Generierung von stabilen menschlichen Zelllinien mit Tetracyclin-induzierbarer (Tet-on) shRNA oder cDNA Expression

Zusammenfassung

Eine schnelle und einfache Art und Weise die menschliche Zelllinien mit induzierbarer und reversible cDNA Überexpression oder shRNA-vermittelte Knock-down des Gens von Interesse zu erzeugen. Diese Methode ermöglicht es Forschern, zuverlässig und hoch reproduzierbar zu manipulieren Zelllinien, die nur schwer durch transiente Transfektion Methoden oder konventionellen knockdown / Knockout-Strategien zu verändern sind.

Zusammenfassung

Ein wichtiger Ansatz im Bereich der Säugerzelle Biologie ist die Manipulation der die Expression von Genen von Interesse in ausgewählten Zellinien, mit dem Ziel, zu enthüllen einem oder mehreren der des Gens Funktion (en) unter Verwendung von transienten / stabile Überexpression oder Knockdown des Gens von Interesse. Leider für verschiedene zellbiologische Untersuchungen dieser Ansatz ist ungeeignet, wenn Manipulationen der Genexpression führen Zellwachstum / Zellproliferation Mängel oder unerwünschte Zelldifferenzierung. Daher haben Forscher die Tetracyclin-Repressorprotein (TetR), genommen aus dem E. angepaßt coli Tetracyclin-Resistenz-Operons ^1, zu einer sehr effizienten und engen regulatorischen Systeme zu erzeugen, um cDNAs in Säugerzellen ^2,3 auszudrücken. Kurz gesagt, hat TetR um entweder (1) Block Initiation der Transkription wurde durch Bindung an das Tet-Operator (TO) in der Promotorregion nach Zugabe von Tetracyclin (Tet-off bezeichnet System) oder (2) binden an die AN in modifizierter tEr Abwesenheit von Tetracyclin (sog. Tet-On-System) (Abbildung 1). Angesichts der Unannehmlichkeiten, das Tet-Off-System die kontinuierliche Anwesenheit von Tetracyclin (welches eine Halbwertszeit von etwa 24 Stunden in Gewebe Zellkulturmedium) erfordert das Tet-On-System wurden ausführlicher optimiert, was in der Entwicklung von sehr engen und effiziente Vektor-Systeme für die cDNA-Expression, wie hier verwendet.

Kurz nach der Gründung der RNA-Interferenz (RNAi) für die Gen-Knockdown in Säugetierzellen ^4, Vektoren, kurz-hairpin RNAs (shRNAs) beschrieben wurden diese Funktion sehr ähnlich siRNAs ^5-11. Jedoch haben diese shRNA-vermittelte Knockdown Ansätze die gleiche Einschränkung wie herkömmliche Knockout Strategien, da stabile Abreicherung nicht durchführbar, wenn Genziele für zelluläre Überleben essentiell. Um diese Einschränkung zu umgehen, van de Wetering et al. ¹² veränderte die shRNA Expressionsvektor pSUPER ⁵ Hier beschreiben wir ein Verfahren effizient zu erzeugen stabilen menschlichen Tet-On Zell-Linien, die zuverlässig fahren entweder induzierbare Überexpression oder Abreicherung des Gens von Interesse. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich generiert Tet-on-Zelllinien, die wesentlich erleichtert die Analyse der MST / hMOB / NDR Kaskade in Zentrosom ^13,14 und Apoptose Signalisierung ^15,16. In diesem Bericht beschreiben wir unsere Vektoren der Wahl, neben der Beschreibung der zwei aufeinander folgenden Manipulationen Schritte, die erforderlich sind, um effizient zu erzeugen sind menschliche Tet-on-Zelllinien (Abbildung 2). Außerdem neben umreißt ein Protokoll für die Herstellung von menschlichen Tet-On Zell-Linien werden wir kritischen Aspekte hinsichtlich der technischen Verfahren und die Charakterisierung von Tet-On-Zellen zu diskutieren.

Protokoll

Ein. Klonierung pcDNA6_TetR_IRES_blast

1. Wie in 3 dargestellt, führen einen teilweisen Verdau des Plasmids pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen) mit den Restriktionsenzymen Xba I und Nco I, die TetR-Gen und den Promotor des Blasticidin Widerstand (BlastR)-Gen zu entfernen. Isolieren Sie die 4,6 kb Vektorfragment.
2. Um die Polyadenylierungssequenz aus der TetR-Gen zu entfernen, durch PCR einzuführen eine Xho I-Stelle unmittelbar nach dem Stop-Codon des TetR cDNA gleichzeitiger Schonung der Xba I-Stelle am 5'-Ende der cDNA. Subklonieren das resultierende Fragment in pMigR1 ¹⁷ unter Verwendung von Restriktionsenzymen XbaI und XhoI zur Erzeugung des pMigR1_TetR Plasmid.
3. Verdauen pMigR1_TetR Vektor mit den Restriktionsenzymen Xba I und Nco I-Fragment, um die TetR_IRES freizugeben. Isolieren Sie das 1,25 kb Insert-Fragment.
4. Ligieren das 4,6 kb pcDNA6/TR und die 1,25 kb TetR_IRES Fragmente. Transform des Ligationsprodukts in kompetente E.coli und Identifizierung des gewünschten pcDNA6_TetR_IRES_blast Konstrukt unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken.

2. Generierung von Zelllinien stabil exprimieren TetR

1. Am Tag 1 Seed 1x10 ⁶ Zellen pro 10-cm Gewebekulturplatte mit Ihrem Standard-Wachstumsmedium (zB DMEM ergänzt mit 10% FCS). Seed zwei Platten, eine für die Transfektion mit pcDNA6_TetR_IRES_blast, und die andere als eine negative Kontrolle für Blasticidin Selektion. Stellen Sie sicher, den günstigsten Durchgang möglich und die empfohlene Wachstumsmedium zu verwenden.
2. Am Tag 2 transfizieren eine Platte mit 2 ug pcDNA6_TetR_IRES_blast mit Fugene 6 (e2691, Promega) nach den Anweisungen des Herstellers. Nicht transfizieren die zweite Platte.
3. Am Tag 3, fügen Standard Wachstumsmedium mit 5 ug / ml Blasticidin an beide Platten. Bitte beachten Sie, dass die optimale Auswahl Konzentration kann für eine bestimmte Zelllinie variieren und vielleicht need vorher festgelegt werden.
4. Am Tag 4 aufgeteilt, die Zellen mit 1/5, 1/25, 1/50 und 1/100 unter Verwendung von 10-cm Platten und Standard-Wachstumsmedium, das 5 mg / ml Blasticidin. Stellen Sie sicher, richtig zu beschriften Platten mit untransfizierte oder transfizierten Zellen. Bereiten Sie zwei Platten pro Verdünnungsstufe.
5. Überprüfen Zellen täglich, sicherzustellen, dass alle Zellen auf den transfizierten Platten haben innerhalb der ersten Woche gestorben. Auswahl ändern media alle 2-3 Tage.
6. Nach 1-2 Wochen sollte Blasticidin-resistente Kolonien beginnen zu erscheinen. Wählen Platten mit 5 bis 50 Kolonien, sicherzustellen, dass einzelne Kolonien ausgewählt werden können.
7. Wenn Kolonien haben einen Durchmesser von ca. 5 mm (oder größer) erreicht, Isolieren mindestens 12 unabhängigen Klonen mittels Klonierung Zylindern, um einzelne Kolonien zu wählen. Übertragen jeder Klon in ein separates Loch einer 24-Well Gewebekulturplatte. Wenn konfluent, spalten die Zellen aus jeder Vertiefung in einem einzigen Well einer 6-Well-Gewebekulturplatte.
8. Weiter zu Kultur cldiejenigen in der Auswahl Medien. Wenn konfluent, geteilte Zellen aus jeder Vertiefung in zwei einzelne Vertiefungen einer 6-well Gewebekulturplatten.
9. Für jeden zu testenden Klon, eingefroren eine Vertiefung konfluenten Zellen und Ernte Zellen in der anderen gut für nachfolgende Prüfung durch Immunblotting.
10. Detect TetR durch Western-Blot mit dem monoklonalen anti-TET02 Antikörper (MoBiTec GmbH). Erinnern, um ein Lysat der parentalen Zelllinie als Negativkontrolle umfassen.
11. Wählen Sie 3 Klone mit der höchsten TetR Ausdruck und erweitern Sie jeden klonalen Kultur. Einfrieren Bestände jedes vielversprechende Klon so schnell wie möglich. Schließlich prüft die molekularen und zellbiologischen interessierenden Parameter durch Vergleichen der parentalen Zellinien mit den TetR-exprimierenden Klonen. Wählen Sie den "besten" Klon mit der höchsten TetR Ausdruck, der nicht angezeigt wird keine Veränderungen in den molekularen und zellbiologischen Parameter von Interesse.

3. Pilot Prüfung von pter und pT-Rex DEST30 Vektoren Expressten shRNA oder cDNAs, Jeweils

1. Generieren PTER Plasmid mit shRNA Inserts ^12, wie beschrieben. Konstrukt pT-Rex DEST30 Vektor (12.301 bis 016, Invitrogen), enthaltend die cDNA von Interesse mittels Gateway-Technologie (Invitrogen). Im Fall von cDNA-Expression wird die Zugabe eines Tags der cDNA später zu erleichtern Erkennung von exogen exprimierten Proteins.
2. Transient zu transfizieren die elterliche Zielzelle Einklang mit PTER oder pT-Rex DEST30 Plasmide (Ausdruck entweder shRNAs oder cDNAs von Interesse) mit dem Transfektionsreagenz der Wahl. Für die Prüfung von shRNA Expressionsplasmide, sorgen für eine hohe Transfektionseffizienz erreicht werden kann.
3. Ernte transfizierten Zellen und Verfahren zur Immunoblot mit den entsprechenden Antikörpern in der Erwartung, eine Verarmung oder Überexpression des Gens von Interesse zu erkennen.

4. Erzeugung von stabilen Zelllinien mit Tetrazyklin-induzierbarer (Tet-On) Expression von cDNAs oder shRNAs Verwenden PTER oder pT-Rex DEST30 Vektoren

1. Am Tag 1, Saatgut 1x10 ⁶ Zellen der 'besten' TetR-exprimierenden Klon pro 10-cm-Platte mit Ihrem Standard-Wachstumsmedium mit zertifizierten Tetracyclin-Serum (zB FBS von Invitrogen; 16.000-014) ergänzt. Samen einer Platte für die Transfektion mit PTER (oder pT-Rex DEST30) und eine Platte als Negativkontrolle für Doppelselektion. Stellen Sie sicher, den günstigsten Durchgang möglich zu nutzen.
2. Am Tag 2 transfizieren eine Platte mit 2 ug PTER (oder pT-Rex DEST30) mit Fugene 6. Nicht transfizieren die zweite Platte.
3. Am Tag 3, fügen Standard Wachstumsmedium mit 5 ug / ml Blasticidin und 500 ug / ml Zeocin (oder 1 mg / ml G418).
4. Am Tag 4 teilen die Zellen mit 1/5, 1/25, 1/50 und 1/100 mit 10-cm-Platten und Standard Wachstumsmedium mit 5 ug / ml Blasticidin und 500 ug / ml Zeocin (oder 1 mg / ml G418). Bereiten Sie zwei Platten pro Verdünnungsstufe.
5. Überprüfen Sie die Zellen täglich, um sicherzustellen, dass innerhalb der ersten Woche alle Zellen auf den transfizierten Platten sind gestorben.Ändern Sie den Standard-Wachstumsmedium mit Blasticidin und Zeocin (oder G418) alle 3-4 Tage.
6. Nach 2-3 Wochen, Blasticidin / Zeocin (oder blasticidin/G418) Doppel-resistente Kolonien sollten beginnen zu erscheinen. Wählen Platten mit 5 bis 50 Kolonien, um einzelne Kolonien zu pflücken.
7. Wenn Kolonien haben einen Durchmesser von ca. 5 mm (oder größer) erreicht, verwenden Klonen Zylindern, um einzelne Kolonien zu pflücken. Isolieren mindestens 24 einzelnen Klonen. Übertragen jeder Klon in ein separates Loch einer 24-Well Gewebekulturplatte.
8. Kultur Klone in Medium, das Wartungs-Konzentrationen von Blasticidin (5 ug / ml) und Zeocin (250 pg / ml) [oder G418 (0,5 mg / ml)]. Wenn konfluent, spalten die Zellen aus jeder Vertiefung in einem einzigen Well einer 6-Well-Gewebekulturplatte.
9. Für jeden zu testenden Klon, aufgeteilt ein konfluenter Well einer 6-Well-Platte in drei einzelnen Wells einer 6-Well-Platte. Wenn konfluent, einzufrieren Zellen von einem gut. Verwenden Sie die verbleibenden zwei Kavitäten für die Prüfung der TetracyclinE-induzierbare Expression. Fügen Tetracyclin in einer Konzentration von 1 pg / ml zu einem gut, während die zweite und Tetracyclin kostenlos.
10. Nach 24 bis 96 Stunden Inkubation mit Tetracyclin, Ernte-Zellen und Verfahren zur Immunoblotting unter Verwendung geeigneter Antikörper. Kürzere Tetracyclin Inkubationszeiten werden empfohlen, wenn Screenen für die Induktion von cDNA-Expression, während längere Tetracyclin Behandlungen notwendig sein wird, shRNA-vermittelte Abreicherung von endogenen Proteinen zu bestimmen.
11. Wählen Sie mindestens zwei Klone mit der gewünschten Abbau / Überexpression und erweitern jede Kultur. Einfrieren Bestände jedes vielversprechende Klon so schnell wie möglich. Beim Anbau von Tet-on-Klone für Experimente immer darauf achten, Medien mit Tetracyclin-freies Serum und den jeweiligen Selektionsantibiotika bei Wartung Konzentrationen ergänzt verwenden.

Ergebnisse

Ein Beispiel für die erstmalige Beschreibung RPE-1-Zelllinien stabil exprimieren TetR ist in Abbildung 4 dargestellt. Beachten Sie, dass alle RPE-1 Klone unterschiedlicher TetR ausdrücken (vgl. Bahnen 2 und 5), während die elterliche Zelllinie (die als negative Kontrolle) nicht exprimiert die exogene TetR-Protein (Abbildung 4, Spur 1). Diese Variation in TetR Expression unter RPE-1 Tet-On Zell-Klone wird erwartet, da die Expression des TetR exprimierenden Plasmiden ist stark abhängi...

Diskussion

Wir glauben, dass Tet-On-Systeme erheblich erleichtern die Analyse der Genfunktion, insbesondere in Zellsysteme, die schwierig zu manipulieren und / oder wenn die manipulierte Gen ist essentiell für das Überleben der Zelle sind. Darüber hinaus bietet die Fähigkeit, die Genexpression durch hochspezifische Tet-On-Systeme kontrollieren die Möglichkeit Genfunktionen in verschiedenen Phasen (zum Beispiel während der Zellzyklusprogression oder wohldefinierten Differenzierungsprozesse) studieren. Die hier vorgestellten V...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Fötales Rinderserum (FBS)	Invitrogen	16000-044	Überprüft Tet-free
Blasticidin	Invivogen	ant-bl-1
Zeocin	Invivogen	ant-zn-5
G418	PAA Laboratories	P31-011	100 mg / ml im Medium
Anti-TET02	MoBiTec GmbH	TET02	Verwenden Sie bei 1/1000 bis 1/2000 für WB
pcDNA6/TR	Invitrogen	V1025-20
pT-Rex DEST30	Invitrogen	12301-016
Tetracycline	Sigma	87128	2 mg / ml in Ethanol
Doxycycline	Sigma	D9891	2 mg / ml in Wasser
Cloning Zylinder	Bellco Glass Inc.	2090-00808	wieder verwendbare