Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Résumé

Au centre du champ de la pathogenèse bactérienne est la possibilité de définir si et comment les microbes survivent après une exposition à des cellules eucaryotes. Cet article décrit les protocoles pour l'utilisation de colorants fluorescents qui révèlent la viabilité des bactéries individuelles à l'intérieur et associés à des cellules hôtes.

Résumé

Au centre du champ de la pathogenèse bactérienne est la possibilité de définir si et comment les microbes survivent après une exposition à des cellules eucaryotes. Les protocoles actuels pour répondre à ces questions comprennent des essais de comptage des colonies, des essais de protection gentamicine, et la microscopie électronique. le nombre de colonies et de protection de la gentamicine essais seulement évaluer la viabilité de l'ensemble de la population bactérienne et sont incapables de déterminer la viabilité bactérienne individu. La microscopie électronique peut être utilisé pour déterminer la viabilité des bactéries individuelles et fournir des informations en ce qui concerne leur localisation dans les cellules hôtes. Cependant, les bactéries présentent souvent une gamme de densités d'électrons, ce qui rend difficile l'évaluation de la viabilité. Cet article décrit les protocoles pour l'utilisation de colorants fluorescents qui révèlent la viabilité des bactéries individuelles à l'intérieur et associés à des cellules hôtes. Ces tests ont été développés à l'origine pour évaluer la survie de Neisseria gonorrhoeae dans les neutrophiles humains primaires, mais doit être unpplicable toute interaction cellulaire bactérie-hôte. Ces protocoles associent des colorants fluorescents membrane perméable (SYTO9 et 4 ',6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), qui colore toutes les bactéries, avec des colorants de membrane imperméable fluorescent (iodure de propidium et SYTOX vert), qui ne sont accessibles à bactéries non viables. Avant la perméabilisation de la cellule eucaryote, d'un anticorps ou d'un réactif fluorescent est ajouté à identifier les bactéries extracellulaires. Ainsi, ces tests de discrimination de la viabilité des bactéries adhérentes et à l'intérieur des cellules eucaryotes. Un protocole est également prévue en utilisant les colorants de viabilité en combinaison avec des anticorps fluorescents à des marqueurs de cellules eucaryotes, afin de déterminer la localisation subcellulaire des bactéries individuelles. Les colorants de viabilité bactériennes décrites dans cet article sont un complément et / ou solution de rechange adaptée à des techniques de microbiologie traditionnelle pour évaluer la viabilité des bactéries individuelles et fournir des informations sur l'endroit où les bactéries survivent dans une cellule hôtes.

Introduction

Il existe une interaction dynamique et co-évolution entre les bactéries et les hôtes où ils résident. Les bactéries ont évolué organelles d'adhérence, des systèmes de sécrétion, et / ou la capacité de produire des toxines qui permettent leur infection productive de phagocytose de l'hôte et des cellules non phagocytaires. Les bactéries doivent également composer avec la reconnaissance et l'activité antimicrobienne du système immunitaire de l'hôte. Le système immunitaire de l'hôte est constitué de composants innée et adaptative, y compris des barrières physiques et chimiques, les cellules du système immunitaire, le système du complément et d'autres composants de l'immunité humorale. Alors que de nombreuses bactéries sont sensibles à la destruction et à un dégagement de la réponse de l'hôte immunisé à couches multiples, certaines bactéries pathogènes et opportunistes ont développé des mécanismes d'infecter une variété de cellules hôtes et de dénaturer un dégagement de l'hôte immunisé réponse ^1. Neisseria gonorrhoeae est un exemple d'un agent pathogène bactérien qui est très adapté à persister dans son hôte humain. N. gonorrhoeae colonise rapidement les surfaces luminales de cellules épithéliales de la muqueuse du tractus urogénital, du pharynx, de la conjonctive, et le rectum. Colonisation déclenche le recrutement abondant des neutrophiles au niveau des muqueuses. Les neutrophiles sont des phagocytes professionnels qui possèdent une variété de procédés antimicrobiens pour tuer les micro-organismes, mais N. gonorrhoeae est capable de survivre en présence de neutrophiles ^5.2. Comprendre comment les bactéries pathogènes telles que N. gonorrhoeae subvertir, supprimer, et détourner la réponse immunitaire à survivre finalement dans des environnements d'accueil normalement hostiles est cruciale pour le développement de nouvelles thérapies pour lutter contre les maladies infectieuses.

Les protocoles expérimentaux souvent utilisés pour étudier la survie des bactéries dans les cellules hôtes comprennent des dosages de comptage de colonies, des essais de protection de la gentamicine, et la microscopie électronique. Dans les dosages de comptage de colonies, une population de cellules infectées est lysé (par exemple, avec un détergent à WHich les bactéries sont résistantes) pour libérer les bactéries. Les lysats sont dilués et étalés sur des milieux à base d'agar-agar-, et des unités formant des colonies dans les lysats sont énumérées pour chaque point de temps et / ou d'une condition expérimentale. Cette approche rend compte de la viabilité de l'ensemble de la population bactérienne, mais n'est pas capable de faire la différence entre la survie intracellulaire et extracellulaire. Une variante de l'essai de comptage de colonies, l'essai de protection de la gentamicine, la mesure spécifiquement la survie bactérienne intracellulaire, sur la base de l'incapacité des antibiotiques gentamicine à traverser la membrane plasmique eucaryote ^6. Toutefois, ce dosage est dépendant de la bactérie étant sensible à la destruction par la gentamicine (ou un autre antibiotique qui est similaire à la membrane eucaryote impermeant) et l'incapacité de l'antibiotique d'avoir accès à des bactéries internes. Par conséquent, un test de protection de la gentamicine peut ne pas être efficace pour l'examen de toutes les espèces bactériennes ou lors de l'examen survie bactérienne dans trèspinocytaire cellules telles que les neutrophiles. Aucune de ces approches révèle la localisation subcellulaire ou tout autre comportement de bactéries individuelles (par exemple, si les bactéries forment des agrégats ou microcolonies qui se comportent différemment à partir de cellules bactériennes individuelles). Une autre approche fréquemment utilisé pour examiner la viabilité des bactéries externes et internes individuelles est la microscopie électronique à transmission à section mince (TEM). Cette approche est avantageuse en ce qu'elle peut fournir des informations concernant l'emplacement de la bactérie dans les cellules hôtes (par exemple phagosome, cytoplasme, autophagosome), qui peut être davantage étudiée par microscopie immuno-électronique avec des anticorps d'or couplés à des marqueurs contre subcellulaires. Cependant, la microscopie électronique n'est pas particulièrement sensible à l'évaluation de la viabilité bactérienne. Lorsque les sections sont colorées incorporées à l'acétate d'uranyle, le citrate de plomb, ou d'autres réactifs denses aux électrons et imagées par microscopie électronique, les bactéries denses aux électrons sont considérés comme viable et electron-lucent non viable ^7,8. Toutefois, cette hypothèse surestime la viabilité bactérienne, puisque seuls les bactéries mortes avec des membranes gravement perturbés et dépourvu de cytoplasme semble électron-Lucent. De plus, certaines espèces bactériennes peuvent présenter une gamme de densités d'électrons en fonction de leur stade de croissance, ce qui rend difficile la détermination de la viabilité.

Comme alternative ou en plus de ces procédés couramment utilisés, nous fournissons ici les protocoles et les raisons de l'utilisation de colorants fluorescents qui indiquent la viabilité bactérienne afin d'évaluer la survie des bactéries fixées à et internalisées par des cellules hôtes. Pour identifier les bactéries extracellulaires, les cellules infectées sont d'abord exposés à un réactif fluorescent, tel que la lectine ou un anticorps spécifique de bactéries. Les cellules infectées sont ensuite perméabilisées et exposés à des colorants spécifiques à l'ADN qui sont accessibles aux bactéries de façon différentielle avec des membranes intactes vs dégradés, comme substitut de la viabilité bactérienne. Dans la première protocol, la membrane perméable SYTO9 de colorant identifie la population bactérienne totale, tandis que l'iodure de propidium est uniquement accessible aux bactéries qui ont compromis les membranes et sont donc considérés comme non viable. L'iodure de propidium et SYTO9 ont été utilisées pour évaluer la viabilité bactérienne dans les biofilms, discrimination pathogène à partir de bactéries non pathogènes, et énumérer les bactéries d'origine hydrique viables ^9-12. Dans le second protocole, 4 ', 6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI) identifie les bactéries totales, tandis que SYTOX vert est uniquement accessible à la population non viable. Ces paires viabilité de colorants peuvent être combinés avec immunofluorescence pour déterminer l'emplacement de chaque bactérie par rapport à une protéine d'intérêt, par exemple pour définir la localisation sous-cellulaire bactérienne. L'utilisation de ces tests donne un aperçu de la clé dans les interactions qui résultent en la destruction des bactéries ou de la survie au cours de l'infection de cellules hôtes. Les protocoles décrits dans cet article ont été utilisés pour évaluer la viabilité deN. gonorrhoeae qui est fixée à l'intérieur et les neutrophiles humains primaires, y compris dans les différentes populations de neutrophiles ^5,13,14 phagosomes. Toutefois, ces protocoles peuvent être utilisés pour évaluer la viabilité de bactéries gram-positives et gram-négatives dans les phagocytes professionnels, des phagocytes non-professionnels, des protozoaires et des ^{15 à 24.}

Protocole

Une. Évaluation de la viabilité bactérienne avec l'iodure de propidium et SYTO9

1. Infecter des cellules qui sont adhérentes à 12 mm de diamètre de cercle des lamelles de verre dans des plaques à 24 puits avec des bactéries d'intérêt. Ne pas fixer les cellules avec des aldéhydes ou des solvants organiques.
2. Rincer les cellules une fois doucement dans 0,1 M de 3 - (N-morpholino) propanesulfonique (MOPS), pH 7,2, contenant 1 mM de _MgCl2 (MOPS / MgCl _2).
3. Incuber les cellules pendant 10 min à l'obscurité à la température ambiante avec Alexa Fluor 647 anticorps ou la lectine qui se lie à couplage de l'espèce bactérienne d'intérêt, dans MOPS / MgCl _2, pour détecter les bactéries externes.

REMARQUE: procéder à des contrôles par des bactéries vivantes et mortes, en l'absence de cellules hôtes, pour montrer que la lectine ou anticorps d'intérêt se lie toutes les bactéries indépendamment de la viabilité (Figure 1).

4. Rincer les cellules deux fois avec MOPS / MgCl _2.
5. Aspirer mdias de cellules et ajouter 0,5 ml Vivant / Mort coloration Solution. Vivant / Mort Solution de coloration est de 5 uM SYTO9, 30 uM de l'iodure de propidium, et 0,1% de saponine (concentrations finales) dans MOPS / MgCl _2.
6. Incuber les cellules pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
7. Rincer les cellules deux fois dans MOPS / MgCl _2.
8. lamelles Inverser face vers le bas sur des lames de verre et sceller avec du vernis à ongles transparent. N'utilisez pas de support de montage.
9. Acquérir des images à l'intérieur de 30 min, en utilisant un microscope à fluorescence avec des jeux de filtres compatibles avec l'acquisition des images verte, rouge, et rouge lointain.

REMARQUE: Les deux microscopie de fluorescence conventionnelle et la microscopie confocale à balayage laser peut être utilisé. Après 30 minutes, les colorants fluorescents commencent à fuir par les bactéries et les données acquises ne sont plus exactes. Les images présentées dans cet article ont été acquis sur un montant microscope à fluorescence Nikon Eclipse E800 avec appareil photo numérique Hamamatsu Orca-ER en utilisant un logiciel Openlab. La fluorescence de l'Alexa Fluor 647 a été détectée en utilisant un filtre ayant une longueur d'onde d'excitation de 590-650 nm et un filtre d'émission de 663 à 735 nm, et est de couleur bleu-faux. La fluorescence de l'iodure de propidium a été détectée en utilisant un filtre ayant une longueur d'onde d'excitation de 540-580 nm et un filtre d'émission de 600 à 660 nm. La fluorescence a été détectée à partir de SYTO9 en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d'onde de 465-495 nm et un filtre d'émission de 515 à 555 nm.

10. Ce protocole se traduira par des images où les bactéries non viables externes apparaissent bleu + rouge, bactéries internes non viables apparaissent en rouge seulement, bactéries viables externes apparaissent en bleu + vert, et les bactéries viables internes apparaissent en vert seulement. Compter oeil par le nombre de bactéries qui sont externes non viables, non viables interne, externe viable, et interne viable.
11. Calculer le pour cent de bactéries viables externe en divisant le nombre de bactéries viables externes par le nombre total de bactéries externes (viable, plus nonvimesure). Calculer le pour cent des bactéries viables internes en divisant le nombre de bactéries viables internes par le nombre total de bactéries internes (non viable, plus viable) (Figure 4).
12. Il existe deux contrôles essentiels à effectuer avec ce protocole. Tout d'abord, valider que toutes les bactéries non viables sont l'iodure de propidium positif et toutes les bactéries vivantes sont SYTO9 positif. Un milieu de culture logarithmique de bactéries (en l'absence de toute cellule de l'hôte) doit être> 95% SYTO9-positif. Illustrée à la figure 2 est une culture à mi-logarithmique de N. gonorrhoeae (à 10 ⁸ unités formatrices de colonies par ml former) incubées avec mort Colorant / Live. Deuxièmement, valider que les deux iodure de propidium et SYTO9 peuvent entrer perméabilisées, des cellules hôtes infectées.
    1. Pour générer une population de bactéries mortes, de recueillir 2 x 10 ⁸ unités colonie bactérienne dans un tube de 1,5 ml former, ajouter 70% d'isopropanol et de s'asseoir pendant 10 min. Pellet les bactéries dans une micro-une laver les bactéries deux fois dans du PBS pour éliminer l'isopropanol résiduel. Ensuite, suivez les étapes protocole 1.5 à 1.7. Ajouter 5 ul de suspension bactérienne à une lame de verre et recouvrir d'une lamelle. échantillons de l'image que dans le protocole étape 1.9. Dans ces conditions, 100% de la population devrait être l'iodure de propidium-positive (figure 2). Chez certaines espèces bactériennes, l'iodure de propidium peut pas complètement submerger SYTO9 coloration, et les bactéries non viables peut apparaître jaune ou orange.
    2. Pour des cellules phagocytaires telles que les neutrophiles, exposer les cellules de bactéries tuées par l'isopropanol et de veiller à ce que 100% des bactéries intracellulaires sont l'iodure de propidium-positif (Figure 3). Pour les cellules non phagocytaires qui ne peuvent pas internaliser les bactéries mortes, il peut être suffisant pour traiter les cellules infectées avec l'azoture de sodium ou d'autres agents antimicrobiens cellules infiltrant avant d'ajouter Vivant / Mort coloration Solution.

2. Évaluation de la viabilité bactérienne avec SYTOX Green et DAPI

1. bactéries Label d'intérêt avec 10 pg / ml DAPI en milieu défini de Morse ²⁵ pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité.
2. Infecter des cellules qui sont adhérentes à 12 mm de diamètre de cercle des lamelles de verre dans des plaques à 24 puits avec des bactéries marquées au DAPI. Ne pas fixer les cellules avec des aldéhydes ou des solvants organiques.
3. Rincer les cellules une fois avec MOPS / MgCl _2.
4. Incuber les cellules pendant 10 min à température ambiante dans l'obscurité avec Alexa Fluor 647 anticorps ou la lectine qui se lie à couplage de l'espèce bactérienne d'intérêt, dans MOPS / MgCl _2, pour détecter les bactéries externes. Voir la note dans le protocole étape 1.3 pour les contrôles proposés.
5. Aspirer le milieu de cellules et ajouter 0,5 ml 0,4 uM SYTOX vert dans MOPS / MgCl _2.
6. Incuber les cellules pendant 5 min à température ambiante dans l'obscurité.
7. Rincer les cellules deux fois dans MOPS / MgCl _2.
8. Laver les cellules une fois dans du MOPS / MgCl ₂ à 5 min.
9. Acquérir les images dans les 30 min avec un microscope à fluorescence. Voir protocole étape 1.9 pour la description de microscope, appareil photo numérique, et le logiciel d'acquisition.

REMARQUE: La fluorescence à partir de l'Alexa Fluor 647 a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d'onde de 590-650 nm et un filtre d'émission de 663 à 735 nm, et est de couleur rouge-faux. La fluorescence de SYTOX vert a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d'onde de 465-495 nm et un filtre d'émission de 515 à 555 nm. La fluorescence de DAPI a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d'onde de 355-375 nm et un filtre d'arrêt de 400 nm.

10. Ce protocole se traduira par des images où les bactéries non viables externes apparaissent rouge + vert, les bactéries non viables internes apparaissent en vert + bleu, bactéries viables externes apparaissent en rouge + bleu, et les bactéries viables internes apparaissent en bleu uniquement (Figure 4). Quantifier le pour cent des bactéries internes et externes, comme décrit dans le protocole step 1,11.
11. Les contrôles décrits dans le protocole étape 1.12 doivent être effectués avec le colorant combinaison DAPI / SYTOX vert (figures 2 et 3).

3. Évaluation de la viabilité bactérienne Outre la localisation subcellulaire

1. bactéries Label d'intérêt avec 10 pg / ml DAPI dans Défini le moyen de Morse pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité.
2. Infecter des cellules qui sont adhérentes à 12 mm de diamètre de cercle des lamelles de verre dans des plaques à 24 puits avec des bactéries marquées au DAPI. Ne pas fixer les cellules avec des aldéhydes ou des solvants organiques.
3. Rincer les cellules une fois avec MOPS / MgCl _2.
4. Incuber 10 min à température ambiante dans l'obscurité avec Alexa Fluor 647 anticorps ou la lectine qui se lie à couplage de l'espèce bactérienne d'intérêt, dans MOPS / MgCl _2, pour détecter les bactéries externes. Voir la note dans le protocole étape 1.3 pour les contrôles proposés.
5. Aspirer le milieu de cellules et rincer les cellules deux times dans MOPS / MgCl _2.
6. Incuber les cellules avec Alexa Fluor 555 anticorps contre le marqueur couplé subcellulaire d'intérêt pendant 20 min, en MOPS / MgCl ₂ contenant 0,2% de saponine.
7. Rincer les cellules deux fois dans MOPS / MgCl _2.
8. Laver les cellules une fois dans du MOPS / MgCl ₂ à 5 min.
9. Aspirer le milieu de cellules et ajouter 0,4 uM SYTOX vert dans MOPS / MgCl _2.
10. Incuber les cellules 5 min à température ambiante dans l'obscurité.
11. Rincer les cellules deux fois dans MOPS / MgCl _2.
12. Laver les cellules une fois dans du MOPS / MgCl ₂ à 5 min.
13. Acquérir les images de diapositives dans les 30 minutes sur un microscope à fluorescence. Voir protocole étape 1.9 pour la description de microscope, appareil photo numérique, et le logiciel d'acquisition.

REMARQUE: Fluorescence de Alexa Fluor 647 a été détecté en utilisant un filtre à onde d'excitation de 590 à 650 nm et un filtre d'émission de 663 à 735 nm, et est faux de couleur pourpre. Fluorescence from Alexa Fluor 555 a été détectée en utilisant un filtre ayant une longueur d'onde d'excitation de 540-580 nm et un filtre d'émission de 600 à 660 nm. La fluorescence de SYTOX vert a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d'onde de 465-495 nm et un filtre d'émission de 515 à 555 nm. La fluorescence de DAPI a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d'onde de 355-375 nm et un filtre d'arrêt de 400 nm.

14. Ce protocole se traduira par des images où les bactéries non viables externes apparaissent violet + vert, les bactéries non viables internes apparaissent en vert + bleu, bactéries viables externes apparaissent violet + bleu, bactéries viables internes apparaissent en bleu seulement, et la protéine intracellulaire apparaît rouge (Figure 4). Quantifier la perecent de bactéries viables externes et internes tel que décrit dans le protocole étapes 1.11.
15. Les contrôles décrits dans le protocole étape 1.12 doivent être effectués avec le colorant combinaison DAPI / SYTOX vert (figures 2 et 3).
16. Dansplus de compter des bactéries viables et non viables, de classer chaque bactérie comme positif ou négatif pour la colocalisation avec le marqueur subcellulaire d'intérêt.
17. Calculer le pour cent de bactéries viables colocalisés avec le marqueur subcellulaire en divisant le nombre de bactéries viables colocalisés par le nombre total de bactéries viables. Calculer le pour cent des bactéries non viables colocalisés avec le marqueur subcellulaire en divisant le nombre de bactéries non viables colocalisés par le nombre total de bactéries non viables.

Résultats

Les protocoles décrits ont été utilisés pour examiner la survie de N. gonorrhoeae après l'exposition à l'humain primaire neutrophiles ^5,26. Les neutrophiles ont été infectées par N. gonorrhoeae et traitées avec le protocole 1, en ​​utilisant la viabilité SYTO9 colorant vert fluorescent et de l'iodure de propidium-rouge fluorescent (figure 4A). Les colorants ont été ajoutés en présence de saponine, qui séquestre le cholestérol pour perméabili...

Discussion

Présentés ici sont deux protocoles qui utilisent liaison à l'ADN et les colorants de viabilité en conjonction avec une lectine fluorescente pour identifier les bactéries vivantes et mortes et attachés à l'intérieur des cellules humaines. Depuis deux protocoles pénalisent en direct de bactéries mortes, le choix de protocole à utiliser dépend du but de l'expérience. Le premier protocole utilise l'iodure de propidium pour détecter les bactéries non viables et SYTO9 pour détecter les bactéri...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection	Becton Dickinson	367251
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml	Becton Dickinson	366480
Sterile water for irrigation	Baxter	07-09-64-070
Dextran 500	Sigma	31392
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S641
Dextrose	Ricca Chemical Company	RDCD0200
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+	Thermo Scientific	SH3002802
Ficoll solution	GE Healthcare	17-1440-03
Acetic Acid	Fisher Scientific	BP2401
12 mm circular glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
24-well plates	Corning Incorporated	3524
Pooled Human Serum	Sigma	S7023
RPMI	Mediatech	15-040-CV
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH3007103
Human interleukin-8	R&D Systems	208-IL/CF
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Propidium Iodide	Life Technologies	L7007 or L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 or L7012
Saponin	Fluka Analytical	47036
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
Mouse anti-CD63	Developmental Studies Hybridoma Bank	H5C6
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit	Life Technologies	A20187
Hemacytometer Bright Line	Hausser Scientific	1492
Forceps	EMS	78320
Sorvall Legend RT + Centrifuge	Thermo Scientific	75004377