Флуоресцентной микроскопии Методы определения жизнеспособности бактерий в ассоциации с клетках млекопитающих

Резюме

Центральное место в области бактериального патогенеза является возможность определить, если и как микробы выживают после воздействия эукариотических клетках. В этой статье описываются протоколы для использования флуоресцентных красителей, которые показывают жизнеспособность отдельных бактерий внутри и связанных с клетками-хозяевами.

Аннотация

Центральное место в области бактериального патогенеза является возможность определить, если и как микробы выживают после воздействия эукариотических клетках. Современные протоколы для решения этих вопросов, включают количество колоний анализы, анализы, гентамицин защиты и электронной микроскопии. Кол колонии и защиты гентамицин анализы только оценки жизнеспособности всей популяции бактерий и не в состоянии определить индивидуальный бактериальную жизнеспособность. Электронной микроскопии может быть использован для определения жизнеспособности отдельных бактерий и предоставить информацию относительно их локализации в клетках-хозяевах. Тем не менее, бактерии часто показывают диапазон плотностей электронов, что делает оценка жизнеспособности трудно. В этой статье описываются протоколы для использования флуоресцентных красителей, которые показывают жизнеспособность отдельных бактерий внутри и связанных с клетками-хозяевами. Эти анализы были разработаны первоначально для оценки выживаемости гонококков в первичных человеческих нейтрофилов, но должно бытьpplicable для любого взаимодействия бактерия-клетки-хозяина. Эти протоколы объединить мембранные проницаемым флуоресцентные красители (SYTO9 и 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола [ДАПИ]), который окрашивает все бактерии, с мембранными непроницаемый флуоресцентных красителей (пропидийиодидом и Sytox зеленый), которые доступны только для нежизнеспособные бактерии. До эукариотической клеточной проницаемости, антитело или флуоресцентный реагент добавляют к идентификации внеклеточных бактерий. Таким образом, эти анализы дискриминации жизнеспособность бактерий приверженцем и внутри эукариотических клетках. Протокол также предоставляется для использования жизнеспособность красителей в сочетании с флуоресцентными антителами к эукариотических клеток маркеров, для того, чтобы определить внутриклеточную локализацию отдельных бактерий. Бактериальные жизнеспособности красители, обсуждаемые в этой статье, являются чувствительными дополнением и / или альтернативой традиционным методам микробиологических оценить жизнеспособность отдельных бактерий и предоставить информацию о том, где бактерии выживают в клетке-хозяинес.

Введение

Существует динамическое взаимодействие и коэволюция между бактериями и хозяев, в которых они проживают. Бактерии развивались приверженности органеллы, секреции системы, и / или способность производить токсины, которые позволяют их производственного заражение хозяина фагоцитарную и не-фагоцитов. Бактерии также должна будет бороться с признанием и антимикробных деятельности иммунной системы хозяина. Хозяин иммунная система состоит из врожденного и приобретенного компонентов, включая физических и химических барьеров, иммунных клеток, системы комплемента, и других компонентов гуморального иммунитета. Хотя многие бактерии чувствительны к гибели и очистки с помощью многослойной иммунного ответа, некоторые патогенные и условно-патогенные бактерии развивались механизмы заражают различные клетки-хозяева и саботировать зазор иммунного ответа ^1. Гонококков является одним из примеров бактериальным патогеном что в высшей степени приспособлен упорствовать в своем человеческого организма. N. гонореи легко колонизирует просвета поверхности эпителиальных клеток слизистых урогенитального тракта, глотки, конъюнктивы, и прямой кишки. Колонизация вызывает обильное вербовку нейтрофилов в местах слизистой. Нейтрофилов профессиональные фагоциты, которые обладают различными антимикробными процессов, чтобы убить микроорганизмы, однако Н. гонореи способен выживать в присутствии нейтрофилов ^2-5. Принципы действия бактериальных патогенов, таких как N. гонореи подорвать, подавить и захватить иммунный ответ, в конечном счете выжить в обычно враждебной среде принимающих имеет решающее значение для разработки новых методов лечения для борьбы с инфекционными заболеваниями.

Экспериментальные протоколы часто используются, чтобы исследовать выживаемость бактерий в клетках-хозяевах включают количество колоний анализы, анализы, гентамицин защиты и электронной микроскопии. В подсчета колоний анализов, население зараженных клеток лизируется (например, с помощью моющего средства для WHич бактерии устойчивы), чтобы освободить бактерии. Лизаты разбавляют и высевают на агар на основе информации, а колониеобразующих единиц в лизатах перечислены для каждой временной точки и / или экспериментальных условиях. Этот подход сообщает жизнеспособность всей популяции бактерий, но не способны дифференцироваться между внутриклеточным и внеклеточным выживания. Вариация на количество колоний анализа, анализа защиты гентамицин, специально измеряет внутриклеточный выживаемость бактерий, основанный на неспособности к антибиотикам гентамицин, чтобы пересечь эукариотической мембрану плазмы ^6. Тем не менее, этот анализ зависит от бактерий, являющихся восприимчивыми к гентамицину погибли на (или другого антибиотика, который аналогичным образом эукариотической мембраной impermeant) и неспособности антибиотика, чтобы иметь доступ к внутренним бактерий. Таким образом, защита гентамицин анализ не может быть эффективным для изучения всех видов бактерий или при рассмотрении выживаемость бактерий в сильнопиноцитозные клетки, такие как нейтрофилы. Ни один из этих подходов раскрывает внутриклеточную локализацию или другой поведение отдельных бактерий (например, если бактерии образуют агрегаты или микроколонии, которые ведут себя иначе, чем отдельных бактериальных клеток). Другим часто используемым подходом для изучения жизнеспособности отдельных внешних и внутренних бактерий тонкого раздел просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Этот подход имеет то преимущество, что она может предоставить информацию о местоположении бактерий в клетках-хозяевах (например Фагосомы, цитоплазма, аутофагосом), которые могут быть дополнительно исследованном иммуноэлектронной микроскопии с золотом в сочетании антител против внутриклеточных маркеров. Тем не менее, электронная микроскопия не особенно чувствительны при оценке бактериальной жизнеспособности. Когда срезы окрашивали уранилацетатом, цитратом свинца или других электронно-плотные реагенты и отображаемого с помощью электронной микроскопии, электронно-плотные бактерии считаются жизнеспособными и электроэлектрон-Lucent нежизнеспособным ^7,8. Однако это предположение переоценивает бактериальную жизнеспособность, так как только те мертвых бактерий с сильно разрушенных мембран и лишены цитоплазмы появляются электронно-Lucent. Кроме того, некоторые виды бактерий могут вывести диапазон плотности электронов в зависимости от их стадии роста, что делает его трудно определить жизнеспособность.

В качестве альтернативы или в дополнение к этим широко используемых методов, здесь мы предлагаем протоколы и обоснование для использования флуоресцентных красителей, которые указывают бактериальной жизнеспособности для оценки выживаемости бактерий, прикрепленных к и усвоены клеток-хозяев. Для идентификации внеклеточных бактерий, инфицированные клетки сначала подвергают воздействию флуоресцентного реагента, такого как лектина или бактерии-специфические антитела. Инфицированные клетки затем проницаемыми и подвергаются ДНК-специфичных красителей, которые дифференциально доступны для бактерий с нетронутыми против деградированных мембран, в качестве суррогата жизнеспособность бактерий. В первом рrotocol, мембрана SYTO9 проницаемой краситель определяет общее бактериальное население, в то время как иодид пропидия доступна только для тех бактерий, которые скомпрометированы мембраны и, таким образом, считается нежизнеспособным. Пропидийиодидом и SYTO9 были использованы для оценки жизнеспособности бактерий в биопленки, различать патогенные от непатогенных бактерий и перечислить жизнеспособных воду бактерий ^9-12. Во второй схеме, 4 ', 6'-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) определяет общие бактерии, в то время как Sytox Зеленый доступен только на нежизнеспособных населения. Эти пары жизнеспособность красителя может быть объединен с иммунофлюоресценции, чтобы определить местоположение каждой бактерии в отношении представляющего интерес белка, например, чтобы определить бактериальную внутриклеточную локализацию. Использование этих анализов содержит ключевую представление о взаимодействий, которые приводят к гибели бактерий или выживание при заражении клеток-хозяев. Протоколы, изложенные в этой статье, были использованы для оценки жизнеспособностиН. гонореи, который прилагается к и внутри первичных человеческих нейтрофилов, в том числе в разных популяциях нейтрофилов фагосом ^5,13,14. Тем не менее, эти протоколы могут быть применены для оценки жизнеспособности грамположительных и грамотрицательных бактерий в профессиональных фагоцитах, непрофессиональной фагоцитов, и простейших ^15-24.

протокол

1. Оценивая жизнеспособность бактерий с пропидийиодидом и SYTO9

1. Инфицировать клетки, которые прилегает к диаметром 12 мм круглых покровные стекла в 24-луночных планшетах с бактерий, представляющих интерес. НЕ фиксации клеток с альдегидов или органических растворителей.
2. Промыть клетки один раз осторожно в 0,1 М 3 - (N-морфолино) пропансульфоновой кислоты (MOPS), рН 7,2, содержащем 1 мМ MgCl ₂ (MOPS / MgCl _2).
3. Инкубируйте клетки в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре с Alexa Fluor 647-антитела или в сочетании лектина, который связывается с бактериальных видов, представляющих интерес, в MOPS / MgCl _2, чтобы обнаружить внешние бактерии.

Примечание: Поведение управления с живых и мертвых бактерий, в отсутствие клеток-хозяев, чтобы показать, что лектин или интерес антитело связывает все бактерии, независимо от жизнеспособности (рис. 1).

4. Промыть клеткам два раза MOPS / MgCl _2.
5. Аспирируйте мEdia из клеток и добавить 0,5 мл Live / Dead красящий раствор. Live / Мертвые окрашивающим раствором составляет 5 мкм SYTO9, 30 мкМ йодид пропидия и 0,1% сапонина (конечные концентрации) в MOPS / MgCl _2.
6. Инкубируйте клетки в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
7. Промыть клеткам два раза в MOPS / MgCl _2.
8. Обратить покровные лицом вниз на стеклах и печать с четкой лака для ногтей. Не используйте монтажные СМИ.
9. Получение изображений в течение 30 мин, с помощью флуоресцентного микроскопа с наборами фильтров, совместимых с зеленого, красного и дальней красной получения изображений.

ПРИМЕЧАНИЕ: Оба обычных флуоресцентной микроскопии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии может быть использован. Через 30 мин флуоресцентные красители не начнут протекать от бактерий и данные, полученные больше не точны. Изображения, показанные в этой статье были приобретены на Nikon Eclipse E800 вертикальном флуоресцентного микроскопа с Хамамацу Orca-ER цифровой видеокамеры с помощью OpenLAB программное обеспечение. Флуоресценция Alexa Fluor 647 был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 590 - 650 нм и эмиссии фильтр 663 - 735 нм, и ложно цвета синий. Флуоресценции от пропидийиодидом был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 540 - 580 нм и эмиссии фильтра 600 - 660 нм. Флуоресценции от SYTO9 был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 465 - 495 нм и эмиссии фильтр 515 - 555 нм.

10. Этот протокол приведет изображений, где внешние нежизнеспособные бактерии появляются синий + красный, внутренние нежизнеспособные бактерии появляются красные только внешние жизнеспособных бактерий появляются синий + зеленый, и внутренние жизнеспособных бактерий появляются только зеленый. Всего на глаз число бактерий, которые являются внешними нежизнеспособным, внутренняя нежизнеспособным, внешний жизнеспособным, и внутренняя жизнеспособным.
11. Рассчитать процент жизнеспособных бактерий внешних путем деления количества внешних жизнеспособных бактерий на общее количество внешних бактерий (жизнеспособным плюс nonviсостоянии). Рассчитать процент жизнеспособных бактерий внутренних путем деления количества внутренних жизнеспособных бактерий на общее количество внутренних бактерий (жизнеспособным плюс нежизнеспособными) (рис. 4).
12. Есть два основных управления для выполнения с этим протоколом. Во-первых, проверьте, что все нежизнеспособные бактерии пропидий йодид-положительных и все живые бактерии являются SYTO9-положительным. Середины логарифмической культура бактерий (в отсутствие каких-либо клеток-хозяев) должна быть> 95% SYTO9-положительными. Показанный на рисунке 2 является среднего логарифмическая культура N. гонореи (в 10 ⁸ колониеобразующих единиц на мл) инкубировали с Live / Dead красящий раствор. Во-вторых, проверить, что оба пропидий йодид и SYTO9 можете ввести проницаемыми, зараженные клетки-хозяева.
    1. Чтобы создать популяцию мертвых бактерий, собирать 2 х 10 ⁸ бактерий колониеобразующих единиц в 1,5 мл пробирке, добавить 70% изопропанола и сидеть в течение 10 мин. Гранул бактерии в микроцентрифужную ай мыть бактерии дважды в PBS для удаления остаточного изопропанола. Затем следуйте протокол шаги 1.5 - 1.7. Добавьте 5 мкл бактериальной суспензии на предметное стекло и наложения с покровное. Образцы изображение как в протоколе шагом 1,9. В этих условиях 100% населения должны быть пропидий йодид-позитивными (рис. 2). В некоторых видов бактерий, пропидий йодид не может полностью подавить окрашивание SYTO9 и нежизнеспособные бактерии могут появиться желтые или оранжевые.
    2. Для фагоцитов как нейтрофилов, разоблачить клетки изопропанол убитых бактерий и убедитесь, что на 100% из внутриклеточных бактерий являются пропидий йодо-положительным (рис. 3). Для nonphagocytic клеток, которые не могут интернализации мертвые бактерии, может быть достаточным для лечения инфицированных клеток с азидом натрия или других проникающий в клетку антимикробных агентов перед добавлением Live / Мертвые окрашивающим раствором.

2. Оценивая жизнеспособность бактерий с Sytox Greeп и DAPI

1. Этикетка бактерии интересов с 10 мкг / мл DAPI в Морса определенной среде ²⁵ в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте.
2. Инфицировать клетки, которые прилегает к диаметром 12 мм круглых покровные стекла в 24-луночных планшетах с DAPI-меченых бактерий. НЕ фиксации клеток с альдегидов или органических растворителей.
3. Промойте клетки один раз MOPS / MgCl _2.
4. Инкубируйте клетки в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте с Alexa Fluor 647-антитела или в сочетании лектина, который связывается с бактериальных видов, представляющих интерес, в MOPS / MgCl _2, чтобы обнаружить внешние бактерии. См. примечание в протоколе шагом 1.3 для предложенных управления.
5. Аспирируйте медиафайлы от клеток и добавить 0,5 мл 0,4 мкм Sytox Грин в MOPS / MgCl _2.
6. Инкубируйте клетки в течение 5 мин при комнатной температуре в темноте.
7. Промыть клеткам два раза в MOPS / MgCl _2.
8. Промывают клетки один раз в MOPS / MgCl ₂ в течение 5 мин.
9. Получение изображений в течение 30 мин с флуоресцентным микроскопом. См. протокол шаг 1,9 для описания микроскопа, цифровой камеры и программного обеспечения приобретения.

ПРИМЕЧАНИЕ: флуоресценции от Alexa Fluor 647 был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 590 - 650 нм и эмиссии фильтр 663 - 735 нм, и ложно цвета красный. Флуоресценции от Sytox Грин был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 465 - 495 нм и эмиссии фильтр 515 - 555 нм. Флуоресценции от DAPI был обнаружен с помощью фильтра с длине волны возбуждения 355 - 375 нм и барьерным фильтром 400 нм.

10. Этот протокол приведет изображений, где внешние нежизнеспособные бактерии появляются красный + зеленый, внутренние нежизнеспособные бактерии появляются зеленый + синий, внешние жизнеспособных бактерий появляются красный + синий, и внутренние жизнеспособных бактерий появляются синие только (рис. 4). Количественная процентов внешних и внутренних бактерий, как описано в протоколе стер 1,11.
11. Элементы управления, описанные в протоколе шагом 1,12 должна быть выполнена с комбинацией DAPI / Sytox Зеленая краска (рис. 2 и 3).

3. Оценивая жизнеспособность бактерий Наряду внутриклеточной локализации

1. Этикетка бактерии интересов с 10 мкг / мл DAPI в определенной среде Морса в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте.
2. Инфицировать клетки, которые прилегает к диаметром 12 мм круглых покровные стекла в 24-луночных планшетах с DAPI-меченых бактерий. НЕ фиксации клеток с альдегидов или органических растворителей.
3. Промойте клетки один раз MOPS / MgCl _2.
4. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре в темноте с Alexa Fluor 647-антитела или в сочетании лектина, который связывается с бактериальных видов, представляющих интерес, в MOPS / MgCl _2, чтобы обнаружить внешние бактерии. См. примечание в протоколе шагом 1.3 для предложенных управления.
5. Аспирируйте медиафайлы от клеток и промыть клеткам два тиМЧС в MOPS / MgCl _2.
6. Инкубируйте клетки с Alexa Fluor 555-сочетании антитела против маркера субклеточном интереса в течение 20 мин, в MOPS / MgCl _2, содержащий 0,2% сапонина.
7. Промыть клеткам два раза в MOPS / MgCl _2.
8. Промывают клетки один раз в MOPS / MgCl ₂ в течение 5 мин.
9. Аспирируйте медиафайлы от клеток и добавить 0,4 мкм Sytox Грин в MOPS / MgCl _2.
10. Инкубируйте клетки 5 мин при комнатной температуре в темноте.
11. Промыть клеткам два раза в MOPS / MgCl _2.
12. Промывают клетки один раз в MOPS / MgCl ₂ в течение 5 мин.
13. Получение изображений слайдов в течение 30 мин на флуоресцентном микроскопе. См. протокол шаг 1,9 для описания микроскопа, цифровой камеры и программного обеспечения приобретения.

ПРИМЕЧАНИЕ: флуоресценции от Alexa Fluor 647 был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 590 - 650 нм и эмиссии фильтр 663 - 735 нм, и ложно-фиолетового цвета,. Флуоресценции ером Alexa Fluor 555 был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 540 - 580 нм и эмиссии фильтра 600 - 660 нм. Флуоресценции от Sytox Грин был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 465 - 495 нм и эмиссии фильтр 515 - 555 нм. Флуоресценции от DAPI был обнаружен с помощью фильтра с длине волны возбуждения 355 - 375 нм и барьерным фильтром 400 нм.

14. Этот протокол приведет изображений, где внешние нежизнеспособные бактерии появляются фиолетовые + зеленый, внутренние нежизнеспособные бактерии появляются зеленый + синий, внешние жизнеспособных бактерий появляются фиолетовые + синий, внутренние жизнеспособных бактерий появляются синие только и субклеточная белок появляется красный (рис. 4). Количественная perecent внешних и внутренних жизнеспособных бактерий, как описано в протоколе шаги 1,11.
15. Элементы управления, описанные в протоколе шагом 1,12 должна быть выполнена с комбинацией DAPI / Sytox Зеленая краска (рис. 2 и 3).
16. Вдополнение к подсчету жизнеспособных и нежизнеспособных бактерий, классифицировать каждый бактерий, положительным или отрицательным для колокализации с субклеточном маркера интерес.
17. Рассчитать процент жизнеспособных бактерий локализуется с субклеточном маркера путем деления количества жизнеспособных бактерий локализуется на общее число жизнеспособных бактерий. Вычислить процентов нежизнеспособных бактерий локализуется с субклеточном маркера путем деления количества нежизнеспособных бактерий локализуется на общее количество нежизнеспособных бактерий.

Результаты

Протоколы, изложенные были использованы для изучения выживание N. гонореи после воздействия первичного нейтрофилов человека ^5,26. Нейтрофилы были инфицированы N. гонореи и обрабатываются с протоколом 1, используя SYTO9 зеленый-люминесцентные жизнеспособность красителя и к?...

Обсуждение

Здесь представлены два протокола, которые используют связывания ДНК и жизнеспособность красители в сочетании с флуоресцентным лектина, чтобы идентифицировать живые и мертвые бактерии, прикрепленные к и внутри клеток человека. Поскольку оба протокола эффективно различать в прямом эф...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection	Becton Dickinson	367251
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml	Becton Dickinson	366480
Sterile water for irrigation	Baxter	07-09-64-070
Dextran 500	Sigma	31392
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S641
Dextrose	Ricca Chemical Company	RDCD0200
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+	Thermo Scientific	SH3002802
Ficoll solution	GE Healthcare	17-1440-03
Acetic Acid	Fisher Scientific	BP2401
12 mm circular glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
24-well plates	Corning Incorporated	3524
Pooled Human Serum	Sigma	S7023
RPMI	Mediatech	15-040-CV
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH3007103
Human interleukin-8	R&D Systems	208-IL/CF
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Propidium Iodide	Life Technologies	L7007 or L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 or L7012
Saponin	Fluka Analytical	47036
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
Mouse anti-CD63	Developmental Studies Hybridoma Bank	H5C6
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit	Life Technologies	A20187
Hemacytometer Bright Line	Hausser Scientific	1492
Forceps	EMS	78320
Sorvall Legend RT + Centrifuge	Thermo Scientific	75004377