Génération de lignées stables de cellules humaines avec inductible par la tétracycline (Tet-on) shRNA ou expression d'ADNc

Résumé

Un moyen simple et rapide pour générer des lignées de cellules humaines avec inductible et réversible surexpression d'ADNc ou shRNA médiée par le knock-down du gène d'intérêt. Cette méthode permet aux chercheurs de lignées cellulaires de manière fiable et reproductible de manipuler très difficiles à modifier, par des méthodes classiques de transfection transitoire ou knock-down / KO stratégies.

Résumé

Une approche majeure dans le domaine de la biologie cellulaire des mammifères est la manipulation de l'expression de gènes d'intérêt dans des lignées cellulaires sélectionnées, dans le but de révéler un ou plusieurs de la fonction du gène (s) en utilisant la surexpression transitoire / stable ou knockdown du gène d'intérêt. Malheureusement, pour diverses enquêtes de cellules biologiques de cette approche ne convient pas lorsque les manipulations de résultat de l'expression de gènes dans des cellules de croissance / prolifération de défauts ou de différenciation cellulaire indésirable. Par conséquent, les chercheurs ont adapté la protéine répresseur tétracycline (TetR), tiré de l'E. résistance à la tétracycline coli opéron ^1, de générer très efficaces et serré systèmes réglementaires pour exprimer des ADNc dans des cellules de mammifères ^2,3. En bref, TetR a été modifié pour l'initiation ou l'autre bloc (1) de la transcription en se liant à l'opérateur Tet-(A) dans la région du promoteur lors de l'addition de tétracycline (Tet-off appelé système) ou (2) se lient à la TO en til absence de tétracycline (Tet appelée sur-système) (figure 1). Compte tenu de l'inconvénient que le système Tet-off nécessite la présence continue de la tétracycline (qui a une demi-vie d'environ 24 heures dans un milieu de culture des tissus cellulaires) Tet-le système a été plus largement optimisée, ce qui entraîne le développement des très serré et des systèmes de vecteurs efficaces pour l'expression d'ADNc utilisée ici.

Peu de temps après l'établissement de l'interférence ARN (ARNi) pour abattre des gènes dans les cellules de mammifères ^4, des vecteurs exprimant des ARN en épingle à cheveux court (shRNA) ont été décrits qui fonctionnent très similaire à siRNA ^5-11. Cependant, ces approches knockdown shRNA médiées par la même restriction que les stratégies conventionnelles huitièmes de finale, puisque l'épuisement stable n'est pas possible lorsque les gènes cibles sont essentiels à la survie cellulaire. Pour contourner cette limitation, van de Wetering et al. ¹² a modifié le shRNA vecteur d'expression pSUPER ⁵ Ici, nous décrivons une méthode pour générer efficacement humaine stable Tet-sur lignées cellulaires qui conduisent surexpression inductible de manière fiable l'un ou l'épuisement du gène d'intérêt. En utilisant cette méthode, nous avons réussi à générer Tet-sur des lignées cellulaires a considérablement facilité l'analyse de la cascade de MST / hMOB / NDR de ^13,14 centrosome et l'apoptose de signalisation ^15,16. Dans ce rapport, nous décrivons nos vecteurs de choix, en plus de décrire les deux étapes consécutives de manipulation qui sont nécessaires pour générer efficacement des humains Tet-sur des lignées cellulaires (figure 2). Par ailleurs, outre décrivant un protocole pour la génération de l'homme Tet-sur des lignées cellulaires, nous allons discuter des aspects critiques concernant les procédures techniques et la caractérisation des cellules Tet-on.

Protocole

1. Clonage de pcDNA6_TetR_IRES_blast

1. Comme le montre la figure 3, effectuez un condensé partielle du plasmide pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen) avec les enzymes de restriction Xba I et Nco I pour éliminer le gène TetR et le promoteur de la résistance blasticidine (BlastR) gène. Isoler le fragment de 4,6 kb vecteur.
2. Pour supprimer la séquence de polyadénylation du gène TetR, introduit par PCR un site Xho I immédiatement après le codon stop de l'ADNc TetR tout en conservant le site Xba I à l'extrémité 5 'de l'ADNc. Sous-cloner le fragment résultant dans pMigR1 ¹⁷ en utilisant les enzymes de restriction Xbal et Xhol pour générer le plasmide pMigR1_TetR.
3. Digérer le vecteur pMigR1_TetR avec les enzymes de restriction Xba I et le Nco I pour libérer le fragment TetR_IRES. Isoler le fragment de 1,25 kb insert.
4. Ligaturer le 4,6 kb pcDNA6/TR et de 1,25 ko fragments TetR_IRES. Transform le produit de ligation dans E.coli compétentes et d'identifier la construction pcDNA6_TetR_IRES_blast souhaité à l'aide des techniques classiques de biologie moléculaire.

2. Génération de lignées cellulaires exprimant de façon stable TetR

1. Au jour 1, semences 1x10 ⁶ cellules par 10 cm de plaque de culture tissulaire en utilisant votre milieu de croissance standard (par exemple DMEM supplémenté avec 10% de SVF). Semences deux plaques, une pour la transfection avec pcDNA6_TetR_IRES_blast, et l'autre en tant que témoin négatif pour la sélection blasticidine. Vérifiez que vous utilisez le plus possible le passage et le milieu de croissance recommandé.
2. Le jour 2, transfecter une plaque avec 2 ug de pcDNA6_TetR_IRES_blast utilisant Fugene 6 (E2691, Promega) selon les instructions du fabricant. Ne transfecter la seconde plaque.
3. Au jour 3, ajouter du milieu de croissance standard contenant 5 pg / ml blasticidine aux deux plaques. S'il vous plaît noter que la concentration sélection optimale peut varier d'une lignée cellulaire donnée et la puissance nEED à être déterminé à l'avance.
4. Au jour 4, diviser les cellules à 1/5, 1/25, 1/50 et 1/100 en utilisant des plaques de 10 cm et milieu de croissance standard contenant 5 mg / ml blasticidine. Assurez-vous d'étiqueter correctement les plaques contenant des cellules non transfectées ou transfectées. Préparer deux plaques à l'étape de dilution.
5. Vérifiez cellules quotidien, veiller à ce que toutes les cellules sur les plaques non transfectées sont morts pendant la première semaine. Changer milieu de sélection tous les 2-3 jours.
6. Après 1-2 semaines, blasticidine colonies résistantes devraient commencer à apparaître. Sélectionner des plaques contenant de 5 à 50 colonies afin de s'assurer que seules les colonies peuvent être récupérés.
7. Lorsque les colonies ont atteint un diamètre d'environ 5 mm (ou plus), d'isoler au moins 12 clones indépendants utilisant des cylindres de clonage pour ramasser des colonies isolées. Transférer chaque clone dans un puits séparé d'une plaque de 24 puits de culture de tissu. Lorsque confluentes, diviser les cellules de chaque puits en un seul puits d'une plaque à 6 puits de culture de tissu.
8. Continuer à cl cultureceux de milieux de sélection. Lorsque confluentes, les cellules divisées de chaque puits dans deux puits individuels d'une plaque à 6 puits de culture de tissu.
9. Pour chaque clone à tester, ainsi geler une des cellules confluentes et les cellules de capture dans le puits pour les autres essais ultérieurs par immuno-empreinte.
10. Détecter TetR par Western blot en utilisant l'anticorps monoclonal anti-TET02 anticorps (Mobitec GmbH). Oublier d'inclure un lysat de la lignée cellulaire parentale comme contrôle négatif.
11. Sélectionnez 3 clones avec la plus haute expression TetR et développer chaque culture clonale. Geler les stocks de chaque clone prometteur dès que possible. Enfin, examinez les paramètres moléculaires et cellulaires biologiques d'intérêt en comparant les lignées cellulaires parentales avec les clones exprimant TetR. Sélectionnez le "meilleur" clone avec la plus haute expression TetR qui n'affiche pas de changements dans les paramètres moléculaires et cellulaires biologiques d'intérêt.

3. Mise à l'essai de PTER et pT-Rex DEST30 Vecteurs Exprimez-ment shRNA ou des ADNc, respectivement

1. Générer pter plasmide avec inserts shRNA comme décrit ^12. Construire pT-Rex DEST30 vecteur (12301-016, Invitrogen) contenant l'ADNc d'intérêt en utilisant la technologie de passerelle (Invitrogen). Dans le cas d'expression d'ADNc, plus de un pour l'ADNc sera ultérieurement faciliter la détection de la protéine exprimée de manière exogène.
2. Transfecter de manière transitoire la ligne de mire des parents cellule avec PTER ou pT-Rex DEST30 plasmides shRNA (exprimant soit ou ADNc d'intérêt) en utilisant le réactif de transfection de choix. Pour le test de plasmides d'expression shRNA, assurer l'efficacité de transfection élevées peuvent être obtenues.
3. Récolte des cellules transfectées et le processus d'immunoblot en utilisant les anticorps appropriés, s'attendant à détecter un épuisement ou la surexpression de votre gène d'intérêt.

4. Génération de lignées cellulaires stables avec inductible par la tétracycline (Tet-on) Expression de shRNA ou d'ADNc à l'aide PTER ou pT-Rex DEST30 Vecteurs

1. Au jour 1, semences 1x10 ⁶ cellules de la «meilleure» TetR exprimant clone par plaque de 10 cm en utilisant votre milieu de croissance standard complétée par la tétracycline certifié exempt de sérum (par exemple pour FBS chez Invitrogen, 16000-014). Une plaque de semence pour la transfection avec pter (ou pT-Rex DEST30), et une plaque en tant que témoin négatif pour la double sélection. Assurez-vous d'utiliser le moins possible le passage.
2. Le jour 2, transfecter une plaque avec 2 ug de PTER (ou pT-Rex DEST30) en utilisant Fugene 6. Ne transfecter la seconde plaque.
3. Au jour 3, ajouter du milieu de croissance standard contenant 5 pg / ml blasticidine et 500 pg / ml de zéocine (ou 1 mg / ml de G418).
4. Au jour 4, diviser les cellules à 1/5, 1/25, 1/50 et 1/100 en utilisant des plaques de 10 cm et milieu de croissance standard contenant 5 ug / ml blasticidine et 500 pg / ml de zéocine (ou 1 mg / ml G418). Préparer deux plaques à l'étape de dilution.
5. Vérifiez les cellules quotidien, faire en sorte que dans la première semaine toutes les cellules sur les plaques non transfectées sont morts.Changer le milieu de croissance standard contenant blasticidine et la zéocine (ou G418) tous les 3-4 jours.
6. Après 2-3 semaines, blasticidine / zéocine (ou blasticidin/G418) double colonies résistantes devraient commencer à apparaître. Sélectionner des plaques contenant de 5 à 50 colonies de choisir des colonies isolées.
7. Lorsque les colonies ont atteint un diamètre d'environ 5 mm (ou plus), utiliser des cylindres de clonage pour ramasser des colonies isolées. Isoler au moins 24 clones individuels. Transférer chaque clone dans un puits séparé d'une plaque de 24 puits de culture de tissu.
8. Clones culture dans du milieu contenant des concentrations de maintenance de blasticidine (5 ug / ml) et la zéocine (250 pg / ml) [ou G418 (0,5 mg / ml)]. Lorsque confluentes, diviser les cellules de chaque puits en un seul puits d'une plaque à 6 puits de culture de tissu.
9. Pour chaque clone à tester, diviser un confluent puits d'une plaque à 6 puits dans trois puits individuels d'une plaque à 6 puits. Lorsque confluentes, de geler les cellules d'un puits. Utilisez les deux puits restants pour tester la tétracyclinee-expression inductible. Ajouter tétracycline à une concentration de 1 pg / ml à un puits, tout en laissant la tétracycline deuxième puits libre.
10. Après 24 à 96 h d'incubation avec des cellules de tétracycline, la récolte et le processus d'immunoblot en utilisant des anticorps appropriés. Réduction des temps d'incubation tétracyclines sont recommandés lors du dépistage de l'induction de l'expression d'ADNc, alors que des traitements plus longs tétracycline sera nécessaire pour déterminer shRNA médiée par l'épuisement des protéines endogènes.
11. Sélectionnez au moins deux clones avec l'épuisement désiré / surexpression et développer chaque culture. Geler les stocks de chaque clone prometteur dès que possible. En grandissant Tet-on clones pour des expériences assurez-vous toujours d'utiliser des milieux supplémentés avec de la tétracycline sans sérum et les antibiotiques de sélection à des concentrations respectives de maintenance.

Résultats

Un exemple pour la caractérisation initiale de l'EPR-1 lignées cellulaires exprimant de façon stable TetR est illustré à la figure 4. Notez que tous les clones EPR-1 expriment différents niveaux de TetR (comparer les pistes 2 et 5), tandis que la lignée cellulaire parentale (qui sert de témoin négatif) n'exprime pas la protéine exogène TetR (figure 4, ligne 1). Cette variation de l'expression TetR entre RPE-1-Tet sur des clones de cellules est prévu, puisque l...

Discussion

Nous croyons que Tet-sur les systèmes facilitera grandement l'analyse de la fonction des gènes, en particulier dans des systèmes cellulaires qui sont difficiles à manipuler et / ou lorsque le gène manipulé est essentielle à la survie cellulaire. En outre, la capacité de contrôler l'expression des gènes très spécifiques par Tet-sur les systèmes offre la possibilité d'étudier la fonction des gènes à des stades différents (par exemple lors de la progression du cycle cellulaire ou des processus...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Sérum foetal bovin (FBS)	Invitrogen	16000-044	Testé sans Tet
Blasticidine	Invivogen	ant-bl-1
Zéocine	Invivogen	ant-zn-5
G418	Laboratoires AAP	P31-011	100 mg / ml dans les milieux
anti-TET02	Mobitec GmbH	TET02	Utilisez à 1/1000-1/2000 de la BM
pcDNA6/TR	Invitrogen	V1025-20
pT-Rex DEST30	Invitrogen	12301-016
Tétracycline	Sigma	87128	2 mg / ml dans de l'éthanol
Doxycycline	Sigma	D9891	2 mg / ml dans de l'eau
Cylindres de clonage	Bellco Glass Inc	2090-00808	réutilisables