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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Zentral auf das Gebiet der bakteriellen Pathogenese ist die Möglichkeit, festzulegen, ob und wie Mikroben nach Einwirkung von eukaryotischen Zellen überleben. Dieser Artikel beschreibt Protokolle für den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Inneren und mit Wirtszellen assoziiert offenbaren.

Zusammenfassung

Zentral auf das Gebiet der bakteriellen Pathogenese ist die Möglichkeit, festzulegen, ob und wie Mikroben nach Einwirkung von eukaryotischen Zellen überleben. Aktuelle Protokolle, um diese Fragen zu beantworten sind Koloniezahl-Assays, Gentamicin-Schutztests und Elektronenmikroskopie. Koloniezahl und Gentamicin-Schutztests beurteilen nur die Lebensfähigkeit der gesamten Bakterienpopulation und sind nicht in der Lage, einzelne Lebensfähigkeit der Bakterien zu bestimmen. Elektronenmikroskopie verwendet werden, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu bestimmen und einzelne Informationen hinsichtlich ihrer Lokalisation in Wirtszellen. Allerdings Bakterien zeigen oft eine Reihe von Elektronendichten, was eine Bewertung der Rentabilität schwierig. Dieser Artikel beschreibt Protokolle für den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Inneren und mit Wirtszellen assoziiert offenbaren. Diese Tests wurden ursprünglich entwickelt, um das Überleben von Neisseria gonorrhoeae in primären humanen neutrophilen Granulozyten zu bewerten, sondern sollte einpplicable einem Bakterium-Wirt-Interaktion. Diese Protokolle kombinieren membranpermeablen Fluoreszenzfarbstoffen (SYTO9 und 4 ',6-Diamino-2-phenylindol [DAPI]), die alle Bakterien färben, mit Membran-undurchlässig Fluoreszenzfarbstoffen (Propidiumiodid und SYTOX Grüne), die nur zugänglich sind nicht lebensfähige Bakterien. Vor der eukaryotischen Zelle Permeabilisierung wird ein Antikörper oder fluoreszierenden Reagens zugegeben, um extrazelluläre Bakterien zu identifizieren. So sind diese Tests unterscheiden die Lebensfähigkeit der Bakterien an und innen eukaryotischen Zellen haften. Ein Protokoll wird auch für die Verwendung der Lebensfähigkeit Farbstoffe in Kombination mit fluoreszierenden Antikörpern gegen eukaryotische Zellmarker, um die subzelluläre Lokalisierung von einzelnen Bakterien zu bestimmen. Die in diesem Artikel behandelt bakterielle Lebensfähigkeit Farbstoffe sind eine sensible Ergänzung und / oder Alternative zu traditionellen Mikrobiologie Techniken, um die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien zu bewerten und Informationen, wo Bakterien in Wirtszelle überlebens.

Einleitung

Es ist eine dynamische Interaktion und Ko-Evolution zwischen Bakterien und den Gastgebern in dem sie wohnen. Bakterien haben die Einhaltung Organellen, die Sekretion Systeme und / oder die Fähigkeit, Giftstoffe, die ihre produktiven Infektion von Wirts phagocytic und nicht-Fresszellen aktivieren produzieren entwickelt. Die Bakterien müssen auch Erkennung und antimikrobiellen Aktivitäten von dem Immunsystem des Wirts zu kämpfen. Das Immunsystem des Wirts wird der angeborenen und erworbenen Komponenten einschließlich der physikalischen und chemischen Barrieren, Immunzellen, die das Komplementsystem und andere Komponenten, der humoralen Immunität besteht. Während viele Bakterien sind empfindlich gegen Tötung und der Freigabe durch Reaktion der mehrschichtigen Immun haben einige pathogene und opportunistische Bakterien Mechanismen, die eine Vielzahl von Wirtszellen zu infizieren und zu untergraben Freigabe durch die Wirtsimmunantwort 1 entwickelt. Neisseria gonorrhoeae ist ein Beispiel für ein bakterielles Pathogen dass ist sehr geeignet ist, in seiner menschlichen Wirt. N bestehen. gonorrhoeae kolonisiert leicht luminalen Oberflächen der Schleimhaut-Epithelzellen des Urogenitaltrakts, des Rachens, der Bindehaut und Rektum. Colonization löst die reichlich Rekrutierung von Neutrophilen bei Schleimhautstellen. Neutrophile Granulozyten sind professionelle Phagozyten, die eine Vielzahl von antimikrobiellen Prozesse zur Abtötung von Mikroorganismen besitzen, aber N. gonorrhoeae ist in der Lage zu überleben, in der Gegenwart von Neutrophilen 2-5. Verstehen, wie bakterielle Erreger wie N. gonorrhoeae zu untergraben, zu unterdrücken, und die Entführung der Immunantwort, um letztlich in der Regel feindlichen Host-Umgebungen zu überleben, ist entscheidend für die Entwicklung neuer Therapien zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten.

Versuchsprotokollen häufig verwendet, um bakterielle Überleben in Wirtszellen zu untersuchen sind Koloniezahl-Assays, Gentamicin-Schutztests und Elektronenmikroskopie. Koloniezahl in Assays wird eine Population von infizierten Zellen lysiert (z. B. mit einem Detergens whICH die Bakterien resistent sind), um die Bakterien zu befreien. Die Lysate werden verdünnt und auf Agar-basierten Medien ausplattiert und koloniebildende Einheiten in den Lysaten werden für jeden Zeitpunkt und / oder experimentellen Bedingungen aufgeführt. Dieser Ansatz berichtet die Lebensfähigkeit der gesamten Bakterienpopulation, ist aber nicht in der Lage, die Unterscheidung zwischen intra-und extrazelluläre Überleben. Eine Variation der Koloniezahl-Assay, der Gentamicin-Schutz-Assay misst speziell intrazelluläre Überleben der Bakterien, basierend auf der Unfähigkeit der Antibiotika Gentamicin, die eukaryotische Zellmembran 6 kreuzen. Allerdings ist dieser Test von den Bakterien empfänglich für die Tötung von Gentamicin (oder einem anderen Antibiotikum, das ähnlich eukaryotischen Membran impermeant ist) und die Unfähigkeit des Antibiotikums, um den Zugriff auf interne Bakterien. Daher kann ein Gentamicin-Schutz-Assay nicht effektiv zur Prüfung aller Bakterienarten oder bei der Prüfung überlebenden Bakterien in hochpinocytic Zellen wie Neutrophilen. Keiner dieser Ansätze zeigt die subzelluläre Lokalisation oder andere Verhalten einzelner Bakterien (z. B. wenn die Bakterien bilden Aggregate oder Mikrokolonien, die unterschiedlich von einzelnen Bakterienzellen verhalten). Eine andere häufig verwendete Ansatz, um die Lebensfähigkeit der einzelnen internen und externen Bakterien zu untersuchen ist dünn Schnitt Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Diese Vorgehensweise ist, dass sie Informationen über die Lage der Bakterien in Wirtszellen (zB Phagosom, Zytoplasma, Autophagosom), die durch Immunelektronenmikroskopie mit Gold-gekoppelten Antikörper gegen subzellulärer Marker untersucht werden kann vorteilhaft. Allerdings ist die Elektronenmikroskopie nicht besonders bei der Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien empfindlich. Wenn eingebetteten Abschnitte mit Uranylacetat, Bleicitrat oder andere elektronendichte Reagenzien gefärbt und mittels Elektronenmikroskopie abgebildet sind elektronendichte Bakterien lebensfähig und als elektrotron-Lucent nicht lebensfähigen 7,8. Überschätzt jedoch diese Annahme Lebensfähigkeit der Bakterien, da nur jene toten Bakterien mit schwer gestört Membranen und frei von Zytoplasma elektronenleuchtenden angezeigt. Darüber hinaus können einige Bakterienarten eine Reihe von Elektronendichten in Abhängigkeit von ihrer Wachstumsphase anzuzeigen, was es schwierig macht, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen.

Als Alternative oder zusätzlich zu diesen verbreiteten Methoden hier stellen wir Protokolle und Gründe für die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die Lebensfähigkeit der Bakterien zeigen, um das Überleben von Bakterien, die an und von Wirtszellen internalisiert zu beurteilen. Extrazelluläre Bakterien zu identifizieren, werden infizierte Zellen zuerst mit einem fluoreszierenden Reagenz, wie ein Lectin oder Bakterien-spezifischen Antikörper ausgesetzt. Die infizierten Zellen werden dann permeabilisiert und DNA-spezifische Farbstoffe, die differentiell zugänglich Bakterien mit intakten Membranen gegen abgebaut, als Ersatz für die Lebensfähigkeit von Bakterien ausgesetzt sind. In der ersten protocol, identifiziert die durchlässige Membran Farbstoff SYTO9 die Gesamtbakterienpopulation, während Propidiumiodid ist nur für jene Bakterien, die Membranen beeinträchtigt haben, und werden daher als nicht lebensfähig. Propidiumiodid und SYTO9 verwendet worden, um die Lebensfähigkeit der Bakterien in Biofilmen zu bewerten, zu unterscheiden von nicht-pathogenen pathogenen Bakterien und aufzählen tragfähige Wasser übertragene Bakterien 9-12. In der zweiten Protokoll, 4 ', 6'-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) identifiziert Gesamt Bakterien, während SYTOX Grün ist nur für den nicht lebensfähigen Bevölkerung. Die Lebensfähigkeit Farbstoffpaare können mit Immunfluoreszenz an Position jedes Bakterium im Vergleich zu einem Protein von Interesse beispielsweise um Bakterien subzelluläre Lokalisierung definieren bestimmen, kombiniert werden. Die Verwendung dieser Assays bietet wichtige Einblicke in die Interaktionen, die in Bakterienabtötung oder Überleben während der Infektion der Wirtszellen führen. Die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle wurden verwendet, um die Lebensfähigkeit der BeurteilungN. gonorrhoeae, die innerhalb und primären humanen neutrophilen Granulozyten, auch in verschiedenen Populationen von neutrophilen Phagosomen 5,13,14 angebracht ist. Allerdings können diese Protokolle angewendet werden, um die Lebensfähigkeit von gram-positiven und gram-negative Bakterien in professionellen Phagozyten, nicht-professionellen Phagozyten und Protozoen 15-24 beurteilen.

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Protokoll

1. Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien mit Propidiumiodid und SYTO9

  1. Infect adhärenten Zellen, die bis 12 mm Durchmesser kreisförmigen Deckgläsern in 24-Well-Platten mit Bakterien von Interesse sind. Beheben Sie NICHT die Zellen mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln.
  2. Spülen Zellen einmal vorsichtig in 0,1 M 3 - (N-Morpholino) propansulfonsäure (MOPS), pH 7,2, enthaltend 1 mM MgCl 2 (MOPS / MgCl 2).
  3. Zellen, Inkubation für 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur mit Alexa Fluor 647-gekoppelten Antikörper oder Lectin, der den Bakterienspezies von Interesse bindet, in MOPS / MgCl 2, externe Bakterien detektieren.

HINWEIS: Verhaltens steuert mit lebenden und toten Bakterien, in der Abwesenheit von Wirtszellen, um zu zeigen, dass das Lektin oder Antikörper von Interesse bindet alle Bakterien unabhängig von der Rentabilität (Abbildung 1).

  1. Spülen Zellen zweimal mit MOPS / MgCl 2.
  2. Saugen medien aus Zellen und 0,5 ml Live / Dead-Färbung Lösung. Live / Dead-Färbung Solution ist 5 uM SYTO9, 30 uM Propidiumiodid und 0,1% Saponin (Endkonzentrationen) in MOPS / MgCl 2.
  3. Zellen, Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  4. Spülen Zellen zwei Mal in MOPS / MgCl 2.
  5. Invert Deckseite nach unten auf Glasobjektträger und Dichtung mit klarem Nagellack. Verwenden Sie keine Montage Medien.
  6. Erwerben Sie Bilder innerhalb von 30 min, mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Filtersätze mit grünen, roten und dunkelroten Bildaufnahme kompatibel.

HINWEIS: In der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie und konfokaler Laserscanning-Mikroskopie verwendet werden. Nach 30 min die Fluoreszenzfarbstoffe beginnen, von den Bakterien austreten und die erfassten Daten nicht mehr genau. Bilder in diesem Artikel gezeigt wurden auf einem Nikon Eclipse-E800 aufrecht Fluoreszenzmikroskop mit Hamamatsu Orca-ER Digitalkamera mit Openlab Software erworben. 650 nm und einem Emissionsfilter von 663 - - Fluoreszenz von Alexa Fluor 647 wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlängen von 590 735 nm detektiert, und Falschfarben blau. 580 nm und einem Emissionsfilter von 600 - - 660 nm Fluoreszenz von Propidiumjodid wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 540 festgestellt. 495 nm und einem Emissionsfilter von 515 - - 555 nm Fluoreszenz von SYTO9 wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 465 festgestellt.

  1. Dieses Protokoll wird in dem externe Bilder nicht lebensfähigen Bakterien blau + rot erscheinen führen, nicht lebensfähigen Bakterien interne erscheinen nur rot, erscheinen externen lebensfähigen Bakterien blau + grün, und die interne lebensfähigen Bakterien erscheinen nur grün. Graf von Augen die Zahl der Bakterien, die nicht lebensfähig externe, interne nicht lebensfähig, lebensfähige externe und interne lebensfähig sind.
  2. Die prozentuale externer lebensfähigen Bakterien, indem die Anzahl von externen lebensfähigen Bakterien durch die Gesamtzahl der externen Bakterien (lebensfähigen und nonviLage). Berechnet den Prozentsatz der lebensfähigen Bakterien von internen Teilen der Anzahl der internen lebensfähigen Bakterien durch die Gesamtzahl der inneren Bakterien (lebensfähigen und nicht lebensfähigen) (Abb. 4).
  3. Es gibt zwei wesentliche Steuerelemente mit diesem Protokoll durchzuführen. Zuerst überprüfen, dass alle nicht lebensfähigen Bakterien sind Propidiumiodid-positiven und alle lebenden Bakterien sind SYTO9-positiv. Ein mittleren logarithmischen Bakterienkultur (in Abwesenheit von irgendeinem Wirtszellen) zu> 95% SYTO9-positiv sein. In Abbildung 2 ist ein mittel logarithmischen Kultur von N. gonorrhoeae (bei ​​10 8 koloniebildenden Einheiten pro ml) mit Live / Dead Färbelösung inkubiert. Zweitens bestätigen, dass sowohl Propidiumiodid und SYTO9 können permeabilisiert, infizierten Wirtszellen zu gelangen.
    1. Um eine Bevölkerung von toten Bakterien zu erzeugen, sammeln 2 x 10 8 Bakterien-Kolonien bildenden Einheiten in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 70% Isopropanol und sitzen für 10 min. Pellet die Bakterien in einem Mikrofuge einnd waschen die Bakterien zweimal in PBS, um restliche Isopropanol entfernen. Dann folgen die Schritte Protokoll 1,5-1,7. Werden 5 ul Bakteriensuspension auf einen Objektträger und Overlay mit einem Deckglas. Bild Proben wie in Schritt-Protokoll 1.9. Unter diesen Bedingungen sollte 100% der Bevölkerung Propidiumiodid-positiven (Abbildung 2). In einigen Bakterienarten können Propidiumiodid nicht vollständig überwältigen SYTO9 Färbung, und nicht lebensfähigen Bakterien erscheinen gelb oder orange.
    2. Für phagozytischen Zellen wie Neutrophile, setzen die Zellen zu Isopropanol abgetötete Bakterien und sicherzustellen, dass 100% der intrazellulären Bakterien Propidiumiodid-positiven (Abbildung 3). Für nonphagocytic Zellen, die toten Bakterien nicht verinnerlichen kann, kann es ausreichen, infizierten Zellen mit Natriumazid oder anderen zell permeant antimikrobielle Mittel vor dem Hinzufügen von Live / Dead-Färbung Lösung zu behandeln.

2. Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien mit SYTOX Green und DAPI

  1. Etikett Bakterien von Interesse mit 10 &mgr; g / ml DAPI in Morse definiertem Medium 25 für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  2. Zellen infizieren, die haft bis 12 mm runde Glasdeckgläschen in 24-Well-Platten mit DAPI-markierten Bakterien sind. Beheben Sie NICHT die Zellen mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln.
  3. Zellen spülen einmal mit MOPS / MgCl 2.
  4. Zellen für 10 min Inkubieren bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Alexa Fluor 647-gekoppelten Antikörper oder Lectin, der den Bakterienspezies von Interesse bindet, in MOPS / MgCl 2, externe Bakterien detektieren. Siehe Hinweis im Protokoll 1.3 für Schritt vorgeschlagen Kontrollen.
  5. Saugen Medien aus Zellen und 0,5 ml 0,4 uM SYTOX Green in MOPS / MgCl 2.
  6. Zellen, Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  7. Spülen Zellen zwei Mal in MOPS / MgCl 2.
  8. Waschen der Zellen einmal in MOPS / MgCl 2 für 5 min.
  9. Bilder innerhalb von 30 Minuten mit einem Fluoreszenzmikroskop erhalten. Siehe Protokoll 1.9 für Schritt Beschreibung Mikroskop, Digitalkamera und Erfassungssoftware.

HINWEIS: Die Fluoreszenz von Alexa Fluor 647 wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 590 detektiert - 650 nm und einem Emissionsfilter von 663 bis 735 nm, und falsch-rot gefärbt. 495 nm und einem Emissionsfilter von 515 - - 555 nm Fluoreszenz von SYTOX Grün wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 465 festgestellt. 375 nm-Sperrfilter von 400 nm - DAPI-Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 355 festgestellt.

  1. Grün + blau Dieses Protokoll wird in dem externe Bilder nicht lebensfähigen Bakterien erscheinen rot + grün führen, erscheinen nicht lebensfähigen Bakterien interne, externe lebensfähigen Bakterien erscheinen rot + blau, und die interne lebensfähigen Bakterien blau erscheinen nur (Abbildung 4). Quantifizierung der Prozent der externen und internen Bakterien als in der Protokoll-ste beschrieben1.11 p.
  2. Die in Protokollschritt 1.12 Kontrollen sollten mit der DAPI / SYTOX Green-Farbstoff-Kombination (Abbildungen 2 und 3) durchgeführt werden.

3. Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien Neben subzelluläre Lokalisierung

  1. Etikett Bakterien von Interesse mit 10 &mgr; g / ml DAPI in Morse definiertem Medium für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  2. Zellen infizieren, die haft bis 12 mm runde Glasdeckgläschen in 24-Well-Platten mit DAPI-markierten Bakterien sind. Beheben Sie NICHT die Zellen mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln.
  3. Zellen spülen einmal mit MOPS / MgCl 2.
  4. Inkubieren 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Alexa Fluor 647-gekoppelten Antikörper oder Lectin, der den Bakterienspezies von Interesse bindet, in MOPS / MgCl 2, externe Bakterien detektieren. Siehe Hinweis im Protokoll 1.3 für Schritt vorgeschlagen Kontrollen.
  5. Saugen Medien aus Zellen und Zellen spülen zwei times in MOPS / MgCl 2.
  6. Inkubieren Zellen mit Alexa Fluor 555-gekoppelten Antikörper gegen subzellulären Marker von Interesse für 20 min in MOPS / MgCl 2, enthaltend 0,2% Saponin.
  7. Spülen Zellen zwei Mal in MOPS / MgCl 2.
  8. Waschen der Zellen einmal in MOPS / MgCl 2 für 5 min.
  9. Saugen Medien aus Zellen und fügen 0,4 uM SYTOX Green in MOPS / MgCl 2.
  10. Inkubiere Zellen 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  11. Spülen Zellen zwei Mal in MOPS / MgCl 2.
  12. Waschen der Zellen einmal in MOPS / MgCl 2 für 5 min.
  13. Erwerben Sie Bilder von Folien innerhalb von 30 min auf Fluoreszenzmikroskop. Siehe Protokoll 1.9 für Schritt Beschreibung Mikroskop, Digitalkamera und Erfassungssoftware.

HINWEIS: Die Fluoreszenz von Alexa Fluor 647 wurde mit einem Filter mit Anregungswellenlänge von 590 festgestellt - 650 nm und Emissionsfilter von 663 bis 735 nm und ist falsch-violett gefärbt. Fluoreszenz-f580 nm und einem Emissionsfilter von 600 - - 660 nm ROM Alexa Fluor 555 wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 540 festgestellt. 495 nm und einem Emissionsfilter von 515 - - 555 nm Fluoreszenz von SYTOX Grün wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 465 festgestellt. 375 nm-Sperrfilter von 400 nm - DAPI-Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 355 festgestellt.

  1. Grün + blau Dieses Protokoll wird in dem externe Bilder nicht lebensfähigen Bakterien lila + grün erscheinen führen, erscheinen nicht lebensfähigen Bakterien internen, lila + blau erscheinen externen lebensfähigen Bakterien scheinen interne lebensfähigen Bakterien nur blau und subzellulärer Protein scheint rot (Abbildung 4). Quantifizierung der perecent von externen und internen lebensfähigen Bakterien wie in Protokoll beschriebenen Schritte 1.11.
  2. Die in Protokollschritt 1.12 Kontrollen sollten mit der DAPI / SYTOX Green-Farbstoff-Kombination (Abbildungen 2 und 3) durchgeführt werden.
  3. InNeben den lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zählung Bakterien, klassifizieren jeweils Bakterien als positiv oder negativ für die Co-Lokalisation mit subzellulärer Marker von Interesse.
  4. Berechnet den Prozentsatz der lebensfähigen Bakterien, die mit subzellulären Marker durch Dividieren der Anzahl der lebensfähigen Bakterien kolokalisiert durch die Gesamtzahl der lebensfähigen Bakterien kolokalisiert. Berechnet den Prozentsatz der nicht lebensfähigen Bakterien, die mit subzellulären Marker indem die Anzahl lebensfähiger Bakterien kolokalisiert durch die Gesamtzahl lebensfähiger Bakterien kolokalisiert.

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Ergebnisse

Die skizzierten Protokolle wurden verwendet, um das Überleben von N. prüfen gonorrhoeae nach Einwirkung von primären humanen Neutrophilen 5,26. Neutrophile wurden mit N. infiziert gonorrhoeae und verarbeitet mit Protokoll 1, mit dem grün-fluoreszierenden Farbstoff SYTO9 Lebensfähigkeit und die rote fluoreszierende Propidiumiodid (Abbildung 4A). Die Farbstoffe wurden in Gegenwart von Saponin, die Cholesterin sequestriert, um vorzugsweise permeabilisiert...

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Diskussion

Präsentiert hier sind zwei Protokolle, die DNA-Bindung und Lebensfähigkeit Farbstoffe in Verbindung mit einem fluoreszierenden Lektin zu lebenden und toten Bakterien und menschlichen Zellen im Inneren angebracht identifizieren zu verwenden. Da beide Protokolle effektiv live aus toten Bakterien zu unterscheiden, deren Wahl-Protokoll zu verwenden, hängt von dem Ziel des Experiments. Das erste Protokoll verwendet Propidiumiodid zu nicht lebensfähigen Bakterien und SYTO9 intakte Nachweis von Bakterien zu erkennen. In

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

Wir danken Asya Smirnov und Laura Gonyar für das kritische Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse NIH R00 und R01 TW008042 AI097312 zu AKCMBJ wurde zum Teil durch NIH T32 AI007046 getragen wird.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collectionBecton Dickinson367251 
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 mlBecton Dickinson366480 
Sterile water for irrigationBaxter07-09-64-070 
Dextran 500Sigma31392 
Sodium ChlorideFisher ScientificS641 
DextroseRicca Chemical CompanyRDCD0200 
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+Thermo ScientificSH3002802 
Ficoll solutionGE Healthcare17-1440-03 
Acetic AcidFisher ScientificBP2401 
12 mm circular glass coverslipsFisher Scientific12-545-80 12CIR-1 
24-well platesCorning Incorporated3524 
Pooled Human SerumSigmaS7023 
RPMIMediatech15-040-CV 
Fetal Bovine SerumThermo ScientificSH3007103 
Human interleukin-8R&D Systems208-IL/CF 
MOPSSigmaM3183 
MgCl2Fisher ScientificBP214 
Propidium IodideLife TechnologiesL7007 or L7012 
SYTO9Life TechnologiesL7007 or L7012 
SaponinFluka Analytical47036 
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectinLife TechnologiesL-32463 
DAPISigmaD8417 
SYTOX GreenLife TechnologiesS7020 
Mouse anti-CD63Developmental Studies Hybridoma BankH5C6 
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling KitLife TechnologiesA20187 
Hemacytometer Bright LineHausser Scientific1492 
ForcepsEMS78320 
Sorvall Legend RT + CentrifugeThermo Scientific75004377 

Referenzen

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