JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

المركزية إلى ميدان المرضية البكتيرية هي القدرة على تحديد إذا وكيف الميكروبات البقاء على قيد الحياة بعد التعرض للخلايا حقيقية النواة. توضح هذه المقالة بروتوكولات لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تكشف عن قابلية البكتيريا الفردية داخل ويترافق مع الخلايا المضيفة.

Abstract

المركزية إلى ميدان المرضية البكتيرية هي القدرة على تحديد إذا وكيف الميكروبات البقاء على قيد الحياة بعد التعرض للخلايا حقيقية النواة. وتشمل البروتوكولات الحالية لمعالجة هذه الأسئلة فحوصات العد مستعمرة، المقايسات حماية الجنتاميسين، والمجهر الإلكتروني. العد مستعمرة وحماية الجنتاميسين فحوصات تقييم الجدوى فقط من السكان البكتيرية كامل وغير قادر على تحديد الجدوى البكتيرية الفردية. ويمكن استخدام المجهر الإلكتروني لتحديد الجدوى من البكتيريا الفردية وتقديم معلومات بشأن التوطين في الخلايا المضيفة. ومع ذلك، في كثير من الأحيان بكتيريا عرض مجموعة من كثافة الإلكترونات، مما يجعل من الصعب تقييم الجدوى. توضح هذه المقالة بروتوكولات لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تكشف عن قابلية البكتيريا الفردية داخل ويترافق مع الخلايا المضيفة. وقد وضعت هذه المقايسات أصلا لتقييم بقاء النيسرية البنية في العدلات الإنسان الأساسية، ولكن ينبغي أن يكونpplicable إلى أي تفاعل الخلية البكتيريا في استضافة. الجمع بين هذه البروتوكولات الأصباغ الفلورية غشاء نفاذية (SYTO9 و4 '،6-diamidino-2-phenylindole [دابي])، والتي وصمة عار جميع البكتيريا، مع الأصباغ غشاء كتيمة الفلورسنت (يوديد propidium وSYTOX الأخضر)، والتي يمكن الوصول إليها فقط ل البكتيريا غير قابل للحياة. قبل permeabilization الخلية حقيقية النواة، يتم إضافة الجسم المضاد أو كاشف الفلورسنت لتحديد البكتيريا خارج الخلية. وبالتالي هذه المقايسات تميز جدوى من البكتيريا تمسكا وداخل الخلايا حقيقية النواة. ويرد البروتوكول أيضا لاستخدام الأصباغ جدوى في تركيبة مع الأجسام المضادة لعلامات الفلورسنت خلية حقيقية النواة، من أجل تحديد توطين التحت خلوية من البكتيريا الفردية. الأصباغ البكتيرية الجدوى مناقشتها في هذه المقالة هي تكملة الحساسة و / أو بديل لتقنيات علم الأحياء المجهرية التقليدية لتقييم جدوى البكتيريا الفردية وتقديم معلومات بشأن مكان البقاء على قيد الحياة البكتيريا في الخلية المضيفةق.

Introduction

هناك ديناميكية التفاعل والتطور المشترك بين البكتيريا والمضيفين التي يقيمون فيها. وقد تطورت البكتيريا العضيات الالتزام، ونظم إفراز و / أو القدرة على إنتاج السموم التي تمكن العدوى الإنتاجية الخاصة بهم من أكلة المضيف والخلايا غير البلعمية. يجب على البكتيريا أيضا يتعامل مع الاعتراف والأنشطة المضادة للميكروبات الجهاز المناعي المضيف. ويتألف الجهاز المناعي مجموعة من المكونات الفطرية والتكيفية بما في ذلك الحواجز الفيزيائية والكيميائية، الخلايا المناعية، ونظام مكمل، وغيرها من عناصر الحصانة الخلطية. بينما العديد من أنواع البكتيريا هي عرضة للقتل والتطهير من قبل المضيف المناعي استجابة متعددة الطبقات، تطورت بعض أنواع البكتيريا المسببة للأمراض الانتهازية وآليات لتصيب مجموعة متنوعة من الخلايا المضيفة وتخريب التخليص من قبل المضيف المناعي استجابة 1. النيسرية البنية هو مثال واحد من العوامل المسببة للأمراض البكتيرية التي يتم تكييفها للغاية أن تستمر في المضيف الإنسان. N. البنية يستعمر بسهولة السطوح اللمعية من الخلايا الظهارية المخاطية من الجهاز البولي التناسلي والبلعوم والملتحمة، والمستقيم. الاستعمار يتسبب في التوظيف وفيرة من العدلات في مواقع المخاطية. العدلات هي البالعات المهنية التي تمتلك مجموعة متنوعة من العمليات المضادة للجراثيم لقتل الكائنات الحية الدقيقة، ومع ذلك، N. البنية غير قادرة على البقاء في وجود العدلات 2-5. فهم كيفية مسببات الأمراض البكتيرية مثل N. البنية تخريب، وقمع، وخطف الاستجابة المناعية البقاء على قيد الحياة في نهاية المطاف في بيئات معادية المضيف عادة هو أمر حاسم في تطوير علاجات جديدة لمكافحة الأمراض المعدية.

البروتوكولات التجريبية غالبا ما تستخدم للتحقيق بقاء البكتيريا في الخلايا المضيفة تشمل فحوصات العد مستعمرة، المقايسات حماية الجنتاميسين، والمجهر الإلكتروني. في فحوصات العد مستعمرة، ويبلغ عدد سكانها هي lysed الخلايا المصابة (على سبيل المثال، مع المنظفات لذوي الخوذات البيضاءمعنوى البكتيريا مقاومة) لتحرير البكتيريا. وتضعف لست] ومطلي على وسائل الاعلام القائمة على أجار، ويتم تعداد الوحدات المكونة للمستعمرة في لست] لكل نقطة زمنية و / أو حالة تجريبية. هذا النهج تقارير الجدوى من السكان البكتيرية بأكمله ولكن غير قادر على التفريق بين الخلايا والبقاء على قيد الحياة خارج الخلية. وهناك تباين في مقايسة العد مستعمرة، مقايسة حماية الجنتاميسين، يقيس على وجه التحديد بقاء البكتيريا داخل الخلايا، استنادا إلى عدم قدرة جنتاميسين مضاد حيوي لعبور حقيقية النواة غشاء البلازما 6. ومع ذلك، هذا الاختبار يعتمد على البكتيريا كونها عرضة للقتل من قبل جنتاميسين (أو مضاد حيوي آخر هو بالمثل حقيقية النواة غشاء impermeant) وعدم قدرة المضاد الحيوي على الوصول إلى البكتيريا الداخلية. وبالتالي، مقايسة حماية الجنتاميسين قد لا تكون فعالة لفحص كل أنواع البكتيريا أو عند النظر في البقاء على قيد الحياة البكتيرية للغايةخلايا pinocytic مثل العدلات. لم يكن أي من هذه الطرق يكشف توطين التحت خلوية أو أي سلوك آخر من البكتيريا الفردية (على سبيل المثال إذا كانت البكتيريا تشكيل المجاميع أو microcolonies أن تتصرف بشكل مختلف من الخلايا البكتيرية الفردية). آخر النهج كثيرا ما تستخدم لدراسة الجدوى من البكتيريا الخارجية والداخلية الفردية رقيقة المقطع انتقال الإلكترون المجهري (TEM). هذا النهج هو مفيد من حيث أنه يمكن أن توفر معلومات بشأن مكان وجود البكتيريا في الخلايا المضيفة (مثل يبلوع، السيتوبلازم، جسيم بلعمي ذاتي)، والتي يمكن أن تحقق مزيدا من immunoelectron المجهري مع الأجسام المضادة إلى جانب الذهب ضد علامات التحت خلوية. ومع ذلك، المجهر الإلكتروني ليست حساسة ولا سيما في تقييم الجدوى البكتيرية. عندما يتم ملطخة أقسام جزءا لا يتجزأ مع خلات اليورانيل، سترات الرصاص، أو غيرها من الكواشف الإلكترون الكثيفة والتقط بواسطة المجهر الإلكتروني، وتعتبر البكتيريا الإلكترون كثيفة قابلة للحياة وكهربائيTRON-وسنت غير قابل للحياة 7،8. ولكن هذا الافتراض يغالي بقاء البكتيرية، ومنذ تلك البكتيريا الميتة فقط مع الأغشية تعطلت بشدة وتخلو من السيتوبلازم تظهر الإلكترون لوسنت. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون بعض الأنواع البكتيرية عرض مجموعة من كثافة الإلكترونات اعتمادا على مرحلة نموها، مما يجعل من الصعب تحديد الجدوى.

كبديل أو بالإضافة إلى هذه الأساليب تستخدم على نطاق واسع، وهنا نقدم بروتوكولات والأساس المنطقي لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تشير إلى بقاء البكتيرية لتقييم بقاء البكتيريا التي تعلق على والمنضوية بواسطة الخلايا المضيفة. لتحديد البكتيريا خارج الخلية يتم، أولا، تتعرض الخلايا المصابة إلى كاشف الفلورسنت، مثل كتين أو الأجسام المضادة البكتيريا محددة. ثم يتم permeabilized الخلايا المصابة والمعرضة للالأصباغ الحمض النووي المحددة التي يمكن الوصول إليها بشكل مختلف للبكتيريا مع الأغشية سليمة مقابل المتدهورة، كبديل للبقاء البكتيرية. في ع الأولrotocol، يحدد غشاء منفذ صبغ SYTO9 مجموع السكان البكتيرية، في حين يوديد propidium هو فقط للوصول الى تلك البكتيريا التي أثرت سلبا الأغشية، وبالتالي فهي تعتبر غير قابل للحياة. وقد استخدمت يوديد propidium وSYTO9 لتقييم الجدوى البكتيرية في الأغشية الحيوية، تميز الممرضة من بكتيريا غير إمراضية، وتعداد البكتيريا التي تنتقل عن طريق المياه قابلة للحياة 9-12. في البروتوكول الثاني، 4 '، 6'-diamidino-2-phenylindole (دابي) يحدد مجموع البكتيريا، في حين SYTOX الأخضر هو فقط للوصول الى السكان غير قابل للحياة. هذه الأزواج بقاء الصبغة يمكن الجمع بين المناعي لتحديد موقع كل البكتيريا في ما يتعلق بروتين من الفائدة، على سبيل المثال لتعريف توطين التحت خلوية البكتيرية. استخدام هذه المقايسات يقدم رؤية المفتاح في التفاعلات التي تؤدي إلى قتل البكتيريا أو البقاء على قيد الحياة خلال العدوى من الخلايا المضيفة. تم استخدام البروتوكولات المذكورة في هذه المقالة لتقييم جدوىN. البنية التي يتم تركيبها داخل والعدلات الإنسان الأساسية، بما في ذلك مجموعات مختلفة من phagosomes العدلة 5،13،14. ومع ذلك، هذه البروتوكولات يمكن تطبيقها لتقييم الجدوى من البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام في البالعات المهنية، البالعات غير المهنية، والبروتوزوا 15-24.

Protocol

1. تقييم البكتيرية الجدوى مع يوديد propidium وSYTO9

  1. تصيب الخلايا التي هي ملتصقة إلى 12 مم coverslips الزجاج الدائرية في 24 لوحات جيدة مع البكتيريا من الفائدة. لا تصلح الخلايا مع الألدهيدات أو المذيبات العضوية.
  2. شطف بلطف خلايا مرة واحدة في 0.1 م 3 - (N-morpholino) حمض propanesulfonic (اجتماعات الأطراف)، ودرجة الحموضة 7.2، يحتوي على 1 ملم MgCl 2 (اجتماعات الأطراف / MgCl 2).
  3. احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة مع اليكسا فلور الأضداد مقرونة-647 أو كتين التي تربط إلى الأنواع البكتيرية من الفائدة، في اجتماعات الأطراف / MgCl 2، للكشف عن البكتيريا الخارجية.

ملاحظة: يتحكم السلوك مع البكتيريا الحية والميتة، في غياب الخلايا المضيفة، لإظهار أن كتين أو الضد من مصلحة ملزم لجميع البكتيريا بغض النظر عن الجدوى (الشكل 1).

  1. شطف الخلايا مرتين مع اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  2. نضح مالقانونين من الخلايا وإضافة 0.5 مل لايف / الميت تلطيخ الحل. الحية / الميت تلطيخ الحل هو 5 ميكرومتر SYTO9، 30 ميكرومتر يوديد propidium، و 0.1٪ سابونين (تركيزات النهائي) في اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  3. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  4. شطف الخلايا مرتين في اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  5. coverslips قلب وجهه لأسفل على الشرائح الزجاجية وختم بطلاء الأظافر واضحة. لا تستخدم وسائل الإعلام في تصاعد مستمر.
  6. الحصول على صور في غضون 30 دقيقة، وذلك باستخدام المجهر مضان مع مجموعات مرشح متوافق مع الأخضر والأحمر، والأحمر حتى الحصول على الصور.

ملاحظة: كلا التقليدية المجهري مضان، ويمكن استخدامها متحد البؤر المسح المجهري بالليزر. بعد 30 دقيقة تبدأ الأصباغ الفلورية لتسرب من البكتيريا والتي لم تعد البيانات المكتسبة دقيقة. تم الحصول على الصور المبينة في هذه المادة على نيكون الكسوف E800 مضان المجهر تستقيم مع كاميرا رقمية هاماماتسو أوركا-ER باستخدام برنامج Openlab. تم الكشف عن مضان من اليكسا فلور 647 باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 590-650 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 663-735 نانومتر، وباطل اللون الأزرق. تم الكشف عن مضان من يوديد propidium باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 540-580 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 600-660 نانومتر. تم الكشف عن مضان من SYTO9 باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 465-495 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 515-555 نانومتر.

  1. وسوف يؤدي هذا البروتوكول في صور حيث تظهر البكتيريا غير قابل للحياة الخارجية أزرق + أحمر، تظهر البكتيريا غير قابل للحياة الداخلية الحمراء فقط، والبكتيريا قادرة على البقاء الخارجية تظهر أزرق + أخضر، والبكتيريا الداخلية قابلة للحياة تظهر خضراء فقط. عد بالعين أعداد البكتيريا التي هي غير قابل للحياة الخارجية، الداخلية غير قابل للحياة، قابلة للحياة الخارجية، والداخلية قابلة للحياة.
  2. حساب في المئة من البكتيريا قادرة على البقاء الخارجية بقسمة عدد من البكتيريا قادرة على البقاء الخارجية من العدد الكلي للبكتيريا الخارجية (قابلة للحياة بالإضافة إلى nonviقادرة). حساب في المئة من البكتيريا الداخلية قابلة للحياة بقسمة عدد من البكتيريا الداخلية قابلة للحياة من العدد الكلي للبكتيريا الداخلية (قابلة للحياة بالإضافة إلى غير قابل للحياة) (الشكل 4).
  3. هناك نوعان من الضوابط الأساسية لأداء مع هذا البروتوكول. أولا، تحقق من أن كل البكتيريا غير قابل للحياة هي propidium يوديد-الإيجابية وجميع البكتيريا الحية هي SYTO9 إيجابية. وينبغي أن يكون ثقافة منتصف لوغاريتمي من البكتيريا (في حالة عدم وجود أية خلايا المضيف)> 95٪ SYTO9 إيجابية. هو مبين في الشكل 2 هي ثقافة منتصف لوغاريتمي من N. البنية (في 10 وحدة في مستعمرة 8 مل تشكيل) حضنت مع لايف / الميت تلطيخ الحل. الثانية، التحقق من أن كل من يوديد propidium وSYTO9 يمكن أن تدخل permeabilized، الخلايا المضيفة المصابة.
    1. لتوليد السكان من البكتيريا الميتة، وجمع 2 × 10 8 مستعمرة بكتيرية تشكيل وحدة في 1.5 مل microfuge أنبوب، إضافة 70٪ الأيزوبروبانول والجلوس لمدة 10 دقيقة. بيليه البكتيريا في microfuge لالثانية يغسل البكتيريا مرتين في برنامج تلفزيوني لإزالة الأيزوبروبانول المتبقية. ثم اتبع الخطوات بروتوكول 1،5-1،7. إضافة 5 ميكرولتر من تعليق البكتيرية لشريحة زجاجية وتراكب مع ساترة. عينات الصورة كما في البروتوكول الخطوة 1.9. في ظل هذه الظروف، يجب أن يكون 100٪ من السكان يوديد propidium إيجابية (الشكل 2). في بعض الأنواع البكتيرية، يوديد propidium قد لا تطغى تماما SYTO9 تلطيخ، وغير قابل للحياة قد تظهر البكتيريا الأصفر أو البرتقالي.
    2. لخلايا البلعمة مثل العدلات، تعرض الخلايا لقتل البكتيريا الأيزوبروبانول والتأكد من أن 100٪ من البكتيريا داخل الخلايا هي propidium يوديد إيجابية-(الشكل 3). لخلايا nonphagocytic التي قد لا تستوعب البكتيريا الميتة، قد تكون كافية لعلاج الخلايا المصابة مع أزيد الصوديوم أو غيرها من العوامل المضادة للجراثيم خلايا نفيذ قبل مضيفا ايف / الميت تلطيخ الحل.

2. تقييم الجدوى البكتيرية مع SYTOX GREEن ودابي

  1. البكتيريا التسمية في المصالح مع 10 ميكروغرام / مل دابي في مورس معرفة متوسطة 25 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  2. تصيب الخلايا التي هي ملتصقة إلى 12 مم coverslips الزجاج الدائرية في 24 لوحات جيدة مع البكتيريا دابي المسمى. لا تصلح الخلايا مع الألدهيدات أو المذيبات العضوية.
  3. شطف خلايا مرة واحدة مع اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  4. احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام مع اليكسا فلور الأضداد مقرونة-647 أو كتين التي تربط إلى الأنواع البكتيرية من الفائدة، في اجتماعات الأطراف / MgCl 2، للكشف عن البكتيريا الخارجية. انظر الملاحظة في البروتوكول الخطوة 1.3 لعناصر المقترحة.
  5. وسائل الإعلام نضح من الخلايا وإضافة 0.5 مل 0.4 ميكرومتر SYTOX الخضراء في اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  6. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  7. شطف الخلايا مرتين في اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  8. غسل خلايا مرة واحدة في اجتماعات الأطراف / MgCl 2 لمدة 5 دقائق.
  9. الحصول على صور في غضون 30 دقيقة مع المجهر مضان. انظر البروتوكول الخطوة 1.9 لوصف المجهر، والكاميرا الرقمية، والبرمجيات الاستحواذ.

ملاحظة: تم الكشف عن مضان من اليكسا فلور 647 باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 590-650 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 663-735 نانومتر، وغير صحيح اللون الأحمر. تم الكشف عن مضان من SYTOX الأخضر باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 465-495 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 515-555 نانومتر. تم الكشف عن مضان من دابي باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 355-375 نانومتر ومرشح حاجز 400 نانومتر.

  1. وسوف يؤدي هذا البروتوكول في صور حيث تظهر البكتيريا غير قابل للحياة الخارجية الحمراء + الخضراء والبكتيريا غير قابل للحياة الداخلية تظهر أخضر + أزرق، والبكتيريا قادرة على البقاء الخارجية تظهر أحمر + أزرق، والبكتيريا الداخلية قابلة للحياة تظهر الزرقاء فقط (الشكل 4). قياس المئة من البكتيريا الخارجية والداخلية كما هو موضح في البروتوكول الظريفص 1.11.
  2. وتحدد الضوابط المبينة في البروتوكول خطوة 1.12 ينبغي أن يقوم مع دابي / SYTOX الأخضر صبغ مزيج (الشكلين 2 و 3).

3. تقييم الجدوى البكتيرية إلى جانب توطين التحت خلوية

  1. البكتيريا التسمية في المصالح مع 10 ميكروغرام / مل دابي في متوسطة مورس محدد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  2. تصيب الخلايا التي هي ملتصقة إلى 12 مم coverslips الزجاج الدائرية في 24 لوحات جيدة مع البكتيريا دابي المسمى. لا تصلح الخلايا مع الألدهيدات أو المذيبات العضوية.
  3. شطف خلايا مرة واحدة مع اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  4. احتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام مع اليكسا فلور الأضداد مقرونة-647 أو كتين التي تربط إلى الأنواع البكتيرية من الفائدة، في اجتماعات الأطراف / MgCl 2، للكشف عن البكتيريا الخارجية. انظر الملاحظة في البروتوكول الخطوة 1.3 لعناصر المقترحة.
  5. وسائل الإعلام نضح من الخلايا وشطف خليتين منظمة الشفافية الدوليةMES في اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  6. احتضان الخلايا مع اليكسا فلور الأضداد مقرونة-555 ضد علامة التحت خلوية من الفائدة لمدة 20 دقيقة، في اجتماعات الأطراف / MgCl 2 تحتوي على 0.2٪ سابونين.
  7. شطف الخلايا مرتين في اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  8. غسل خلايا مرة واحدة في اجتماعات الأطراف / MgCl 2 لمدة 5 دقائق.
  9. وسائل الإعلام نضح من الخلايا وإضافة 0.4 ميكرومتر SYTOX الخضراء في اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  10. احتضان الخلايا 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  11. شطف الخلايا مرتين في اجتماعات الأطراف / MgCl 2.
  12. غسل خلايا مرة واحدة في اجتماعات الأطراف / MgCl 2 لمدة 5 دقائق.
  13. الحصول على صور من الشرائح في غضون 30 دقيقة على المجهر مضان. انظر البروتوكول الخطوة 1.9 لوصف المجهر، والكاميرا الرقمية، والبرمجيات الاستحواذ.

ملاحظة: تم الكشف عن مضان من اليكسا فلور 647 باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 590-650 نانومتر وتصفية الانبعاثات من 663-735 نانومتر، وباطل اللون الأرجواني. مضان وتم الكشف مدمج اليكسا فلور 555 باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 540-580 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 600-660 نانومتر. تم الكشف عن مضان من SYTOX الأخضر باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 465-495 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 515-555 نانومتر. تم الكشف عن مضان من دابي باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 355-375 نانومتر ومرشح حاجز 400 نانومتر.

  1. وسوف يؤدي هذا البروتوكول في صور حيث تظهر البكتيريا غير قابل للحياة الخارجية الأرجواني + الخضراء والبكتيريا غير قابل للحياة الداخلية تظهر أخضر + أزرق، والبكتيريا قادرة على البقاء الخارجية تظهر الأرجواني الأزرق + والبكتيريا الداخلية قابلة للحياة تظهر الأزرق فقط، ويظهر بروتين التحت خلوية الحمراء (الشكل 4). قياس perecent من البكتيريا قادرة على البقاء الخارجية والداخلية كما هو موضح في البروتوكول الخطوات 1.11.
  2. وتحدد الضوابط المبينة في البروتوكول خطوة 1.12 ينبغي أن يقوم مع دابي / SYTOX الأخضر صبغ مزيج (الشكلين 2 و 3).
  3. فيبالإضافة إلى عد البكتيريا قادرة على البقاء وغير قابل للحياة، وتصنيف كل البكتيريا إما إيجابية أو سلبية على colocalization مع علامة التحت خلوية من الفائدة.
  4. حساب في المئة من البكتيريا قادرة على البقاء colocalized مع علامة التحت خلوية بقسمة عدد من البكتيريا قادرة على البقاء colocalized من العدد الكلي للبكتيريا قابلة للحياة. حساب في المئة من البكتيريا غير قابل للحياة colocalized مع علامة التحت خلوية بقسمة عدد من البكتيريا colocalized غير قابل للحياة من العدد الكلي للبكتيريا غير قابل للحياة.

النتائج

تم استخدام البروتوكولات المحددة لدراسة بقاء N. البنية بعد التعرض لالإنسان الأساسية العدلات 5،26. أصيب العدلات مع N. البنية ومعالجتها مع بروتوكول 1، وذلك باستخدام الخضراء الفلورسنت SYTO9 الجدوى صبغ والحمراء الفلورسنت يوديد propidium (الشكل 4A). أضيفت ال...

Discussion

المقدمة هنا نوعان من البروتوكولات التي تستخدم الحمض النووي ملزمة والأصباغ جدوى بالتزامن مع كتين الفلورسنت لتحديد البكتيريا الحية والميتة وتعلق داخل الخلايا البشرية. لأن كلا من بروتوكولات تميز بفعالية الحية من البكتيريا الميتة، واختيار أي بروتوكول لاستخدام يعتمد ?...

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

نشكر بنك آسيا سميرنوف ولورا Gonyar لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة وأيد منح R00 R01 TW008042 وAI097312 لAKCMBJ في جزء من المعاهد الوطنية للصحة AI007046 T32.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collectionBecton Dickinson367251 
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 mlBecton Dickinson366480 
Sterile water for irrigationBaxter07-09-64-070 
Dextran 500Sigma31392 
Sodium ChlorideFisher ScientificS641 
DextroseRicca Chemical CompanyRDCD0200 
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+Thermo ScientificSH3002802 
Ficoll solutionGE Healthcare17-1440-03 
Acetic AcidFisher ScientificBP2401 
12 mm circular glass coverslipsFisher Scientific12-545-80 12CIR-1 
24-well platesCorning Incorporated3524 
Pooled Human SerumSigmaS7023 
RPMIMediatech15-040-CV 
Fetal Bovine SerumThermo ScientificSH3007103 
Human interleukin-8R&D Systems208-IL/CF 
MOPSSigmaM3183 
MgCl2Fisher ScientificBP214 
Propidium IodideLife TechnologiesL7007 or L7012 
SYTO9Life TechnologiesL7007 or L7012 
SaponinFluka Analytical47036 
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectinLife TechnologiesL-32463 
DAPISigmaD8417 
SYTOX GreenLife TechnologiesS7020 
Mouse anti-CD63Developmental Studies Hybridoma BankH5C6 
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling KitLife TechnologiesA20187 
Hemacytometer Bright LineHausser Scientific1492 
ForcepsEMS78320 
Sorvall Legend RT + CentrifugeThermo Scientific75004377 

References

  1. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
  2. Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
  3. Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
  4. Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
  5. Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
  6. Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
  7. Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
  8. Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
  9. Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
  10. Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
  11. Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
  12. Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
  13. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).
  14. Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
  15. Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
  16. Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
  17. Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
  18. Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
  19. Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
  20. Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
  21. Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
  22. Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
  23. Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
  24. Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
  25. Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
  26. Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
  27. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

79

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved