Fluorescencia métodos de microscopía para determinar la viabilidad de las bacterias en asociación con las células de mamíferos

Resumen

Central para el campo de la patogénesis bacteriana es la capacidad de definir si y cómo los microbios sobreviven después de la exposición a las células eucariotas. Este artículo describe protocolos para el uso de colorantes fluorescentes que revelan la viabilidad de las bacterias individuales dentro y asociados con las células huésped.

Resumen

Central para el campo de la patogénesis bacteriana es la capacidad de definir si y cómo los microbios sobreviven después de la exposición a las células eucariotas. Los protocolos actuales para hacer frente a estas preguntas incluyen ensayos de recuento de colonias, ensayos de protección de la gentamicina y la microscopía electrónica. Ensayos de recuento de colonias y de protección de gentamicina sólo evaluar la viabilidad de toda la población bacteriana y son incapaces de determinar la viabilidad bacteriana individuo. La microscopía electrónica se puede utilizar para determinar la viabilidad de las bacterias individuales y proporcionar información sobre su localización en células huésped. Sin embargo, las bacterias a menudo muestran una gama de densidades de electrones, lo que hace difícil la evaluación de la viabilidad. Este artículo describe protocolos para el uso de colorantes fluorescentes que revelan la viabilidad de las bacterias individuales dentro y asociados con las células huésped. Estos ensayos fueron desarrollados originalmente para evaluar la supervivencia de Neisseria gonorrhoeae en los neutrófilos humanos primarios, pero deben ser unpplicable a cualquier interacción de las células bacteria-huésped. Estos protocolos se combinan colorantes fluorescentes de membrana permeable (SYTO9 y 4 ',6-diamino-2-fenilindol [DAPI]), que se tiñen todas las bacterias, con colorantes fluorescentes de membrana impermeable (yoduro de propidio y SYTOX Green), que sólo son accesibles a los bacterias no viables. Antes de la permeabilización de células eucariotas, se añade un anticuerpo o reactivo fluorescente para identificar las bacterias extracelulares. Por lo tanto estos ensayos discriminan la viabilidad de las bacterias adherentes a y dentro de las células eucariotas. También se proporciona un protocolo para el uso de los colorantes de viabilidad en combinación con anticuerpos fluorescentes a los marcadores de células eucarióticas, con el fin de determinar la localización subcelular de las bacterias individuales. Los colorantes de viabilidad bacterianas se tratan en este artículo son un complemento y / o alternativa sensible a las técnicas tradicionales de microbiología para evaluar la viabilidad de las bacterias individuales y proporcionar información con respecto a que las bacterias sobreviven en la célula huéspeds.

Introducción

Hay una interacción dinámica y co-evolución entre las bacterias y los anfitriones en los que residen. Las bacterias han evolucionado orgánulos de adherencia, sistemas de secreción, y / o la capacidad de producir toxinas que permiten su infección productiva de fagocítica huésped y células no fagocíticas. Las bacterias también deben enfrentarse con el reconocimiento y la actividad antimicrobiana del sistema inmune del huésped. El sistema inmune del huésped se compone de componentes innatos y adaptativos, incluyendo barreras físicas y químicas, las células inmunes, el sistema del complemento, y otros componentes de la inmunidad humoral. Mientras que muchas bacterias son susceptibles a la muerte y despeje de la respuesta inmune del huésped de varias capas, algunas bacterias patógenas y oportunistas han desarrollado mecanismos para infectar una variedad de células huésped y subvertir despeje de la respuesta inmune del huésped ^1. Neisseria gonorrhoeae es un ejemplo de un patógeno bacteriano que está altamente adaptado para persistir en su huésped humano. N. gonorrhoeae coloniza fácilmente las superficies luminales de las células epiteliales de la mucosa del tracto urogenital, la faringe, la conjuntiva, y el recto. Colonización desencadena la abundante reclutamiento de neutrófilos en las mucosas. Los neutrófilos son fagocitos profesionales que poseen una variedad de procesos antimicrobianos para matar los microorganismos, sin embargo, N. gonorrhoeae es capaz de sobrevivir en la presencia de neutrófilos ^2-5. Entender cómo los patógenos bacterianos como N. gonorrhoeae subvertir, suprimir, y secuestrar la respuesta inmune a sobrevivir en última instancia, en entornos host normalmente hostiles es crucial para el desarrollo de nuevas terapias para combatir las enfermedades infecciosas.

Los protocolos experimentales a menudo utilizados para investigar la supervivencia bacteriana en las células huésped incluyen ensayos de recuento de colonias, ensayos de protección de gentamicina, y microscopía electrónica. En los ensayos de recuento de colonias, una población de células infectadas se lisa (por ejemplo, con un detergente para quich las bacterias son resistentes) para liberar las bacterias. Los lisados ​​se diluyeron y se extendieron en placas sobre medios con agar, y las unidades formadoras de colonias en los lisados ​​se enumeran para cada punto de tiempo y / o condición experimental. Este enfoque informa de la viabilidad de toda la población bacteriana, pero no es capaz de diferenciar entre intracelular y extracelular de supervivencia. Una variación en el ensayo de recuento de colonias, el ensayo de protección de gentamicina, mide específicamente la supervivencia bacteriana intracelular, basado en la incapacidad de los antibióticos gentamicina para cruzar la membrana plasmática eucariota ^6. Sin embargo, este ensayo depende de las bacterias que son susceptibles a la muerte por la gentamicina (u otro antibiótico que es similar eucariota membrana impermeable a) y la incapacidad del antibiótico para tener acceso a las bacterias internos. Por lo tanto, un ensayo de protección de la gentamicina puede no ser eficaz para el examen de todas las especies bacterianas o al examinar la supervivencia bacteriana en altamentecélulas de pinocitosis, tales como los neutrófilos. Ninguno de estos enfoques revela la localización subcelular u otro comportamiento de las bacterias individuales (por ejemplo, si las bacterias forman agregados o microcolonias que se comportan de manera diferente a partir de células bacterianas individuales). Otro enfoque utilizado con frecuencia para examinar la viabilidad de las bacterias externas e internas individuales es-sección delgada microscopía electrónica de transmisión (TEM). Este enfoque es ventajoso porque puede proporcionar información acerca de la ubicación de las bacterias en las células huésped (por ejemplo fagosoma, citoplasma, autofagosoma), que se puede investigarse más a fondo mediante microscopía inmunoelectrónica con anticuerpos de oro acoplado contra marcadores subcelulares. Sin embargo, la microscopía de electrones no es especialmente sensible a la evaluación de la viabilidad bacteriana. Cuando las secciones embebidas son teñidas con acetato de uranilo, citrato de plomo, u otros reactivos densos en electrones y imágenes de microscopía de electrones, las bacterias electrón-densos se consideran viables y electrónicostron-lucent inviable ^7,8. Sin embargo, esta hipótesis sobrevalora la viabilidad bacteriana, ya que sólo las bacterias muertas con membranas gravemente perturbado y desprovistos de citoplasma aparece electrón-Lucent. Además, algunas especies bacterianas pueden mostrar una gama de densidades de electrones, dependiendo de su etapa de crecimiento, lo que hace difícil determinar la viabilidad.

Como una alternativa o además de estos métodos ampliamente utilizados, aquí proporcionamos protocolos y fundamento para el uso de colorantes fluorescentes que indican la viabilidad bacteriana para evaluar la supervivencia de las bacterias unidas a y internalizados por las células huésped. Para identificar bacterias extracelulares, las células infectadas se primera expuestos a un reactivo fluorescente, tal como una lectina o anticuerpo de bacterias específicas. Las células infectadas se permeabilizaron y luego expuestos a colorantes específicos de ADN que son diferencialmente accesible a las bacterias con intacta vs membranas degradadas, como un sustituto para la viabilidad bacteriana. En la primera protocol, la membrana permeable SYTO9 tintura identifica la población bacteriana total, mientras que el yoduro de propidio sólo se puede acceder a esas bacterias que han puesto en peligro las membranas y por lo tanto se considera no viable. Yoduro de propidio y SYTO9 se han utilizado para evaluar la viabilidad bacteriana en las biopelículas, discriminar patógena de bacterias no patógenas, y enumerar bacterias transmitidas por el agua viables ^9-12. En el segundo protocolo, 4 ', 6' diamidino-2-fenilindol (DAPI) identifica bacterias totales, mientras SYTOX verde es sólo accesible a la población no viable. Estos pares de colorantes de viabilidad se pueden combinar con inmunofluorescencia para determinar la ubicación de cada bacteria en relación con una proteína de interés, por ejemplo, para definir la localización subcelular bacteriana. El uso de estos ensayos proporciona una visión clave en las interacciones que resultan en la destrucción bacteriana o la supervivencia durante la infección de las células huésped. Los protocolos descritos en este artículo se utilizaron para evaluar la viabilidad deN. gonorrhoeae que se une a y dentro de los neutrófilos humanos primarios, incluyendo en diferentes poblaciones de fagosomas de neutrófilos ^5,13,14. Sin embargo, estos protocolos pueden ser aplicados para evaluar la viabilidad de las bacterias Gram-positivas y gram-negativas en fagocitos profesionales, los fagocitos no profesionales, y protozoos ^15-24.

Protocolo

1. La evaluación de viabilidad bacteriana con yoduro de propidio y SYTO9

1. Infectar las células que son adherentes a 12 mm de diámetro cubreobjetos de vidrio circulares en placas de 24 pocillos con bacterias de interés. NO fijar las células con aldehídos o disolventes orgánicos.
2. Enjuagar las células una vez suavemente en 0,1 M de 3 - (N-morfolino) propanosulfónico (MOPS), pH 7,2, que contiene 1 mM de MgCl ₂ (MOPS / MgCl _2).
3. Se incuban las células durante 10 min en la oscuridad a temperatura ambiente con Alexa Fluor 647 anticuerpo acoplado o lectina que se une a las especies bacterianas de interés, en MOPS / MgCl _2, para detectar bacterias externas.

NOTA: Conducta controla con bacterias vivas y muertas, en ausencia de las células huésped, para mostrar que la lectina o anticuerpo de interés se une a todas las bacterias, independientemente de la viabilidad (Figura 1).

4. Enjuague las células dos veces con MOPS / MgCl _2.
5. Aspirar media de las células y añadir 0,5 ml Live / Dead solución de tinción. Live / Dead solución de tinción es SYTO9 5 mM, 30 mM de yoduro de propidio, y 0,1% de saponina (concentraciones finales) en MOPS / MgCl _2.
6. Se incuban las células durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
7. Enjuagar las células dos veces en MOPS / MgCl _2.
8. Cubreobjetos Invertir boca abajo en portaobjetos de vidrio y sellan con esmalte de uñas transparente. No utilice soportes de montaje.
9. Adquirir imágenes dentro de 30 minutos, utilizando un microscopio de fluorescencia con filtros de conjuntos compatibles con la adquisición de imágenes verde, rojo y rojo lejano.

NOTA: Tanto la microscopía de fluorescencia convencional y microscopía confocal de barrido láser puede ser utilizado. Después de 30 min los colorantes fluorescentes comienzan a gotear de las bacterias y los datos adquiridos ya no son exactos. Las imágenes mostradas en este artículo se adquirieron en un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse E800 vertical con cámara digital Hamamatsu Orca-ER usando software Openlab. La fluorescencia de Alexa Fluor 647 se detectó usando un filtro con longitud de onda de excitación de 590 a 650 nm y un filtro de emisión de 663 a 735 nm, y es de color azul falsa. La fluorescencia a partir de yoduro de propidio se detectó utilizando un filtro con longitud de onda de excitación de 540 a 580 nm y un filtro de emisión de 600 a 660 nm. Fluorescencia de SYTO9 se detectó utilizando un filtro con longitud de onda de excitación de 465 a 495 nm y un filtro de emisión de 515 a 555 nm.

10. Este protocolo se traducirá en imágenes en las que las bacterias no viables externos aparecen azul + rojo, las bacterias no viables internos aparezcan rojos solamente, bacterias viables externos aparecen en azul + verde, y las bacterias viables internas aparecen verdes solamente. Cuente a ojo el número de bacterias que son viables, no viables interna, viable, y la interior viable externa externa.
11. Se calcula el porcentaje de bacterias viables externos dividiendo el número de bacterias viables externos por el número total de bacterias externas (viables más nonvipoder). Se calcula el porcentaje de bacterias viables internos dividiendo el número de bacterias viables internos por el número total de bacterias internas (más viable no viable) (Figura 4).
12. Hay dos controles esenciales para llevar a cabo con este protocolo. En primer lugar, confirman que todas las bacterias no viables son el yoduro de propidio y positivas todas las bacterias vivas son SYTO9-positivo. Una cultura semilogarítmica de bacterias (en ausencia de cualquier célula huésped) debe ser> 95% SYTO9-positivo. Se muestra en la Figura 2 es una cultura semilogarítmica de N. gonorrhoeae (al 10 ⁸ unidades formadoras de colonias por ml de formación) se incubaron con vivo Muerto Solución / tinción. En segundo lugar, validar que tanto el yoduro de propidio y SYTO9 pueden entrar permeabilizadas, células huésped infectadas.
    1. Para generar una población de bacterias muertas, recoger 2 x 10 ⁸ colonia bacteriana unidades en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que forma, añadir 70% de isopropanol y sentarse durante 10 min. Sedimentar las bacterias en una microcentrífuga unND lavar las bacterias dos veces en PBS para eliminar el isopropanol residual. A continuación, siga los pasos del protocolo de 01.05 a 01.07. Añadir 5 l de suspensión bacteriana a un portaobjetos de vidrio y las cubrirás con un cubreobjetos. Muestras de la imagen como en el paso de protocolo 1.9. En estas condiciones, 100% de la población debería ser de yoduro de propidio-positivo (Figura 2). En algunas especies bacterianas, yoduro de propidio no puede abrumar completamente tinción SYTO9, y las bacterias no viables puede aparecer de color amarillo o naranja.
    2. Para las células fagocíticas, como los neutrófilos, exponer las células a las bacterias isopropanol-muertos y asegurar que el 100% de las bacterias intracelulares son yoduro de propidio-positivo (Figura 3). Para las células nonphagocytic que puede que no internalizar bacterias muertas, puede ser suficiente para tratar células infectadas con azida de sodio o de otros agentes antimicrobianos de células antes de la adición de permeante en vivo / muerto solución de tinción.

2. La evaluación de viabilidad bacteriana con SYTOX Green y DAPI

1. Bacterias de la etiqueta de interés con 10 mg / ml DAPI en Morse Definido Media ²⁵ durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
2. Infectar las células que son adherentes a 12 mm de diámetro cubreobjetos de vidrio circulares en placas de 24 pocillos con bacterias marcadas con DAPI. NO fijar las células con aldehídos o disolventes orgánicos.
3. Enjuague las células una vez con MOPS / MgCl _2.
4. Se incuban las células durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad con Alexa Fluor 647 anticuerpo acoplado o lectina que se une a las especies bacterianas de interés, en MOPS / MgCl _2, para detectar bacterias externas. Vea la nota en el paso de protocolo 1.3 para los controles sugeridos.
5. Aspirar los medios de las células y añadir 0,5 ml 0,4 M SYTOX verde en MOPS / MgCl _2.
6. Se incuban las células durante 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
7. Enjuagar las células dos veces en MOPS / MgCl _2.
8. Lavar las células una vez en MOPS / MgCl ₂ durante 5 min.
9. Adquirir imágenes dentro de 30 min con un microscopio de fluorescencia. Consulte el paso del protocolo 1.9 para la descripción de microscopio, cámara digital y software de adquisición.

NOTA: fluorescencia de Alexa Fluor 647 se detectó usando un filtro con longitud de onda de excitación de 590 a 650 nm y un filtro de emisión de 663 a 735 nm, y es de color rojo falsa. Fluorescencia de SYTOX Verde se detectó utilizando un filtro con longitud de onda de excitación de 465 a 495 nm y un filtro de emisión de 515 a 555 nm. Fluorescencia de DAPI se detectó utilizando un filtro con longitud de onda de excitación de 355 a 375 nm y filtro de barrera de 400 nm.

10. Este protocolo se traducirá en imágenes en las que las bacterias no viables externos aparecen de color rojo + verde, las bacterias no viables internos parecen verde + azul, bacterias viables externos aparecen de color rojo + azul, y las bacterias viables internas aparecen en azul solamente (Figura 4). Cuantificar el porcentaje de bacterias externas e internas como se describe en Ste protocolop 1.11.
11. Los controles descritos en el paso protocolo de 1,12 se deben realizar con la combinación de tinte DAPI / SYTOX Verde (Figuras 2 y 3).

3. La evaluación de viabilidad bacteriana Junto localización subcelular

1. Bacterias de la etiqueta de interés con 10 mg / ml DAPI en medio definido de Morse durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
2. Infectar las células que son adherentes a 12 mm de diámetro cubreobjetos de vidrio circulares en placas de 24 pocillos con bacterias marcadas con DAPI. NO fijar las células con aldehídos o disolventes orgánicos.
3. Enjuague las células una vez con MOPS / MgCl _2.
4. Incubar 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad con Alexa Fluor 647 anticuerpo acoplado o lectina que se une a las especies bacterianas de interés, en MOPS / MgCl _2, para detectar bacterias externas. Vea la nota en el paso de protocolo 1.3 para los controles sugeridos.
5. Aspirar los medios de las células y enjuagar las células dos times en MOPS / MgCl _2.
6. Se incuban las células con Alexa Fluor 555 anticuerpo acoplado contra el marcador subcelular de interés durante 20 min, en MOPS / MgCl ₂ que contiene 0,2% de saponina.
7. Enjuagar las células dos veces en MOPS / MgCl _2.
8. Lavar las células una vez en MOPS / MgCl ₂ durante 5 min.
9. Aspirar los medios de las células y añadir 0,4 M SYTOX verde en MOPS / MgCl _2.
10. Se incuban las células 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
11. Enjuagar las células dos veces en MOPS / MgCl _2.
12. Lavar las células una vez en MOPS / MgCl ₂ durante 5 min.
13. Adquirir imágenes de diapositivas en 30 minutos en el microscopio de fluorescencia. Consulte el paso del protocolo 1.9 para la descripción de microscopio, cámara digital y software de adquisición.

NOTA: La fluorescencia de Alexa Fluor 647 se detectó utilizando un filtro con la excitación de longitud de onda de 590 a 650 nm y filtro de emisión de 663 a 735 nm, y es de color púrpura falsa. Fluorescencia fROM Alexa Fluor 555 se detectó usando un filtro con longitud de onda de excitación de 540 a 580 nm y un filtro de emisión de 600 a 660 nm. Fluorescencia de SYTOX Verde se detectó utilizando un filtro con longitud de onda de excitación de 465 a 495 nm y un filtro de emisión de 515 a 555 nm. Fluorescencia de DAPI se detectó utilizando un filtro con longitud de onda de excitación de 355 a 375 nm y filtro de barrera de 400 nm.

14. Este protocolo se traducirá en imágenes en las que las bacterias no viables externos aparecen púrpura + verde, las bacterias no viables internos parecen verde + azul, bacterias viables externos aparecen púrpura + azul, bacterias viables internas aparecen en azul solamente, y subcelular de proteínas se ve rojo (Figura 4). Cuantificar el perecent de bacterias viables externos e internos, como se describe en el protocolo de los pasos 1.11.
15. Los controles descritos en el paso protocolo de 1,12 se deben realizar con la combinación de tinte DAPI / SYTOX Verde (Figuras 2 y 3).
16. EnAdemás de contar las bacterias viables y no viables, clasificar cada bacteria, ya sea positivo o negativo para colocalización con el marcador subcelular de interés.
17. Se calcula el porcentaje de bacterias viables colocalized con el marcador subcelular dividiendo el número de bacterias viables colocalized por el número total de bacterias viables. Calcular el porcentaje de bacterias no viables colocalized con el marcador subcelular dividiendo el número de bacterias no viables colocalized por el número total de bacterias no viables.

Resultados

Los protocolos descritos se utilizaron para examinar la supervivencia de N. gonorrhoeae después de la exposición a la enseñanza primaria humanos neutrófilos ^5,26. Los neutrófilos fueron infectadas con N. gonorrhoeae y procesados ​​con el protocolo 1, utilizando el colorante de viabilidad SYTO9-verde fluorescente y el yoduro de propidio rojo fluorescente (Figura 4 A). Los colorantes se añadieron en la presencia de saponina, que secuestra el colesterol para permeabil...

Discusión

Aquí se presentan dos protocolos que utilizan tintes de unión a ADN y de viabilidad en relación con una lectina fluorescente para identificar bacterias vivas y muertas unidos a y dentro de las células humanas. Dado que ambos protocolos discriminan efectivamente en vivo a partir de bacterias muertas, la elección de qué protocolo utilizar depende del objetivo del experimento. El primer protocolo utiliza yoduro de propidio para detectar bacterias no viables y SYTO9 para detectar bacterias intactas. Se muestra en

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection	Becton Dickinson	367251
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml	Becton Dickinson	366480
Sterile water for irrigation	Baxter	07-09-64-070
Dextran 500	Sigma	31392
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S641
Dextrose	Ricca Chemical Company	RDCD0200
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+	Thermo Scientific	SH3002802
Ficoll solution	GE Healthcare	17-1440-03
Acetic Acid	Fisher Scientific	BP2401
12 mm circular glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
24-well plates	Corning Incorporated	3524
Pooled Human Serum	Sigma	S7023
RPMI	Mediatech	15-040-CV
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH3007103
Human interleukin-8	R&D Systems	208-IL/CF
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Propidium Iodide	Life Technologies	L7007 or L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 or L7012
Saponin	Fluka Analytical	47036
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
Mouse anti-CD63	Developmental Studies Hybridoma Bank	H5C6
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit	Life Technologies	A20187
Hemacytometer Bright Line	Hausser Scientific	1492
Forceps	EMS	78320
Sorvall Legend RT + Centrifuge	Thermo Scientific	75004377