー
ブラストサイジン	Invivogen	ANT-BL-1
ゼオシン	Invivogen	ANT-Zn系5
G418	PAAラボラトリーズ	P31-011	メディアでは100 mg / mlの
抗TET02	MoBiTec社	TET02	WBのための1/1000〜1/2000に使用
pcDNA6/TR	インビトロジェン	V1025-20
PT-レックスDEST30	インビトロジェン	12301-016
テトラサイクリン	シグマ	87128	エタノールで2 mg / mlの
ドキシサイクリン	シグマ	D9891	水中で2 mg / mlの
クローニングシリンダー	ベルコグラス株式会社	2090から00808	再利用可能な