A geração de linhas de células humanas estáveis ​​com tetraciclina induzível (Tet-on) ou shRNA Expression cDNA

Resumo

Uma maneira rápida e simples para gerar linhas de células humanas com sobre-expressão de cDNA induzido e reversível ou shRNA mediada knock-down do gene de interesse. Este método permite aos investigadores linhas celulares de modo fiável e altamente reprodutível manipular que são difíceis de alterar pelos métodos de transfecção transiente ou convencionais knockdown / knockout estratégias.

Resumo

Uma abordagem importante no campo da biologia celular de mamífero é a manipulação da expressão de genes de interesse em linhas de células seleccionadas, com o objectivo de revelar uma ou várias das funções do gene (s), utilizando sobreexpressão transiente / estável ou knockdown do gene de interesse. Infelizmente, para investigações biológicas de células diferentes esta abordagem não é apropriada quando as manipulações de resultado da expressão do gene em células de crescimento / proliferação defeitos ou diferenciação celular indesejada. Por isso, os investigadores têm adaptado a proteína do repressor de tetraciclina (TetR), a partir da E. coli de resistência à tetraciclina do operão ^1, para gerar muito eficientes e apertado sistemas reguladores para expressar cDNAs em células de mamíferos ^2,3. Em suma, TetR foi modificado para a iniciação ou bloco (1) de transcrição ligando-se ao operador de Tet-(TO) na região promotora com a adição de tetraciclina (Tet-off denominado sistema) ou (2) se ligam ao A em tele ausência de tetraciclina (Tet-on denominado sistema) (Figura 1). Dado o inconveniente de que o sistema Tet-off é necessária a presença contínua de tetraciclina (que tem uma semi-vida de cerca de 24 h em meio de cultura de tecido de células) o Tet-on sistema tem sido mais extensivamente optimizada, resultando no desenvolvimento de muito apertado e sistemas de vectores para a expressão de cDNA eficientes como usado aqui.

Pouco tempo após o estabelecimento de interferência de RNA (RNAi) para knockdown do gene em células de mamíferos, ^quatro vectores que expressam hairpin RNAs curto (shRNAs) foram descritas em que a função muito semelhante ao siRNAs ^5-11. No entanto, estas abordagens shRNA mediadas knockdown têm a mesma limitação quanto knockout estratégias convencionais, uma vez que a depleção estável não é exequível quando genes alvos são essenciais para a sobrevivência celular. Para superar essa limitação, van Wetering de et al. ¹² modificou a expressão shRNA vetor pSUPER ⁵ Aqui, nós descrevemos um método para gerar eficientemente estável humano Tet-on linhas celulares que conduzem fiável ou sobre-expressão induzível ou depleção do gene de interesse. Usando este método, têm gerado com êxito Tet-em linhas de células que facilitou significativamente a análise da cascata de MST / hMOB / NDR centrossoma em ^13,14 e ^15,16 sinalização da apoptose. Neste relatório, descreve-nossos vectores de escolha, para além de descrever as duas etapas consecutivas de manipulação que são necessários para gerar de forma eficiente humano-Tet em linhas de células (Figura 2). Além disso, além de traçar um protocolo para a geração de Tet-humana em linhas de células, vamos discutir os aspectos críticos sobre os procedimentos técnicos e caracterização de Tet-nas células.

Protocolo

1. Clonagem de pcDNA6_TetR_IRES_blast

1. Como ilustrado na Figura 3, realizar uma digestão parcial do plasmídeo pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen) com as enzimas de restrição Xba I e Nco I para remover o gene TetR e o promotor da resistência blasticidina (BlastR) gene. Isolar o fragmento de 4,6 kb do vetor.
2. Para remover a sequência de poliadenilação do gene TetR, introduzir por PCR um local Xhol imediatamente a seguir ao codão de paragem do ADNc de TetR enquanto conservam o local Xbal na extremidade 5 'do ADNc. Subclonar o fragmento resultante no pMigR1 ^17, usando as enzimas de restrição Xba I e Xho I para gerar o plasmídeo pMigR1_TetR.
3. Digerir o vector pMigR1_TetR com as enzimas de restrição Xba I e Nco I para libertar o fragmento TetR_IRES. Isolar o fragmento de 1,25 kb inserção.
4. Ligar o 4,6 kb pcDNA6/TR e os fragmentos de 1,25 kb TetR_IRES. Transform o produto de ligação em E. coli competentes e identificar a construção pcDNA6_TetR_IRES_blast desejado utilizando técnicas padrão de biologia molecular.

2. A geração de linhas celulares que expressem estavelmente TetR

1. No dia 1, Semente 1x10 ⁶ células por 10 cm de placa de cultura de tecido usando o seu meio de crescimento normal (por exemplo, DMEM suplementado com FCS a 10%). Semente de duas placas, uma para a transfecção com pcDNA6_TetR_IRES_blast, eo outro como controlo negativo para a selecção blasticidina. Certifique-se de utilizar o menor possível, e a passagem do meio de crescimento recomendado.
2. No dia 2, transfectar uma placa com 2 ug de pcDNA6_TetR_IRES_blast usando Fugene 6 (E2691, Promega), seguindo as instruções do fabricante. Não transfectar a segunda placa.
3. No dia 3, adicionar meio de crescimento normal contendo 5 blasticidina ug / ml de ambas as placas. Por favor, note que a concentração seleção ideal pode variar de uma linha determinada célula e força need a ser determinado de antemão.
4. No dia 4, dividir as células em 1/5, 1/25, 1/50 e 1/100 usando placas de 10 cm e o meio de crescimento normal contendo 5 mg / ml de blasticidina. Certifique-se de rotular adequadamente placas contendo células não transfectadas ou transfectadas. Preparar duas placas por diluição.
5. Verificar as células diária, assegurando que todas as células não transfectadas nas placas tenham morrido na primeira semana. Alterar meios de selecção a cada 2-3 dias.
6. Após 1-2 semanas, as colónias resistentes blasticidina devem começar a aparecer. Seleccionar placas contendo 5-50 colónias para garantir que as colónias individuais podem ser colhidos.
7. Quando as colónias atingiram um diâmetro de aproximadamente 5 mm (ou maior), o isolado de pelo menos 12 clones independentes utilizando cilindros de clonagem para escolher colónias únicas. Transferir cada clone a um poço separado de uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. Quando confluentes, dividir as células de cada poço para um único poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços.
8. Continue a cl culturaos de meios de selecção. Quando confluentes, células divididas de cada poço em dois poços individuais de uma placa de cultura de 6 poços tecido.
9. Para cada clone a ser testado, congelar um poço de células confluentes de células e colheita no outro poço de teste subsequente por immunoblotting.
10. Detectar TetR por Western blotting usando o anticorpo anti-rato monoclonal TET02 (MoBiTec GmbH). Recorde incluir um lisado da linha celular parental, como um controlo negativo.
11. Selecione três clones com a mais alta expressão TetR e expandir cada cultura clonal. Congele as existências de cada clone promissor o mais rapidamente possível. Finalmente, examinar os parâmetros biológicos moleculares e celulares de interesse, comparando as linhas celulares parentais com os clones que expressam TetR. Selecione o 'melhor' clone com a mais alta expressão TetR que não apresentar quaisquer alterações nos parâmetros moleculares e celulares biológicos de interesse.

3. Teste piloto do PTER e PT-Rex DEST30 Vetores Expresseing shRNA ou cDNAs, Respectivamente

1. Gerar pter plasmídeo com as inserções de Lentivirus como descrito ^12. Construir pT-Rex DEST30 vector (12301-016, Invitrogen) contendo o ADNc de interesse, utilizando tecnologia de Gateway (Invitrogen). No caso de expressão de cDNA, a adição de uma etiqueta com o cDNA será posteriormente facilitar a detecção da proteína expressa de forma exógena.
2. Transitoriamente transfectar a linha celular parental de destino com DEST30 plasmídeos PTER ou pT-Rex (expressando tanto shRNAs ou cDNAs de interesse) utilizando o reagente de transfecção de escolha. Para os testes de plasmídeos de expressão de shRNA, garantir eficiências de transfecção elevadas podem ser alcançadas.
3. Colheita de células transfectadas e processo para imunotransf erência utilizando os anticorpos adequados, esperando detectar uma diminuição ou a superexpressão do seu gene de interesse.

4. A geração de linhagens de células estáveis ​​com tetraciclina induzível (Tet-on) Expressão de shRNAs ou ADNc utilizando PTER ou pT-Rex DEST30 Vetores

1. No dia 1, sementes de 1x10 ⁶ células do 'melhor' TetR expressando clone por 10 cm de placa usando o seu meio de crescimento padrão enriquecida com soro certificada Tetraciclina-livre (por exemplo FBS da Invitrogen; 16000-014). Placa de uma semente para a transfecção com PTER (ou pT-Rex DEST30), e uma placa como controlo negativo para a selecção duplo. Certifique-se de usar o menor possível passagem.
2. No dia 2, transfectar uma placa com 2 ug de PTER (ou pT-Rex DEST30), utilizando Fugene 6. Não transfectar a segunda placa.
3. No dia 3, adicionar meio de crescimento normal contendo 5 ug / ml de blasticidina e 500 ug / ml de zeocina (ou 1 mg / ml de G418).
4. No dia 4, dividir as células em 1/5, 1/25, 1/50 e 1/100 usando placas de 10 cm e o meio de crescimento normal contendo 5 ug / ml de blasticidina e 500 ug / ml de zeocina (ou 1 mg / ml G418). Preparar duas placas por diluição.
5. Verificar as células diária, certificando-se que, dentro da primeira semana todas as células não transfectadas nas placas morreram.Alterar o padrão de meio de crescimento contendo blasticidina e zeocina (ou G418) a cada 3-4 dias.
6. Depois de 2-3 semanas, blasticidina / zeocina (ou blasticidin/G418) double colônias resistentes devem começar a aparecer. Selecione placas contendo entre 5 a 50 colônias de escolher colónias isoladas.
7. Quando as colónias atingiram um diâmetro de aproximadamente 5 mm (ou maior), usar cilindros de clonagem para escolher colónias únicas. Isolar, pelo menos, 24 clones individuais. Transferir cada clone a um poço separado de uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades.
8. Clones de cultivo em meio de manutenção contendo concentrações de blasticidina (5 ug / ml) e zeocina (250 ug / mL) [ou G418 (0,5 mg / ml)]. Quando confluentes, dividir as células de cada poço para um único poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços.
9. Para cada clone a ser testado, dividida uma confluente poço de uma placa de 6 poços em três poços individuais de uma placa de 6 poços. Quando confluentes, congelar as células a partir de um poço. Usar os restantes dois poços para testar a tetraciclinae induzível expressão. Adicionar tetraciclina a uma concentração de 1 ug / ml a uma cavidade, deixando a tetraciclina segundo poço livre.
10. Após 24-96 horas de incubação com células de tetraciclina, a colheita e processamento de imunotransf erência utilizando anticorpos adequados. Tempos mais curtos de incubação de tetraciclina são recomendadas na triagem para a indução de expressão de ADNc, enquanto que os tratamentos mais longos de tetraciclina será necessário determinar shRNA mediada por depleção de proteínas endógenas.
11. Seleccionar, pelo menos, dois clones com o esgotamento desejado / superexpressão e expandir cada cultura. Congele as existências de cada clone promissor o mais rapidamente possível. Quando crescer Tet-em clones para experimentos certifique-se sempre de usar meios suplementados com tetraciclina livre de soro e os antibióticos de seleção respectivas concentrações em manutenção.

Resultados

Um exemplo para a caracterização inicial de EPR-1 linhas celulares que expressem estavelmente TetR é mostrado na Figura 4. Note-se que todos os clones de EPR-1 expressar níveis variáveis ​​de TetR (comparar pistas 2 e 5), enquanto que a linha celular parental (que serve como controlo negativo) não exprime a proteína exógena TetR (Figura 4, pista 1). Esta variação na expressão entre TetR EPR-1-Tet em clones de células é esperado, uma vez que a expressão de plasmídeos e...

Discussão

Cremos que os sistemas de Tet-on facilitar grandemente a análise da função dos genes, em particular em sistemas de células que são difíceis de manipular e / ou quando o gene manipulado é essencial para a sobrevivência da célula. Além disso, a capacidade de controlar a expressão de genes específicos por altamente Tet-em sistemas oferece a oportunidade de estudar funções de genes em estágios diferentes (por exemplo, durante a progressão do ciclo celular ou processos bem definidos de diferenciação). O mé...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Soro fetal bovino (FBS)	Invitrogen	16000-044	Testado Tet-livre
Blasticidina	Invivogen	formiga-bl-1
Zeocina	Invivogen	ant-zn-5
G418	PAA laboratórios	P31-011	100 mg / ml em meios
anti-TET02	MoBiTec GmbH	TET02	Use a 1/1000 a 1/2000 para WB
pcDNA6/TR	Invitrogen	V1025-20
pT-Rex DEST30	Invitrogen	12301-016
Tetraciclina	Sigma	87128	2 mg / ml em etanol
Doxiciclina	Sigma	D9891	2 mg / ml em água
Cilindros de clonagem	Bellco Glass Inc.	2090-00808	reutilizável