Fluorescência métodos de microscopia para determinar a viabilidade de bactérias em associação com células de mamíferos

Resumo

Central ao campo da patogénese bacteriana é a capacidade de definir se e como os micróbios sobrevivem após exposição a células eucarióticas. Este artigo descreve protocolos para a utilização de corantes fluorescentes que revelam a viabilidade das bactérias individuais dentro e associados com as células hospedeiras.

Resumo

Central ao campo da patogénese bacteriana é a capacidade de definir se e como os micróbios sobrevivem após exposição a células eucarióticas. Os protocolos atuais para lidar com essas questões incluem ensaios de contagem de colônia, ensaios de proteção gentamicina, e microscopia eletrônica. Contagem de colônias e de proteção gentamicina ensaios apenas avaliar a viabilidade de toda a população bacteriana e são incapazes de determinar a viabilidade bacteriana individual. A microscopia electrónica pode ser usado para determinar a viabilidade das bactérias individuais e fornecer informações sobre a sua localização em células hospedeiras. No entanto, as bactérias freqüentemente exibem uma gama de densidades de elétrons, fazendo com que a avaliação de viabilidade difícil. Este artigo descreve protocolos para a utilização de corantes fluorescentes que revelam a viabilidade das bactérias individuais dentro e associados com as células hospedeiras. Estes ensaios foram desenvolvidos originalmente para avaliar a sobrevivência de Neisseria gonorrhoeae em neutrófilos humanos primários, mas deve ser umAPLICÁVEL a qualquer interação célula bactéria-hospedeiro. Estes protocolos combinar corantes fluorescentes à membrana permeável (SYTO9 e 4 ',6-diamidino-2-fenilindole [DAPI]), o qual mancha todas as bactérias, com corantes fluorescentes de membrana impermeável (iodeto de propídio e SYTOX verde), que só são acessíveis a bactérias não viáveis. Antes de permeabilização de células eucarióticas, de um anticorpo ou reagente fluorescente é adicionada para identificar bactérias extracelulares. Assim, estes ensaios de discriminar a viabilidade das bactérias aderentes e para dentro de células eucarióticas. Um protocolo é também fornecida para a utilização de corantes de viabilidade, em combinação com anticorpos fluorescentes para os marcadores de células eucarióticas, de forma a determinar a localização subcelular de bactérias individuais. Os corantes bacterianas viabilidade mencionados neste artigo são um complemento e / ou alternativa sensível às técnicas tradicionais de microbiologia para avaliar a viabilidade de bactérias individuais e fornecer informações sobre onde as bactérias sobrevivem em célula hospedeiras.

Introdução

Há uma interação dinâmica e co-evolução entre as bactérias e os anfitriões em que residem. As bactérias têm evoluído organelos aderência, sistemas de secreção, e / ou a capacidade de produzir toxinas que permitem a infecção produtiva de fagocítica hospedeiro e as células não fagocíticas. As bactérias também devem lidar com o reconhecimento e actividade antimicrobiana do sistema imune do hospedeiro. O sistema imune do hospedeiro é constituído por componentes inatos e adaptativos incluindo barreiras físicas e químicas, as células do sistema imunológico, o sistema do complemento, e outros componentes da imunidade humoral. Enquanto muitas bactérias são suscetíveis a morte eo afastamento por parte do anfitrião resposta imune de várias camadas, algumas bactérias patogênicas e oportunistas desenvolveram mecanismos para infectar uma variedade de células hospedeiras e subvertem alívio da resposta imune hospedeiro ^1. Neisseria gonorrhoeae é um exemplo de um patógeno bacteriano que está altamente adaptada para persistir no hospedeiro humano. N. gonorrhoeae prontamente coloniza as superfícies luminais de células epiteliais da mucosa do tracto urogenital, da faringe, da conjuntiva, e recto. Colonização desencadeia o recrutamento abundante de neutrófilos nos locais de mucosas. Os neutrófilos são fagócitos profissionais que possuem uma variedade de processos antimicrobianos para matar microrganismos, no entanto, N. gonorrhoeae é capaz de sobreviver na presença de neutrófilos ^2-5. Compreender como bactérias patogênicas, como N. gonorrhoeae subverter, suprimir, e sequestrar a resposta imune para sobreviver em última análise, em ambientes de host normalmente hostis é crucial para o desenvolvimento de novas terapias para o combate a doenças infecciosas.

Protocolos experimentais muitas vezes utilizados para investigar a sobrevivência bacteriana em células hospedeiras incluem ensaios de contagem de colônia, ensaios de proteção gentamicina, e microscopia eletrônica. Em ensaios de contagem de colónia, uma população de células infectadas é lisadas (por exemplo, com um detergente para which as bactérias são resistentes) para libertar as bactérias. Os lisados ​​são diluídas e plaqueadas em meio à base de agar, e as unidades formadoras de colónias nos lisados ​​são enumerados para cada ponto de tempo e / ou condição experimental. Esta abordagem relata a viabilidade de toda a população de bactérias, mas não é capaz de diferenciar entre a sobrevivência intracelular e extracelular. Uma variação no ensaio de contagem de colónia, o ensaio de protecção de gentamicina, mede especificamente a sobrevivência bacteriana intracelular, com base na incapacidade do antibiótico gentamicina para atravessar a membrana plasmática eucariótica ^6. No entanto, este ensaio é dependente das bactérias que são susceptíveis à morte por gentamicina (ou outro antibiótico que é semelhante eucariótica membrana impermeabilizante) e a incapacidade de o antibiótico para ter acesso às bactérias internos. Portanto, um ensaio de proteção gentamicina pode não ser eficaz para o exame de todas as espécies bacterianas ou ao examinar a sobrevivência bacteriana em altacélulas pinocytic tais como neutrófilos. Nenhuma destas abordagens revela a localização subcelular ou outro comportamento de bactérias individuais (por exemplo, se as bactérias formam agregados ou microcolônias que se comportam de forma diferente a partir de células bacterianas individuais). Outra abordagem frequentemente usado para examinar a viabilidade das bactérias externas e internas individuais é de secção fina de microscopia electrónica de transmissão (TEM). Esta abordagem é vantajosa na medida em que pode fornecer informação sobre a localização das bactérias nas células do hospedeiro (por exemplo, fagossoma, citoplasma, autophagosome), que pode continuar a ser investigada por microscopia imunoelectrónica com anticorpos acoplados a ouro contra marcadores subcelulares. No entanto, a microscopia eletrônica não é especialmente sensível a avaliação da viabilidade bacteriana. Quando seções embutidos são corados com acetato de uranila, citrato de chumbo, ou outros reagentes de elétron-densas e fotografada por microscopia eletrônica, as bactérias elétron-densas são considerados viáveis ​​e electron-Lucent inviável ^7,8. No entanto, esta hipótese superestima viabilidade bacteriana, uma vez que apenas as bactérias mortas com membranas severamente interrompidas e desprovido de citoplasma aparecem elétron-Lucent. Além disso, algumas espécies bacterianas podem exibir uma gama de densidades de electrões de acordo com a sua fase de crescimento, o que torna difícil determinar a viabilidade.

Como uma alternativa ou em adição a estes métodos amplamente utilizados, aqui podemos fornecer protocolos e racional para a utilização de corantes fluorescentes que indicam a viabilidade bacteriana para avaliar a sobrevivência de bactérias aderidas para e internalizados pelas células hospedeiras. Para identificar as bactérias extracelulares, as células infectadas são primeiro expostas a um reagente fluorescente, tal como uma lectina ou anticorpo de bactérias específicas. As células infectadas são então permeabilizadas e expostos a corantes específicos de DNA que são diferencialmente acessíveis às bactérias com membranas intactas versus degradados, como um substituto para a viabilidade bacteriana. No primeiro protocolo, a membrana permeável SYTO9 corante identifica a população bacteriana total, enquanto iodeto de propídio é acessível apenas para as bactérias que comprometeram membranas e são, portanto, consideradas inviáveis. Iodeto de propídio e SYTO9 têm sido utilizados para avaliar a viabilidade de bactérias em biofilmes, discriminar patogênica de bactérias não patogênicas, e enumerar bactérias viáveis ​​transmitidas pela água ^9-12. No segundo protocolo, 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) identifica bactérias totais, enquanto SYTOX Verde só é acessível à população inviável. Estes pares de corantes de viabilidade pode ser combinada com a imunofluorescência para determinar a localização de cada bactéria em relação a uma proteína de interesse, por exemplo, para definir a localização subcelular bacteriana. A utilização destes testes proporciona uma visão chave nas interacções que resultam em sobrevivência ou morte bacteriana durante a infecção das células hospedeiras. Os protocolos descritos neste artigo foi utilizado para avaliar a viabilidade deN. gonorrhoeae que é anexado ao e dentro de neutrófilos humanos primários, incluindo em diferentes populações de neutrófilos phagosomes ^5,13,14. No entanto, estes protocolos podem ser aplicados para avaliar a viabilidade das bactérias gram-positivas e gram-negativas em fagócitos profissionais, os fagócitos não profissionais, e protozoários ^15-24.

Protocolo

1. Avaliando bacteriana Viabilidade com iodeto de propídio e SYTO9

1. Infectar as células que estão aderentes a 12 mm de diâmetro lamelas de vidro circulares em placas de 24 poços com as bactérias de interesse. Não corrigir as células com aldeídos ou solventes orgânicos.
2. Lave as células uma vez gentilmente em 0,1 M de 3 - (N-morfolino) propanossulfónico (MOPS), pH 7,2, contendo _MgCl2 1 mM (MOPS / MgCl _2).
3. Incubar as células durante 10 min no escuro à temperatura ambiente com Alexa Fluor 647 anticorpo ou lectina-acoplado que se liga às espécies bacterianas de interesse, em MOPS / MgCl _2, para detectar bactérias externas.

NOTA: Conduta controla com bactérias vivas e mortas, na ausência de células hospedeiras, para mostrar que a lectina ou um anticorpo de interesse liga-se todas as bactérias, independentemente da viabilidade (Figura 1).

4. Lave as células duas vezes com MOPS / MgCl _2.
5. Aspirar mEDIA a partir de células e adicionar 0,5 ml Live / solução de coloração Morto. Solução de coloração vivo / morto é SYTO9 5 uM, 30 uM de iodeto de propídio, e 0,1% de saponina (concentrações finais) em MOPS / MgCl _2.
6. Incubar as células durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
7. Lave as células duas vezes em MOPS / MgCl _2.
8. Lamelas Inverter face para baixo em lâminas de vidro e selar com clara unha polonês. Não use mídia de montagem.
9. Adquirir imagens dentro de 30 minutos, utilizando um microscópio de fluorescência com conjuntos de filtros compatíveis com a aquisição de imagem verde, vermelho e vermelho-extremo.

NOTA: Ambos microscopia de fluorescência convencional e a microscopia confocal a laser pode ser utilizado. Após 30 min os corantes fluorescentes começam a vazar as bactérias e os dados adquiridos não são precisos. As imagens mostradas neste artigo foram adquiridos em uma Nikon Eclipse E800 microscópio de fluorescência na posição vertical com Hamamatsu Orca-ER câmera digital usando o software Openlab. Fluorescência de Alexa Fluor 647 foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 590-650 nm e um filtro de emissão de 663-735 nm, e é falsa de cor azul. A fluorescência a partir de iodeto de propídio foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 540-580 nm e um filtro de emissão de 600-660 nm. A fluorescência a partir de SYTO9 foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 465-495 nm e um filtro de emissão de 515-555 nm.

10. Este protocolo irá resultar em imagens onde as bactérias não viáveis ​​externas aparecem azul + vermelho, as bactérias não viáveis ​​internos aparecem vermelhos só, bactérias viáveis ​​externas aparecem em azul + verde e bactérias viáveis ​​internos aparecem apenas verde. Contagem por olho o número de bactérias que são externos inviável, inviável interna, externa viável, e interna viável.
11. Calcular a percentagem de bactérias viáveis ​​externo, dividindo o número de bactérias viáveis ​​externos ao número total de bactérias externas (mais viável nonvicapaz). Calcular a percentagem de bactérias viáveis ​​internos através da divisão do número de bactérias viáveis ​​internos pelo número total de bactérias internas (mais viável não viável) (Figura 4).
12. Há dois controles essenciais para realizar com este protocolo. Primeiro, validar que todas as bactérias não viáveis ​​são iodeto de propídio-positivas e todas as bactérias vivas são SYTO9 positivo. Uma cultura semi-logarítmico de bactérias (na ausência de quaisquer células hospedeiras) deve ser> 95% SYTO9-positivo. Mostrado na Figura 2 é uma cultura semi-logarítmico de N. gonorrhoeae (a 10 ⁸ colônia unidades por ml formando) incubadas com Live / solução de coloração Morto. Em segundo lugar, validar que tanto o iodeto de propídio e SYTO9 pode entrar permeabilizadas, as células hospedeiras infectadas.
    1. Para gerar uma população de bactérias mortas, recolher 2 x 10 ⁸ unidades formadoras de colónias de bactérias em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 70% de isopropanol e sentar-se durante 10 min. Agregar as bactérias em uma microcentrífuga and lavar as bactérias duas vezes com PBS para remover o isopropanol residual. Em seguida, siga os passos do protocolo 1,5-1,7. Adicionar 5 mL de suspensão bacteriana para uma lâmina de vidro e sobreposição com uma lamela. Amostras de imagem como na protocolo passo 1.9. Sob estas condições, 100% da população deveria ser de iodeto de propídio-positivo (Figura 2). Em algumas espécies bacterianas, iodeto de propídio não pode sobrecarregar completamente coloração SYTO9, e as bactérias não viáveis ​​podem aparecer amarelo ou laranja.
    2. No caso de células fagocíticas como os neutrófilos, expor as células de bactérias mortas por isopropanol e garantir que 100% das bactérias intracelulares são iodeto de propídio-positivo (Figura 3). Para as células que não podem nonphagocytic internalizar as bactérias mortas, pode ser suficiente para o tratamento de células infectadas com azida de sódio ou outras células de permeante agentes antimicrobianos antes da adição da solução de coloração vivo / morto.

2. Avaliando bacteriana Viabilidade com SYTOX Green e DAPI

1. Etiqueta de bactérias de interesse com 10 ug / ml de DAPI, em meio definido de Morse ^{de 25,} durante 20 min à temperatura ambiente no escuro.
2. Infectar as células que estão aderentes a 12 mm de diâmetro lamelas de vidro circulares em placas de 24 poços com bactérias marcadas com DAPI. Não corrigir as células com aldeídos ou solventes orgânicos.
3. Lave as células uma vez com MOPS / MgCl _2.
4. Incubar as células durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro com Alexa Fluor 647 anticorpo ou lectina-acoplado que se liga às espécies bacterianas de interesse, em MOPS / MgCl _2, para detectar bactérias externas. Veja a nota na protocolo passo 1.3 para controles sugeridas.
5. Aspirar a mídia a partir de células e adicionar 0,5 ml de 0,4 mM SYTOX Verde em MOPS / MgCl _2.
6. Incubar as células durante 5 min à temperatura ambiente no escuro.
7. Lave as células duas vezes em MOPS / MgCl _2.
8. Lave as células uma vez em MOPS / MgCl ₂ durante 5 min.
9. Adquirir imagens dentro de 30 min com um microscópio de fluorescência. Veja protocolo passo 1.9 para descrição do microscópio, câmera digital e software de aquisição.

NOTA: Fluorescência de Alexa Fluor 647 foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 590-650 nm e um filtro de emissão de 663-735 nm, e é falsa cor vermelha. A fluorescência a partir de SYTOX Green foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 465-495 nm e um filtro de emissão de 515-555 nm. A fluorescência a partir de DAPI foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 355-375 nm e um filtro barreira de 400 nm.

10. Este protocolo irá resultar em imagens onde as bactérias não viáveis ​​externas aparecem vermelho + verde, as bactérias não viáveis ​​internos aparecem em verde + azul, bactérias viáveis ​​externas aparecem em vermelho + azul, e bactérias viáveis ​​internos aparecem em azul apenas (Figura 4). Quantificar o percentual de bactérias externas e internas, conforme descrito no protocolo step 1,11.
11. Os controlos descritos no protocolo de passo 1,12 deve ser realizada com a combinação de corante de DAPI / SYTOX verde (Figuras 2 e 3).

3. Avaliando bacteriana Viabilidade Junto localização subcelular

1. Etiqueta de bactérias de interesse com 10 ug / ml de DAPI, em meio definido de Morse de 20 min à temperatura ambiente no escuro.
2. Infectar as células que estão aderentes a 12 mm de diâmetro lamelas de vidro circulares em placas de 24 poços com bactérias marcadas com DAPI. Não corrigir as células com aldeídos ou solventes orgânicos.
3. Lave as células uma vez com MOPS / MgCl _2.
4. Incubar 10 minutos à temperatura ambiente no escuro com Alexa Fluor 647 anticorpo ou lectina-acoplado que se liga às espécies bacterianas de interesse, em MOPS / MgCl _2, para detectar bactérias externas. Veja a nota na protocolo passo 1.3 para controles sugeridas.
5. Aspirar a mídia a partir de células e lave as células duas times em MOPS / MgCl _2.
6. Incubar as células com Alexa Fluor 555 anticorpo acoplado contra o marcador subcelular de interesse, durante 20 min, em MOPS / _MgCl2 contendo 0,2% de saponina.
7. Lave as células duas vezes em MOPS / MgCl _2.
8. Lave as células uma vez em MOPS / MgCl ₂ durante 5 min.
9. Aspirar a mídia a partir de células e adicionar 0,4 mM SYTOX Verde em MOPS / MgCl _2.
10. Incubar as células 5 minutos à temperatura ambiente no escuro.
11. Lave as células duas vezes em MOPS / MgCl _2.
12. Lave as células uma vez em MOPS / MgCl ₂ durante 5 min.
13. Adquirir imagens de lâminas dentro de 30 min em microscópio de fluorescência. Veja protocolo passo 1.9 para descrição do microscópio, câmera digital e software de aquisição.

NOTA: Fluorescência de Alexa Fluor 647 foi detectado por um filtro com comprimento de onda de excitação de 590-650 nm e filtro de emissão de 663-735 nm, e é falsa cor roxa. Fluorescência from Alexa Fluor 555 foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 540-580 nm e um filtro de emissão de 600-660 nm. A fluorescência a partir de SYTOX Green foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 465-495 nm e um filtro de emissão de 515-555 nm. A fluorescência a partir de DAPI foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 355-375 nm e um filtro barreira de 400 nm.

14. Este protocolo irá resultar em imagens onde as bactérias não viáveis ​​externas aparecem roxo + verde, as bactérias não viáveis ​​internos aparecem em verde + azul, bactérias viáveis ​​externas aparecem roxo + azul, bactérias viáveis ​​internos aparecem em azul só, e proteína subcelular aparece em vermelho (Figura 4). Quantificar a perecent de bactérias viáveis ​​externos e internos como descrito no protocolo de passos de 1,11.
15. Os controlos descritos no protocolo de passo 1,12 deve ser realizada com a combinação de corante de DAPI / SYTOX verde (Figuras 2 e 3).
16. EmAlém de contagem de bactérias viáveis ​​e não viáveis, classificar cada bactéria como positivo ou negativo para a co-localização com o marcador subcelular de interesse.
17. Calcular a percentagem de bactérias viáveis ​​com o marcador colocalized subcelular, dividindo o número de bactérias viáveis ​​colocalized pelo número total de bactérias viáveis. Calcular a percentagem de bactérias não viáveis ​​colocalized com o marcador subcelular pela divisão do número de bactérias colocalized não viáveis ​​por o número total de bactérias não viáveis.

Resultados

Os protocolos descritos foram usados ​​para examinar a sobrevivência de N. gonorrhoeae após a exposição ao humano primário neutrófilos ^5,26. Os neutrófilos foram infectados com N. gonorrhoeae e processados ​​com o protocolo 1, utilizando o corante de viabilidade SYTO9 verde-fluorescente e o iodeto de propídio vermelho fluorescente (Figura 4A). Os corantes foram adicionados, na presença de saponina, que sequestra o colesterol para permeabilizar preferencialme...

Discussão

Apresentamos aqui dois protocolos que usam ligação ao DNA e corantes de viabilidade em conjunto com uma lectina fluorescente para identificar bactérias vivas e mortas anexados a e no interior das células humanas. Como ambos os protocolos efetivamente discriminar ao vivo a partir de bactérias mortas, a escolha de qual protocolo usar depende do objetivo do experimento. O primeiro protocolo utiliza iodeto de propídio para detectar bactérias não viáveis ​​e SYTO9 para detectar bactérias intactas. Mostrado na <...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection	Becton Dickinson	367251
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml	Becton Dickinson	366480
Sterile water for irrigation	Baxter	07-09-64-070
Dextran 500	Sigma	31392
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S641
Dextrose	Ricca Chemical Company	RDCD0200
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+	Thermo Scientific	SH3002802
Ficoll solution	GE Healthcare	17-1440-03
Acetic Acid	Fisher Scientific	BP2401
12 mm circular glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
24-well plates	Corning Incorporated	3524
Pooled Human Serum	Sigma	S7023
RPMI	Mediatech	15-040-CV
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH3007103
Human interleukin-8	R&D Systems	208-IL/CF
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Propidium Iodide	Life Technologies	L7007 or L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 or L7012
Saponin	Fluka Analytical	47036
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
Mouse anti-CD63	Developmental Studies Hybridoma Bank	H5C6
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit	Life Technologies	A20187
Hemacytometer Bright Line	Hausser Scientific	1492
Forceps	EMS	78320
Sorvall Legend RT + Centrifuge	Thermo Scientific	75004377