שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

Summary

מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח.

Abstract

מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. פרוטוקולים הנוכחיים כדי לענות על שאלות אלה כוללים מבחני ספירת מושבה, מבחני הגנת גנטמיצין, ומיקרוסקופ אלקטרונים. מבחני ספירת מושבה והגנת גנטמיצין רק להעריך את הכדאיות של אוכלוסיית החיידקים כולה ואינם מסוגלים לקבוע כדאיות חיידקים בודדות. במיקרוסקופ אלקטרונים ניתן להשתמש כדי לקבוע את הכדאיות של חיידקים בודדים ולספק מידע לגבי הלוקליזציה שלהם בתאי מארח. עם זאת, לעתים קרובות חיידקים להציג מגוון רחב של צפיפויות אלקטרונים, ביצוע הערכה של יכולת קיום קשה. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח. מבחני אלו פותחו במקור כדי להעריך הישרדות של Neisseria gonorrhoeae בנויטרופילים אנושיים ראשוניים, אבל צריך להיותpplicable לכל אינטראקציה תא חיידק מארח. פרוטוקולים אלה משלבים צבעי קרום חדיר ניאון (SYTO9 ו4 ',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), שמכתים את כל חיידקים, עם צבעי קרום בלתי חדיר ניאון (יודיד propidium וSytox ירוק), שהם נגישים רק ל חיידקי nonviable. לפני permeabilization תא אוקריוטים, נוגדן או מגיב ניאון מתווסף לזהות חיידקים תאיים. לכן מבחני אלה מפלים את הכדאיות של חיידקים חסידים ולבתוך תאי אוקריוטים. פרוטוקול הוא גם סיפק לשימוש בצבעי הכדאיות בשילוב עם נוגדני ניאון לסמני תא אוקריוטים, על מנת לקבוע את לוקליזציה subcellular של חיידקים בודדים. צבעי כדאיות החיידקים שנדונו במאמר זה הם מוצר משלים רגיש ו / או תחליף לטכניקות מיקרוביולוגיה מסורתיות כדי להעריך את הכדאיות של חיידקים בודדים ולספק מידע בדבר שבו חיידקים לשרוד בתא מארחs.

Introduction

יש אינטראקציה דינמית ואבולוציה משותפת בין חיידקים והמארחים שבו הם מתגוררים. חיידקים התפתחו האברונים דבקות, מערכות הפרשה, ו / או את היכולת לייצר רעלים המאפשרים זיהום הפורה של phagocytic המארח ותאים שאינם phagocytic. החיידקים חייבים גם להתמודד עם הכרה ופעילות מיקרוביאלית של מערכת החיסון המארחת. המערכת החיסונית של המארח מורכבת ממרכיבים מולדים ובעלי כושר הסתגלות, כולל מחסומים פיסיקליים וכימיים, תאי מערכת החיסון, מערכת המשלימה, ורכיבים אחרים של חסינות הלחות. בעוד חיידקים רבים רגישים להרג ולאישור על ידי התגובה חיסונית מארח רב שכבתית, כמה חיידקים פתוגניים ואופורטוניסטיים התפתחו מנגנונים להדביק מגוון רחב של תאי מארח ולחתור תחת אישור על ידי התגובה חיסונית מארח ^1. Neisseria gonorrhoeae הוא דוגמא אחת לפתוגן חיידקים כי הוא מותאם מאוד להתמיד במארח האנושי שלה. N. gonorrhoeae קלות colonizes משטחי luminal של תאי האפיתל ברירית של דרכי השתן ואברי המין, לוע, לחמית, ופי טבעת. קולוניזציה מעוררת את גיוס שפע של נויטרופילים באתרים ברירית. הנויטרופילים הם phagocytes המקצועי שיש להם מגוון רחב של תהליכים מיקרוביאלית להרוג מיקרואורגניזמים, עם זאת, נ ' gonorrhoeae הוא מסוגל לשרוד בנוכחות של נויטרופילים ^2-5. הבנה כיצד חיידקים פתוגנים, כגון נ gonorrhoeae לערער, ​​לדכא, ולחטוף את התגובה החיסונית כדי לשרוד סופו של דבר בסביבות מארח בדרך כלל עוינות הוא קריטי לפיתוח של טיפולים חדשים למאבק במחלות זיהומיות.

פרוטוקולי ניסוי משמשים לעתים קרובות כדי לחקור הישרדות חיידקים בתאי מארח כוללים מבחני ספירת מושבה, מבחני הגנת גנטמיצין, ומיקרוסקופ אלקטרונים. במבחני ספירת מושבה, אוכלוסייה של תאים נגועים lysed (למשל, עם חומר ניקוי ל"שich החיידקים עמידים) כדי לשחרר את החיידקים. Lysates הוא בדילול ומצופה על תקשורת מבוססת אגר, ומושבת יוצרי יחידות בlysates ממוספרת עבור כל נקודת זמן ו / או תנאי ניסוי. גישה זו מדווחת על יכולת הקיום של אוכלוסיית החיידקים כולה, אבל הוא לא מסוגל להבדיל בין תאיים והישרדות תאית. וריאציה על assay ספירת מושבה, assay הגנת גנטמיצין, במיוחד מודדת הישרדות חיידקים תאית, המבוסס על חוסר היכולת של גנטמיצין האנטיביוטיקה לחצות את קרום הפלזמה אוקריוטים ^6. עם זאת, assay זה תלוי בחיידקים שרגישים להרג על ידי גנטמיצין (אנטיביוטי או אחר, כי הוא קרום impermeant דומה אוקריוטים) וחוסר היכולת של האנטיביוטיקה כדי לקבל גישה לחיידקים פנימיים. לכן, assay הגנת גנטמיצין לא יכול להיות יעיל לבדיקה של כל מיני החיידקים או כאשר בוחנים את הישרדות חיידקים במאודתאי pinocytic כגון נויטרופילים. אף אחת מהגישות הללו חושף את לוקליזציה subcellular או התנהגות של חיידקים בודדים אחרת (למשל, אם החיידקים ליצור אגרגטים או microcolonies שמתנהג בצורה שונה מתאי חיידקים בודדים). גישה בשימוש תכופה נוספת כדי לבחון את הכדאיות של חיידקים חיצוניים ופנימיים בודדים היא מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים דק סעיף (TEM). גישה זו יש יתרון בכך שהוא יכול לספק מידע לגבי מיקומם של החיידקים בתאי מארח (למשל phagosome, ציטופלסמה, autophagosome), אשר יכול להיחקר יותר על ידי מיקרוסקופ immunoelectron עם נוגדני מצמידים זהב נגד סמני subcellular. עם זאת, במיקרוסקופ אלקטרונים אינו רגיש במיוחד בהערכת כדאיות חיידקים. כאשר חלקים מוטבעים מגואלות אצטט uranyl, ציטראט עופרת, או חומרים כימיים אלקטרונים צפופים אחרים וצלמו על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים, חיידקי אלקטרונים צפופים נחשבים קיימא וelecטרון-Lucent ^7,8 nonviable. עם זאת, הנחה זו מגזים בהערכת כדאיות חיידקים, שכן חיידקים מתים האלה רק עם קרומים ונטולי ציטופלסמה שיבשו קשות מופיעה אלקטרונים לוסנט. בנוסף, חלק ממיני חיידקים עשויים להציג מגוון של צפיפויות אלקטרונים בהתאם לשלב צמיחה שלהם, ולכן קשה לקבוע כדאיות.

כחלופה או בנוסף לשיטות בשימוש נרחבת אלה, כאן אנו מספקים פרוטוקולים ורציונל לשימוש בצבעי ניאון שמצביעים על כדאיות בקטריאלי על מנת להעריך את ההישרדות של חיידקים מצורפים והפנימו על ידי תאי מארח. כדי לזהות חיידקים תאיים, תאים נגועים נחשפים ראשון למגיב ניאון, כגון קטינים או נוגדני חיידק ספציפי. לאחר מכן התאים הנגועים permeabilized ונחשפו לצבעי DNA ספציפי שהם באופן דיפרנציאלי נגישים לחיידקים עם שלם לעומת ממברנות מושפלים, כתחליף ליכולת קיום חיידקים. בעמ 'הראשונהrotocol, SYTO9 הצבע החדיר הקרום מזהה את אוכלוסיית חיידקים בסך הכל, בעוד יודיד propidium נגיש רק לאלה חיידקים שהתפשרו ממברנות ולכן הן נחשבות nonviable. Propidium יודיד וSYTO9 כבר משמשים להערכת כדאיות חיידקים בbiofilms, להפלות פתוגניים מחיידקי nonpathogenic, ולמנות את החיידקים שמקורן במי קיימא ^9-12. בפרוטוקול השני, 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מזהה חיידקי סך הכל, בעוד Sytox הירוק הוא נגיש רק לאוכלוסיית nonviable. ניתן לשלב זוגות צבע כדאיות אלה עם immunofluorescence כדי לקבוע את המיקום של כל חיידק ביחס לחלבון של עניין, למשל להגדרת לוקליזציה subcellular חיידקים. השימוש במבחנים אלה מספק תובנה מפתח לתוך האינטראקציות שתגרומנה להרג או להישרדות חיידקים במהלך ההדבקה של תאי מארח. הפרוטוקולים שתוארו במאמר זה שימשו להערכת הכדאיות שלנ gonorrhoeae המחובר ולבתוך נויטרופילים אנושיים ראשוניים, ובכלל זה באוכלוסיות שונות של phagosomes נויטרופילים ^5,13,14. עם זאת, יכולים להיות מיושמים על פרוטוקולים אלה כדי להעריך את הכדאיות של חיידקי גרם חיוביים וגרמו שליליים בphagocytes המקצועי, phagocytes הלא מקצועי, ופרוטוזואה ^15-24.

Protocol

1. הערכת הכדאיות בקטריאלי עם יודיד Propidium וSYTO9

1. להדביק תאים שאינם חסיד ל12 coverslips זכוכית העגול בקוטר מ"מ ב24 גם צלחות עם חיידקים של עניין. אל תתקנו את התאים עם אלדהידים או ממסים אורגניים.
2. יש לשטוף את תאי פעם אחת בעדינות ב0.1 M 3 - (N-morpholino) חומצת propanesulfonic (מגבים), pH 7.2, המכילה 1 מ"מ MgCl ₂ (מגבים / MgCl _2).
3. דגירה תאים עבור 10 דקות בחושך בטמפרטורת חדר עם נוגדן אלקסה פלואוריד 647 מצמיד או לקטינים אשר נקשר למיני חיידקים של עניין, במגבים / MgCl _2, כדי לזהות חיידקים חיצוניים.

הערה: ניהול שולט עם חיידקי חיים ומתים, בהיעדרם של תאי מארח, כדי להראות כי לקטינים או נוגדנים של עניין מחייבים את כל החיידקים ללא קשר לכדאיות (איור 1).

4. יש לשטוף את תאים פעמיים עם מגבים / MgCl _2.
5. לשאוב מ 'עדיה מהתאים ולהוסיף 0.5 מיליליטר בשידור חי / המלח מכתים פתרון. בשידור חי / המלח מכתים פתרון הוא 5 SYTO9 מיקרומטר, 30 מיקרומטר יודיד propidium, וsaponin 0.1% (ריכוזים סופיים) במגבים / MgCl _2.
6. דגירה תאים עבור 15 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
7. יש לשטוף את תאים פעמיים במגבים / MgCl _2.
8. coverslips מרחב זה עם הפנים כלפי מטה על גבי שקופיות זכוכית ולאטום עם לק השקוף. אל תשתמשו בחומרי הרכבה.
9. לרכוש תמונות בתוך 30 דקות, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מערכות סינון בקנה אחד עם רכישת תמונה ירוקה, אדום, ומרחיק אדומה.

הערה: שני מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי וכן במיקרוסקופ לייזר confocal הסריקה ניתן להשתמש. לאחר 30 דקות צבעי הניאון מתחילים לדלוף מהחיידקים ואת הנתונים שנרכשו כבר לא מדויקים. תמונות מוצגות במאמר זה נרכשו על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזקוף Nikon Eclipse E800 עם מצלמה דיגיטלית האמאמטסו אורקה-ER באמצעות תוכנת OpenLab. הקרינה של אלקסה פלואוריד 647 זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 590-650 ננומטר ומסנן פליטה של ​​663-735 ננומטר, והוא שווא בצבע כחול. הקרינה מן יודיד propidium זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 540-580 ננומטר ומסנן פליטה של ​​600-660 ננומטר. הקרינה מן SYTO9 זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 465-495 ננומטר ומסנן פליטה של ​​515-555 ננומטר.

10. פרוטוקול זה יביא לתמונות שבו חיידקי nonviable חיצוניים מופיעים כחולים + אדומים, חיידקי nonviable פנימיים מופיעים אדום בלבד, חיידקי קיימא חיצוניים מופיעים כחולים + ירוקים, והחיידקים קיימא פנימיים מופיעים ירוקים בלבד. לספור לפי העין את המספרים של חיידקים, כי הם nonviable nonviable קיימא חיצוני, פנימי, חיצוני ובת קיימא, ופנימי.
11. לחשב אחוזים מחיידקי קיימא החיצוניים על ידי חלוקת מספר חיידקי קיימא חיצוניים על ידי המספר הכולל של חיידקים חיצוניים (קיימא תוספת nonviמסוגל). לחשב אחוזים מחיידקי קיימא הפנימיים על ידי חלוקת מספר חיידקי קיימא פנימיים במספר הכולל של חיידקים פנימיים (קיימא תוספת nonviable) (איור 4).
12. ישנם שני פקדים חיוניים לבצע עם פרוטוקול זה. ראשית, לאמת שכל חיידקי nonviable הם יודיד חיובי propidium וכל החיידקים חיים הם SYTO9 חיוביים. תרבות אמצע לוגריתמים של חיידקים (בהעדר כל תאי מארח) צריכה להיות> SYTO9 חיובי 95%. שמוצגת באיור 2 היא תרבות אמצע לוגריתמים של נ ' gonorrhoeae (ב10 ⁸ מושבה להרכיב יחידות למ"ל) הודגרו עם בשידור חי / המלח מכתים פתרון. שנית, לאמת כי שני יודיד propidium וSYTO9 יכולים להיכנס permeabilized תאי מארח נגועים,.
    1. כדי ליצור אוכלוסייה של חיידקים מתים, לאסוף 2 x 10 ⁸ מושבה חיידקים ויוצרת יחידות בצינור microfuge 1.5 מיליליטר, להוסיף isopropanol 70% ולשבת ל10 דקות. גלולה החיידקים בmicrofugend לשטוף את החיידקים פעמים PBS להסיר isopropanol שיורית. לאחר מכן בצע פרוטוקול צעדים 1.5-1.7. הוסף 5 μl של השעיה חיידקים לשקופית זכוכית וכיסוי עם coverslip. דגימות תמונה כמו בשלב פרוטוקול 1.9. בתנאים אלה, של האוכלוסייה 100% צריכים להיות יודיד החיובי propidium (איור 2). בחלק ממיני חיידקים, יודיד propidium לא יכול להכניע לחלוטין מכתים SYTO9, וחיידקים nonviable עשויים להופיע צהובים או כתום.
    2. לתאי phagocytic כמו נויטרופילים, לחשוף את תאי חיידקים נהרג isopropanol ולהבטיח כי של החיידקים תאיים 100% יודיד החיובי propidium (איור 3). לתאים nonphagocytic שלא יכול להפנים חיידקים מתים, זה עשוי להיות מספיק כדי לטפל בתאים נגועים עם אזיד הנתרן או סוכני תא permeant אחרים מיקרוביאלית לפני הוספה בשידור חי / המלח מכתים פתרון.

2. קטריאלי הכדאיות הערכה עם Sytox Green וDAPI

1. חיידקי תווית של עניין עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI בינונית מוגדר של מורס ²⁵ ל20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
2. להדביק תאים שאינם חסיד ל12 coverslips זכוכית העגול בקוטר מ"מ ב24 גם צלחות עם חיידקים שכותרתו DAPI. אל תתקנו את התאים עם אלדהידים או ממסים אורגניים.
3. יש לשטוף את תאי פעם עם מגבים / MgCl _2.
4. דגירה תאים עבור 10 דקות בטמפרטורת חדר בחושך עם נוגדן אלקסה פלואוריד 647 מצמיד או לקטינים אשר נקשר למיני חיידקים של עניין, במגבים / MgCl _2, כדי לזהות חיידקים חיצוניים. ראה הערה בשלב פרוטוקול 1.3 עבור פקדים שהציע.
5. תקשורת לשאוב מהתאים ולהוסיף 0.5 מיליליטר 0.4 מיקרומטר Sytox ירוק במגבים / MgCl _2.
6. דגירה תאים למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
7. יש לשטוף את תאים פעמיים במגבים / MgCl _2.
8. שטוף תאים פעם אחת במגבים / MgCl ₂ למשך 5 דקות.
9. לרכוש תמונות בתוך 30 דקות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ראה שלב פרוטוקול 1.9 לתיאור של מיקרוסקופ, מצלמה דיגיטלית, ורכישת תוכנה.

הערה: הקרינה מAlexa פלואוריד 647 זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 590-650 ננומטר ומסנן פליטה של ​​663-735 ננומטר, והוא שגוי בצבע אדום. הקרינה מן Sytox הירוק זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 465-495 ננומטר ומסנן פליטה של ​​515-555 ננומטר. הקרינה מן DAPI זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 355-375 ננומטר ומסנן מחסום 400 ננומטר.

10. פרוטוקול זה יביא לתמונות שבו חיידקי nonviable חיצוניים יופיעו אדום + ירוק, חיידקי nonviable פנימיים מופיעים ירוקים + כחולים, חיידקי קיימא חיצוניים מופיעים אדום + כחול, והחיידקים קיימא פנימיים מופיעים כחולים בלבד (איור 4). לכמת אחוז מחיידקים החיצוניים ופנימיים כמתואר בפרוטוקול STEp 1.11.
11. הבקרות מתוארות בשלב פרוטוקול 1.12 צריכה להתבצע עם שילוב הצבע DAPI / Sytox הירוק (איורים 2 ו -3).

3. הערכה בקטריאלי ליכולת הקיום לצד לוקליזציה subcellular

1. חיידקי תווית של עניין עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI בינונית מוגדר של המורס ל20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
2. להדביק תאים שאינם חסיד ל12 coverslips זכוכית העגול בקוטר מ"מ ב24 גם צלחות עם חיידקים שכותרתו DAPI. אל תתקנו את התאים עם אלדהידים או ממסים אורגניים.
3. יש לשטוף את תאי פעם עם מגבים / MgCl _2.
4. דגירה 10 דקות בטמפרטורת חדר בחושך עם נוגדן אלקסה פלואוריד 647 מצמיד או לקטינים אשר נקשר למיני חיידקים של עניין, במגבים / MgCl _2, כדי לזהות חיידקים חיצוניים. ראה הערה בשלב פרוטוקול 1.3 עבור פקדים שהציע.
5. תקשורת לשאוב מהתאים ולשטוף תאים שני times במגבים / MgCl _2.
6. דגירה תאים עם נוגדנים נגד סמן subcellular של ריבית ל20 דקות 555 יחד-Alexa פלואוריד, במגבים / MgCl ₂ המכיל saponin 0.2%.
7. יש לשטוף את תאים פעמיים במגבים / MgCl _2.
8. שטוף תאים פעם אחת במגבים / MgCl ₂ למשך 5 דקות.
9. תקשורת לשאוב מהתאים ולהוסיף 0.4 מיקרומטר Sytox ירוק במגבים / MgCl _2.
10. דגירה תאים 5 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
11. יש לשטוף את תאים פעמיים במגבים / MgCl _2.
12. שטוף תאים פעם אחת במגבים / MgCl ₂ למשך 5 דקות.
13. לרכוש תמונות של שקופיות בתוך 30 דקות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ראה שלב פרוטוקול 1.9 לתיאור של מיקרוסקופ, מצלמה דיגיטלית, ורכישת תוכנה.

הערה: הקרינה מAlexa פלואוריד 647 זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 590-650 ננומטר ומסנן פליטה של ​​663-735 ננומטר, והוא שווא בצבע סגול. ו הקרינהrom אלקסה פלואוריד 555 זוהה באמצעות מסנן עם גל עירור של 540-580 ננומטר ומסנן פליטה של ​​600-660 ננומטר. הקרינה מן Sytox הירוק זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 465-495 ננומטר ומסנן פליטה של ​​515-555 ננומטר. הקרינה מן DAPI זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 355-375 ננומטר ומסנן מחסום 400 ננומטר.

14. פרוטוקול זה יביא לתמונות שבו חיידקי nonviable חיצוניים מופיעים סגולים + ירוקים, חיידקי nonviable פנימיים מופיעים ירוקים + כחולים, חיידקי קיימא חיצוניים מופיעים סגולים + כחולים, חיידקי קיימא פנימיים מופיעים כחולים בלבד, וחלבון subcellular מופיע אדום (איור 4). לכמת את perecent של חיידקי קיימא חיצוניים ופנימיים כמתואר בפרוטוקול הצעדים 1.11.
15. הבקרות מתוארות בשלב פרוטוקול 1.12 צריכה להתבצע עם שילוב הצבע DAPI / Sytox הירוק (איורים 2 ו -3).
16. בתוךבנוסף לספירת חיידקי קיימא וnonviable, לסווג כל חיידקים כחיוביים או שלילי לcolocalization עם סמן subcellular של עניין.
17. לחשב אחוזים מחיידקי קיימא colocalized עם סמן subcellular על ידי חלוקת מספר חיידקי קיימא colocalized במספר הכולל של חיידקים ובת קיימא. לחשב אחוזים מחיידקי nonviable colocalized עם סמן subcellular על ידי חלוקת מספר חיידקי colocalized nonviable במספר הכולל של חיידקי nonviable.

תוצאות

הפרוטוקולים שתוארו שימשו כדי לבחון קיומה של נ ' gonorrhoeae לאחר חשיפה לאדם עיקרי נויטרופילים ^5,26. הנויטרופילים היו נגועים בנ gonorrhoeae ומעובד עם פרוטוקול 1, באמצעות SYTO9 צבע כדאיות ירוקת הניאון ויודיד אדום ניאון propidium (איור 4 א). הצבעים נוספו בנוכחות sapo...

Discussion

מוצגים כאן הם שני פרוטוקולים המשתמשים DNA מחייב וצבעי כדאיות בשיתוף עם קטיני ניאון כדי לזהות חיידקים חיים ומתים מצורפים ובתוך תאים אנושיים. מכיוון ששני הפרוטוקולים ביעילות להפלות חיים מחיידקים מתים, הבחירה באיזה פרוטוקול של להשתמש תלויה במטרה הניסוי. הפרוטוקול הראש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection	Becton Dickinson	367251
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml	Becton Dickinson	366480
Sterile water for irrigation	Baxter	07-09-64-070
Dextran 500	Sigma	31392
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S641
Dextrose	Ricca Chemical Company	RDCD0200
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+	Thermo Scientific	SH3002802
Ficoll solution	GE Healthcare	17-1440-03
Acetic Acid	Fisher Scientific	BP2401
12 mm circular glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
24-well plates	Corning Incorporated	3524
Pooled Human Serum	Sigma	S7023
RPMI	Mediatech	15-040-CV
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH3007103
Human interleukin-8	R&D Systems	208-IL/CF
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Propidium Iodide	Life Technologies	L7007 or L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 or L7012
Saponin	Fluka Analytical	47036
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
Mouse anti-CD63	Developmental Studies Hybridoma Bank	H5C6
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit	Life Technologies	A20187
Hemacytometer Bright Line	Hausser Scientific	1492
Forceps	EMS	78320
Sorvall Legend RT + Centrifuge	Thermo Scientific	75004377