Microscopia a fluorescenza metodi per determinare la vitalità di batteri in associazione con cellule di mammifero

Riepilogo

Centrale al campo della patogenesi batterica è la capacità di definire se e come i microbi sopravvivono dopo l'esposizione a cellule eucariotiche. Questo articolo descrive i protocolli per l'uso di coloranti fluorescenti che rivelano la vitalità dei singoli batteri all'interno e associati alle cellule ospiti.

Abstract

Centrale al campo della patogenesi batterica è la capacità di definire se e come i microbi sopravvivono dopo l'esposizione a cellule eucariotiche. Attuali protocolli per affrontare tali questioni comprendono saggi di conteggio delle colonie, saggi di protezione gentamicina e microscopia elettronica. Conteggio delle colonie e di protezione gentamicina saggi valutano solo la vitalità di tutta la popolazione batterica e sono in grado di determinare la vitalità batterica individuale. La microscopia elettronica può essere utilizzata per determinare la fattibilità di singoli batteri e fornire informazioni sulla loro localizzazione in cellule ospiti. Tuttavia, i batteri spesso mostrano una gamma di densità di elettroni, rendendo la valutazione della vitalità difficile. Questo articolo descrive i protocolli per l'uso di coloranti fluorescenti che rivelano la vitalità dei singoli batteri all'interno e associati alle cellule ospiti. Questi test sono stati sviluppati inizialmente per valutare la sopravvivenza di Neisseria gonorrhoeae in neutrofili umani primari, ma dovrebbe essere unApplicabile a qualsiasi interazione cellula batterio-ospite. Questi protocolli si combinano coloranti fluorescenti membrana permeabile (SYTO9 e 4 ',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), che macchia tutti i batteri, con coloranti membrana impermeabile fluorescente (propidio ioduro e Sytox verdi), che sono accessibili solo a batteri non vitali. Prima di permeabilizzazione cellula eucariotica, viene aggiunto un anticorpo o reagente fluorescente per identificare i batteri extracellulari. Così questi saggi discriminano la vitalità dei batteri aderente e all'interno delle cellule eucariotiche. Un protocollo è prevista anche per utilizzare i coloranti redditività in combinazione con anticorpi fluorescenti a marcatori di cellule eucariotiche, al fine di determinare la localizzazione subcellulare di singoli batteri. I coloranti vitalità batterica discussi in questo articolo sono un complemento sensibili e / o alternative alle tecniche di microbiologia tradizionali per valutare la fattibilità dei singoli batteri e fornire informazioni riguardanti dove i batteri sopravvivono nella cellula ospites.

Introduzione

C'è una interazione dinamica e co-evoluzione tra i batteri ei padroni di casa in cui risiedono. I batteri si sono evoluti organelli aderenza, sistemi di secrezione e / o la capacità di produrre tossine che consentono loro infezione produttiva di phagocytic host e le cellule non fagocitarie. I batteri devono anche vedersela con il riconoscimento e l'attività antimicrobica del sistema immunitario dell'ospite. Il sistema immunitario ospite comprende componenti innate e adattative comprese barriere fisiche e chimiche, cellule immunitarie, il sistema del complemento, e altri componenti di immunità umorale. Mentre molti batteri sono suscettibili di abbattimento e passaggio della risposta immunitaria ospitante multistrato, alcuni batteri patogeni e opportunisti sono evoluti meccanismi per infettare una varietà di cellule ospiti e sovvertire passaggio della risposta immunitaria ospitante ^1. Neisseria gonorrhoeae è un esempio di un batterio patogeno che è altamente adattato a persistere nel suo ospite umano. N. gonorrhoeae colonizza facilmente le superfici luminali delle cellule epiteliali della mucosa del tratto urogenitale, faringe, congiuntiva, e del retto. Colonizzazione innesca l'abbondante assunzione di neutrofili nei siti mucosali. I neutrofili sono fagociti professionali che possiedono una varietà di processi antimicrobici per uccidere i microrganismi, tuttavia, N. gonorrhoeae è in grado di sopravvivere in presenza di neutrofili ^2-5. Capire come batteri patogeni come N. gonorrhoeae sovvertire, sopprimere, e dirottare la risposta immunitaria a sopravvivere in ultima analisi, in ambienti host normalmente ostili è cruciale per lo sviluppo di nuove terapie per la lotta contro le malattie infettive.

Protocolli sperimentali usati spesso per studiare la sopravvivenza dei batteri nelle cellule ospiti comprendono saggi di conteggio delle colonie, saggi di protezione gentamicina e microscopia elettronica. In saggi conteggio delle colonie, una popolazione di cellule infette viene lisato (per esempio, con un detergente a which i batteri sono resistenti) per liberare i batteri. I lisati sono diluiti e piastrate su supporti a base di agar, e unità formanti colonie nei lisati vengono enumerate per ciascun punto di tempo e / o condizione sperimentale. Questo approccio riporta la redditività di tutta la popolazione batterica, ma non è in grado di distinguere tra intracellulare ed extracellulare sopravvivenza. Una variazione del dosaggio conteggio delle colonie, il test di protezione gentamicina, misuri specificamente sopravvivenza batterica intracellulare, basato sulla incapacità dei gentamicina antibiotico per attraversare la membrana plasmatica eucariotica ^6. Tuttavia, questo test dipende dai batteri essendo suscettibile di uccisione da gentamicina (o altro antibiotico che è simile eucariotico membrana impermeant) e l'incapacità di antibiotico per avere accesso ai batteri interne. Pertanto, un test di protezione gentamicina può non essere efficace per l'esame di tutte le specie batteriche o nell'esame sopravvivenza batterica altamentecellule pinocytic come neutrofili. Nessuno di questi approcci rivela la localizzazione subcellulare o altri comportamenti di batteri individuali (ad esempio, se i batteri formano aggregati o microcolonie che si comportano diversamente da cellule batteriche individuali). Un altro approccio frequentemente utilizzato per esaminare la fattibilità dei singoli batteri esterni e interni è sottile-sezione di microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Questo approccio è vantaggioso in quanto può fornire informazioni sulla posizione dei batteri in cellule ospiti (es phagosome, citoplasma, dell'autofagosoma), che può essere ulteriormente esaminato al microscopio immunoelettronica con anticorpi oro accoppiata contro marcatori subcellulari. Tuttavia, microscopia elettronica non è particolarmente sensibile a valutare vitalità batterica. Quando le sezioni incorporati vengono colorate con acetato di uranile, citrato di piombo, o altri reagenti elettrone-densi e ripreso al microscopio elettronico, i batteri elettrone-densi sono considerati vitali ed elettronichetron-Lucent non vitali ^7,8. Tuttavia, questa ipotesi sopravvaluta vitalità batterica, dal momento che solo i batteri morti con membrane gravemente perturbati e privo di citoplasma appare elettrone-Lucent. Inoltre, alcune specie batteriche possono visualizzare una gamma di densità di elettroni a seconda della loro fase di crescita, rendendo difficile determinare la vitalità.

In alternativa o in aggiunta a questi metodi ampiamente utilizzati, qui forniamo protocolli e razionale per l'uso di coloranti fluorescenti che indicano vitalità batterica per valutare la sopravvivenza dei batteri attaccati ae internalizzati dalle cellule ospiti. Per identificare i batteri extracellulari, cellule infettate vengono prima esposti a un reagente fluorescente, come una lectina o anticorpo specifici batteri. Le cellule infettate vengono permeabilizzate ed esposti a coloranti specifici di DNA che sono differenzialmente accessibili ai batteri con membrane intatte vs degradati, come surrogato vitalità batterica. Nel primo protocol, la membrana permeabile colorante SYTO9 identifica la popolazione batterica totale, mentre ioduro di propidio è accessibile solo a quei batteri che hanno compromesso le membrane e sono quindi considerate non vitali. Ioduro di propidio e SYTO9 sono stati utilizzati per valutare la vitalità batterica in biofilm, discriminare patogeni dai batteri non patogeni, ed enumerare a base d'acqua batteri vitali ^9-12. Nel secondo protocollo, 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) identifica i batteri totali, mentre Sytox verde è accessibile solo alla popolazione non vitali. Queste coppie vitalità coloranti possono essere combinati con immunofluorescenza per determinare la posizione di ciascun batterio in relazione ad una proteina di interesse, ad esempio per definire localizzazione subcellulare batterica. L'uso di questi test fornisce informazioni chiave nelle interazioni che provocano battericida o sopravvivenza durante l'infezione delle cellule ospiti. I protocolli descritti in questo articolo sono stati usati per valutare la fattibilità diN. gonorrhoeae che è attaccato e dentro neutrofili umani primari, tra cui in diverse popolazioni di phagosomes neutrofili ^5,13,14. Tuttavia, questi protocolli possono essere applicati per valutare la vitalità dei batteri gram-positivi e gram-negativi in fagociti professionali, fagociti non professionali, e protozoi ^15-24.

Protocollo

1. Valutare batterica Viabilità con ioduro di propidio e SYTO9

1. Infettare le cellule che sono aderenti a 12 mm di diametro vetrini circolari in piastre da 24 pozzetti con batteri di interesse. NON fissare le cellule con aldeidi o solventi organici.
2. Lavare le cellule una volta delicatamente in 0.1 M 3 - (N-morfolino) Acido propanosulfonico (MOPS), pH 7.2, contenente 1 mM _MgCl2 (MOPS / MgCl _2).
3. Incubare le cellule per 10 minuti al buio a temperatura ambiente con Alexa Fluor 647 anticorpi accoppiati o lectina che si lega alla specie batteriche di interesse, in MOPS / MgCl _2, per rilevare batteri esterni.

NOTA: effettuare controlli con batteri vivi e morti, in assenza di cellule ospiti, per dimostrare che la lectina o anticorpi di interesse lega tutti i batteri, indipendentemente della redditività (Figura 1).

4. Lavare le cellule due volte con MOPS / MgCl _2.
5. Aspirare mEDIA da cellule e aggiungere 0,5 ml Live / Morto colorazione soluzione. Live / Morto colorazione soluzione è di 5 micron SYTO9, 30 micron ioduro di propidio, e lo 0,1% di saponina (concentrazioni finali) in MOPS / MgCl _2.
6. Incubare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
7. Lavare le cellule due volte in MOPS / MgCl _2.
8. Coprioggetto Inverti faccia in giù su vetrini e sigillare con smalto trasparente. Non utilizzare supporti di montaggio.
9. Acquisire immagini in 30 minuti, utilizzando un microscopio a fluorescenza con set di filtri compatibili con l'acquisizione di immagini verde, rosso e rosso lontano.

NOTA: Sia microscopia a fluorescenza convenzionale e microscopio confocale a scansione laser può essere usato. Dopo 30 minuti i coloranti fluorescenti cominciano a trapelare dai batteri ed i dati acquisiti non sono più accurate. Le immagini mostrate in questo articolo sono stati acquisiti su un microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse E800 verticale con fotocamera digitale Hamamatsu Orca-ER utilizzando il software Openlab. Fluorescenza di Alexa Fluor 647 è stato rilevato usando un filtro di eccitazione lunghezza d'onda di 590-650 nm ed un filtro per le emissioni di 663-735 nm, ed è falso-colore blu. Fluorescenza da ioduro di propidio è stato rilevato usando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 540-580 nm ed un filtro di emissione di 600-660 nm. Fluorescenza da SYTO9 stato rilevato usando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 465-495 nm ed un filtro di emissione di 515-555 nm.

10. Questo protocollo si tradurrà in immagini in cui i batteri non vitali esterne appaiono blu + rosso, i batteri non vitali interni appaiono solo rosso, batteri vitali esterne appaiono blu + verde, e batteri vitali interni appaiono solo verde. Contare occhio il numero di batteri che sono esterni non vitale, non vitale interno, esterno praticabile, e interno redditizio.
11. Calcolare la percentuale di batteri vitali esterni dividendo il numero di batteri vitali esterni per il numero totale di batteri esterni (vitali più nonvigrado). Calcolare la percentuale di batteri vitali interne dividendo il numero di batteri vitali interne per il numero totale di batteri interne (vitali più non vitale) (Figura 4).
12. Ci sono due controlli essenziali per eseguire con questo protocollo. In primo luogo, verificano che tutti i batteri non vitali sono ioduro di propidio-positivi e tutti i batteri vivi sono SYTO9-positivi. Una cultura mid-logaritmica di batteri (in assenza di cellule ospiti) deve essere> 95% SYTO9-positivo. In figura 2 è una cultura medio-logaritmica di N. gonorrhoeae (a 10 ⁸ colonia unità per ml di formatura) incubate con Live / Morto colorazione Solution. In secondo luogo, verificano che sia ioduro di propidio e SYTO9 possono entrare permeabilizzate, cellule ospiti infettate.
    1. Per generare una popolazione di batteri morti, raccogliere 2 x 10 ⁸ unità formanti colonia batterica in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml, aggiungere 70% di isopropanolo e riposare per 10 min. Pellet i batteri in una microcentrifuga unnd lavare i batteri due volte in PBS per rimuovere isopropanolo residuo. Poi seguire il protocollo passaggi 1,5-1,7. Aggiungere 5 ml di sospensione batterica di un vetrino e sovrapporre con un coprioggetto. Campioni della fotografia come in protocollo step 1.9. In queste condizioni, il 100% della popolazione dovrebbe essere propidio ioduro positivo (Figura 2). In alcune specie batteriche, ioduro di propidio non può sopraffare completamente SYTO9 colorazione e batteri non vitali può apparire di colore giallo o arancione.
    2. Per fagociti come neutrofili, esporre le cellule di batteri isopropanolo-uccisi e assicurarsi che il 100% dei batteri intracellulari sono propidio ioduro-positive (figura 3). Per le celle nonphagocytic che non può internalizzare batteri morti, può essere sufficiente per trattare cellule infettate con sodio azide o di altri agenti antimicrobici cellule permeante prima di aggiungere Live / Morto colorazione Solution.

2. Valutare batterica Viabilità con Sytox Green e DAPI

1. Batteri Label di interessi con 10 mcg / ml DAPI a Morse Definito medio ^{di 25} per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
2. Infettare le cellule che sono aderenti a 12 mm di diametro vetrini circolari in piastre da 24 pozzetti con batteri DAPI-etichettati. NON fissare le cellule con aldeidi o solventi organici.
3. Lavare le cellule una volta con MOPS / MgCl _2.
4. Incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente al buio con Alexa Fluor 647 anticorpi accoppiati o lectina che si lega alla specie batteriche di interesse, in MOPS / MgCl _2, per rilevare batteri esterni. Vedi nota nel protocollo step 1.3 per i controlli suggeriti.
5. Aspirare i media dalle cellule e aggiungere 0,5 ml di 0,4 micron Sytox verde in MOPS / MgCl _2.
6. Incubare le cellule per 5 minuti a temperatura ambiente al buio.
7. Lavare le cellule due volte in MOPS / MgCl _2.
8. Lavare le cellule una volta in MOPS / MgCl ₂ per 5 min.
9. Acquisire immagini all'interno di 30 minuti con un microscopio a fluorescenza. Vedere protocollo step 1.9 per la descrizione di microscopio, macchina fotografica digitale e software di acquisizione.

NOTA: Fluorescenza da Alexa Fluor 647 è stato rilevato usando un filtro di eccitazione lunghezza d'onda di 590-650 nm ed un filtro per le emissioni di 663-735 nm, ed è falso-colore rosso. Fluorescenza da Sytox Green è stato rilevato utilizzando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 465-495 nm ed un filtro di emissione di 515-555 nm. Fluorescenza da DAPI è stato rilevato usando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 355-375 nm e filtro barriera 400 nm.

10. Questo protocollo si tradurrà in immagini in cui i batteri non vitali esterne appaiono rosso + verde, i batteri non vitali interni appaiono verde + blu, batteri vitali esterne appaiono di colore rosso + blu e batteri vitali interni appaiono blu solo (Figura 4). Quantificare la percentuale di batteri esterni e interni come descritto nel protocollo step 1.11.
11. I controlli descritti nel protocollo punto 1.12 devono essere eseguite con il colorante combinazione DAPI / Sytox verde (figure 2 e 3).

3. Valutare batterica Viabilità Accanto localizzazione subcellulare

1. Batteri Label di interessi con 10 mcg / ml DAPI in Piano Definito di Morse per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
2. Infettare le cellule che sono aderenti a 12 mm di diametro vetrini circolari in piastre da 24 pozzetti con batteri DAPI-etichettati. NON fissare le cellule con aldeidi o solventi organici.
3. Lavare le cellule una volta con MOPS / MgCl _2.
4. Incubare 10 minuti a temperatura ambiente al buio con Alexa Fluor 647 anticorpi accoppiati o lectina che si lega alla specie batteriche di interesse, in MOPS / MgCl _2, per rilevare batteri esterni. Vedi nota nel protocollo step 1.3 per i controlli suggeriti.
5. Aspirare i media dalle cellule e lavare le cellule due times in MOPS / MgCl _2.
6. Incubare le cellule con Alexa Fluor 555 anticorpi accoppiati contro marcatore subcellulare di interesse per 20 minuti, in MOPS / MgCl ₂ contenente 0,2% saponina.
7. Lavare le cellule due volte in MOPS / MgCl _2.
8. Lavare le cellule una volta in MOPS / MgCl ₂ per 5 min.
9. Aspirare i media dalle cellule e aggiungere 0,4 micron Sytox verde in MOPS / MgCl _2.
10. Incubare le cellule 5 minuti a temperatura ambiente al buio.
11. Lavare le cellule due volte in MOPS / MgCl _2.
12. Lavare le cellule una volta in MOPS / MgCl ₂ per 5 min.
13. Acquisire le immagini di diapositive in 30 min a microscopio a fluorescenza. Vedere protocollo step 1.9 per la descrizione di microscopio, macchina fotografica digitale e software di acquisizione.

NOTA: Fluorescenza da Alexa Fluor 647 è stato rilevato usando un filtro di eccitazione lunghezza d'onda di 590-650 nm e filtro di emissione di 663-735 nm, ed è falso-colore viola. Fluorescenza from Alexa Fluor 555 è stato rilevato usando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 540-580 nm ed un filtro di emissione di 600-660 nm. Fluorescenza da Sytox Green è stato rilevato utilizzando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 465-495 nm ed un filtro di emissione di 515-555 nm. Fluorescenza da DAPI è stato rilevato usando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 355-375 nm e filtro barriera 400 nm.

14. Questo protocollo si tradurrà in immagini in cui i batteri non vitali esterne appaiono viola + verde, i batteri non vitali interni appaiono verde + blu, batteri vitali esterne appaiono viola + blu, batteri vitali interni appaiono blu solo, e proteine ​​subcellulare appare rosso (Figura 4). Quantificare il perecent di batteri vitali interni ed esterni come descritto nel protocollo passaggi 1.11.
15. I controlli descritti nel protocollo punto 1.12 devono essere eseguite con il colorante combinazione DAPI / Sytox verde (figure 2 e 3).
16. InOltre a contare batteri vitali e non vitali, classificare ogni batteri come positivo o negativo per colocalizzazione con il marker subcellulare di interesse.
17. Calcolare la percentuale di batteri vitali colocalized con il marcatore subcellulare dividendo il numero di batteri vitali colocalized per il numero totale di batteri vitali. Calcolare la percentuale di batteri non vitali colocalized con il marcatore subcellulare dividendo il numero di batteri colocalized non vitali per il numero totale di batteri non vitali.

Risultati

I protocolli descritti sono stati usati per esaminare la sopravvivenza di N. gonorrhoeae dopo l'esposizione al primario dell'uomo neutrofili ^5,26. I neutrofili sono stati infettati con N. gonorrhoeae e trattati con protocollo 1, utilizzando la vitalità SYTO9 colorante verde fluorescente e lo ioduro di propidio-rosso fluorescente (Figura 4A). I coloranti sono stati aggiunti in presenza di saponina, che sequestra colesterolo per permeabilize preferenzialmente membrane...

Discussione

Qui presentati sono due protocolli che utilizzano legame al DNA e coloranti vitalità in combinazione con una lectina fluorescente per identificare batteri vivi e morti allegate e dentro le cellule umane. Poiché entrambi i protocolli effettivamente discriminare in diretta da batteri morti, la scelta di quale protocollo da utilizzare dipende l'obiettivo dell'esperimento. Il primo protocollo utilizza ioduro di propidio per rilevare i batteri non vitali e SYTO9 per rilevare i batteri intatti. Mostrato nella

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection	Becton Dickinson	367251
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml	Becton Dickinson	366480
Sterile water for irrigation	Baxter	07-09-64-070
Dextran 500	Sigma	31392
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S641
Dextrose	Ricca Chemical Company	RDCD0200
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+	Thermo Scientific	SH3002802
Ficoll solution	GE Healthcare	17-1440-03
Acetic Acid	Fisher Scientific	BP2401
12 mm circular glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
24-well plates	Corning Incorporated	3524
Pooled Human Serum	Sigma	S7023
RPMI	Mediatech	15-040-CV
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH3007103
Human interleukin-8	R&D Systems	208-IL/CF
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Propidium Iodide	Life Technologies	L7007 or L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 or L7012
Saponin	Fluka Analytical	47036
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
Mouse anti-CD63	Developmental Studies Hybridoma Bank	H5C6
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit	Life Technologies	A20187
Hemacytometer Bright Line	Hausser Scientific	1492
Forceps	EMS	78320
Sorvall Legend RT + Centrifuge	Thermo Scientific	75004377