（TET-ON）与四环素诱导shRNA或cDNA表达生成稳定的人类细胞系

摘要

一种快速简便的方法来产生人类细胞系诱导的，可逆的基因表达或shRNA介导的，感兴趣的基因敲除。此方法使研究人员能够可靠地和高再现性操作的细胞系，是很难改变，通过瞬时转染的方法或常规的击倒/基因敲除策略。

摘要

一个主要的方法在哺乳动物细胞生物学领域是操纵在选定的单元格线的兴趣基因的表达，的目的是显示一个或多个该基因的功能（次）瞬态/稳定过表达或敲除的基因的兴趣。不幸的是，这种做法是不合适的各种细胞生物学研究时，操纵细胞的生长/的增殖缺陷或不需要的细胞分化的基因表达的结果。因此，研究人员已经适应了四环素阻遏蛋白（四环素），采取从E.大肠杆菌四环素抗性操纵子^1，生成非常高效和严格的监管系统，以表达在哺乳动物细胞中的cDNA ^2,3。总之，四环素 - 已被修改，或者（1）块转录起始的绑定到在Tet-运算符（TO）的启动子区域中添加四环素（称为Tet-off系统）时，或（2）结合的TO在吨他没有四环素（称为的Tet-系统）（ 图1）。鉴于不便Tet-off系统需要四环素（它具有的半衰期为约24小时，在组织细胞培养基）的持续存在的Tet-系统上的已被更广泛地优化，在很紧的发展所导致的和高效的cDNA表达载体系统，在这里使用。

成立后不久的RNA干扰（RNAi）的基因敲除在哺乳动物细胞中，载体表达的短发夹RNA（shRNA片段）进行了描述，非常到的siRNA ^5-11类似的功能。然而，这些shRNA介导的敲除的方法具有相同的限制，与传统的基因敲除策略，当靶基因的细胞存活是必不可少的，因为稳定的消耗是不可行的。为了克服这种局限性，面包车韦特灵等 ¹²修改的shRNA表达载体pSUPER ⁵ 在这里，我们描述了一个方法，有效地生成稳定的人的春节，可靠地驱动"诱导表达或枯竭，感兴趣的基因的细胞株。使用这种方法，我们已经成功生成春节细胞株，大大促进了分析的的MST / hMOB / NDR级联中心体^13,14和凋亡信号^15,16。在此报告中，我们描述我们给出的载体，除了描述的两个连续的操作步骤是必要的以有效地产生人的Tet-细胞系（ 图2）。此外，除了概述的产生的一个协议，用于人类的Tet-细胞系中，我们将讨论有关的技术程序和表征的Tet-细胞上的关键方面。

研究方案

1。克隆pcDNA6_TetR_IRES_blast

1. 正如图3中所示，执行pcDNA6/TR质粒（V1025-20，Invitrogen公司）用限制性酶XbaⅠ和Nco I位删除的四环素基因和启动子的杀稻瘟素的电阻（BlastR）基因的部分的摘要。隔离4.6 kb的载体片段。
2. 要删除从四环素基因的多聚腺苷酸化序列，通过PCR引入XhoⅠ位点后，立即停止密码子，四环素，同时节省的Xba I位点的cDNA的5'末端的cDNA。使用限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ位生成pMigR1_TetR质粒亚克隆所得片段插入pMigR1 ^17，。
3. 消化pMigR1_TetR载体用限制性酶XbaⅠ和Nco I位，释放TetR_IRES片段。隔离1.25 kb的插入片段。
4. 结扎:4.6 KB pcDNA6/TR和1.25 kb的TetR_IRES片段。风帆连接产物ansform主管大肠杆菌，并使用标准的分子生物学技术确定所需的pcDNA6_TetR_IRES_blast结构。

2。代稳定表达的细胞系四环素

1. 在第1天，种子1×10 ^6个细胞每10厘米的组织培养板中，使用标准的生长培养基（ 例如，用10％FCS的DMEM培养液）。种子两块板，一个用于转染pcDNA6_TetR_IRES_blast，和其他的杀稻瘟素的选择作为阴性对照。确保使用最低的通道可能和推荐的生长培养基中。
2. 在第2天，转染2微克pcDNA6_TetR_IRES_blast使用Fugene 6（E2691，Promega）中，按照生产商的说明的一个板。不要转染第二板。
3. 第3天，标准生长介质中含有5微克/毫升杀稻瘟到这两个板块。请注意，对于一个给定的细胞系的最佳选择的浓度可能会有所不同，可能Ň电火工品必须预先确定。
4. 在第4天，细胞分裂，在1/5，1/25，1/50和1/100使用10-cm的板和标准的生长培养基中含有5毫克/毫升的杀稻瘟素。确保正确标注板未转染或转染的细胞。准备两个板块每股稀释步骤。
5. 每天检查细胞，确保所有细胞的转染板的第一个星期内相继去世。更改选择媒体每隔2-3天。
6. 1-2周后，杀稻瘟素抗性集落开始出现。选择板，含有5〜50的菌落，以确保单个菌落可以拾取。
7. 当菌落已经达到了一个直径大约5毫米（或更大），隔离至少12个独立的克隆，使用克隆缸挑选单个菌落。每个克隆转移到一个单独的24孔组织培养板的孔。当融合时，从每个孔中的细胞分裂成一个单一的孔的6孔组织培养板中。
8. 继续文化CL在选择媒体的。当融合时，从每个孔中的分裂细胞分为两个单独的6孔组织培养板的孔中。
9. 对于每个要测试的克隆，冻结一个孔的融合细胞和收获细胞，通过免疫印迹法的其他以及随后的测试。
10. 通过Western印迹法使用小鼠单克隆抗TET02抗体（MoBiTec联系）检测四环素。请记住，包括作为阴性对照的亲代细胞系的裂解物。
11. 四环素表达最高和扩大选择3个克隆，每一个克隆培养。尽快冻结股票的每一个有前途的克隆。最后，通过比较亲本细胞系与四环素表达克隆研究的分子和细胞生物学参数。选择"最好"的克隆与四环素表达最高不显示任何改变的分子和细胞生物学参数。

3。试点测试pTER和PT-REX DEST30载体的表达ING shRNA或的cDNA，

1. 生成pTER的shRNA插入质粒的说明^12。构建的PT-，雷克斯DEST30载体（12301-016 Invitrogen公司）的cDNA使用网关技术（Invitrogen公司）的利益。以cDNA表达的情况下，添加了标签的cDNA将购买方便外源性表达的蛋白质的检测。
2. 瞬时转染父母的靶细胞系与pTER或PT-REX的DEST30的质粒（无论是的shRNA表达或cDNA的利益）的转染试剂的选择。的shRNA表达载体的测试，确保可以达到较高的转染效率。
3. 收获转染细胞和免疫过程使用相应的抗体，期待您感​​兴趣的基因检测耗尽或过度表达。

4。与四环素诱导（TET-ON）的shRNA的表达或cDNA使用pTER或PT-REX DEST30载体的的稳定细胞系产生的

1. 第1天，种子1×10 ^6个细胞的'最好'的四环素表达克隆，每10厘米的板使用标准认证的四环素无血清（例如FBS自Invitrogen 16000-014）生长培养基。种子的一个极板与pTER（或的pT-雷克斯DEST30），和一个板作为阴性对照双重选择用于转染。确保尽可能用最低的通道。
2. 在第2天，转染用2微克的pTER使用Fugene 6（或的pT-雷克斯DEST30）的一个极板。不要转染第二板。
3. 在第3天，添加的标准生长培养基含有5μg/ ml的杀稻瘟素和500微克/毫升吉欧霉素（或1毫克/毫升的G418）。
4. 在第4天，细胞分裂，在1/5，1/25，1/50和1/100使用10厘米的板和标准的生长培养基中含有5微克/毫升杀稻瘟素和500微克/毫升吉欧霉素（或1毫克/毫升G418）。准备两个板块每股稀释步骤。
5. 每天检查细胞，使确定的第一个星期内的所有单元格未转染的板已经死亡。更改的标准生长介质中含有杀稻瘟和吉欧（G418），每3-4天。
6. 2-3周后，杀稻瘟/吉欧（或blasticidin/G418）的，双抗菌落开始出现。选择板，含有5〜50的菌落挑选单个菌落。
7. 当菌落已经达到了一个直径大约5毫米（或更大），使用克隆缸挑选单个菌落。隔离至少24个人的克隆。每个克隆转移到一个单独的24孔组织培养板的孔。
8. 文化在含的维护浓度的杀稻瘟素（5微克/毫升），吉欧霉素（250微克/毫升）的克隆[或G418（0.5毫克/毫升）]。当融合时，从每个孔中的细胞分裂成一个单一的孔的6孔组织培养板中。
9. 对于每个要测试的克隆，分割1汇合，以及分为三个单独的6孔板的孔中的6孔板中。合流时，冻结细胞从一个势阱。使用剩下的两个井测试四环素，多西环素，米诺环素，罗红霉素，电子诱导表达。添加四环素在一个阱的浓度为1微克/毫升，而离开第二阱四环素免费。
10. 经过24至96小时的潜伏期与四环素类，收获细胞和免疫使用相应抗体。较短的四环素孵育时间时，建议的筛选cDNA表达的诱导，而较长的四环素的治疗将是必要的，以确定shRNA介导的耗尽的内源性蛋白质。
11. 至少选择两个克隆所需的枯竭/过度表达，并扩大各文化。尽快冻结股票的每一个有前途的克隆。当越来越多的Tet-克隆的实验，始终确保使用的培养基与四环素无血清和维护各自的选择抗生素浓度。

结果

的RPE-1细胞系稳定表达四环素的初始特性的一个例子如图4所示。注意所有的RPE-1克隆表达不同水平的四环素- （比较泳道2和5），而线（作为阴性对照）的亲本细胞不表达外源性四环素蛋白（ 图4，泳道1）。四环素 - 表达RPE-1之间的这种变化的Tet-细胞克隆是意料之中的，因为四环素表达质粒的表达是高度依赖于质粒的整合位点。

表征的稳定的RPE-1的Tet-?...

讨论

我们相信的Tet-系统上，大大方便了对基因功能的分析，特别是在电池系统是难以操纵和/或当操纵基因的细胞的存活是必需的。此外，能够控制基因的表达具有高度特异性春节的系统上提供了一个机会来研究基因功能，在不同的阶段（例如在细胞周期进展或明确定义的分化过程）。这里介绍的方法使研究人员能够生成所需的稳定的Tet-细胞株在合理的时间内（一般为3-6个月，很大程度上取决于四环?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论（可选）
胎牛血清（FBS）	Invitrogen公司	16000-044	测试的春节免费
杀稻瘟	Invivogen	蚂蚁提单-1
吉欧	Invivogen	蚂蚁使用-zn-5
G418	PAA实验室	P31-011	100毫克/毫升在媒体
反，TET02的	MoBiTec有限公司	TET02	在1/1000至1/2000 WB
pcDNA6/TR	Invitrogen公司	V1025-20
PT-REX DEST30	Invitrogen公司	12301-016
四环素	西格玛	87128	2毫克/毫升在乙醇中
多西环素	西格玛	D9891	2毫克/毫升在水中
克隆缸	Bellco玻璃公司	2090-00808	可重复使用的