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摘要

中央细菌发病机理的字段是定义是否以及如何暴露于真核细胞中后微生物生存的能力。本文概述了使用，揭示内部以及与宿主细胞相关的各个细菌的生存能力荧光染料的协议。

摘要

中央细菌发病机理的字段是定义是否以及如何暴露于真核细胞中后微生物生存的能力。目前的协议来解决这些问题包括菌落总数测定，庆大霉素保护法和电子显微镜。菌落总数和庆大霉素保护法只评估整个细菌群体的生存能力，也就无法确定单个细菌的生存能力。电子显微镜可以用于确定个体的细菌的生存能力和提供关于其在宿主细胞中的定位信息。然而，细菌常常显示一个范围的电子密度，使得可行性评估困难。本文概述了使用，揭示内部以及与宿主细胞相关的各个细菌的生存能力荧光染料的协议。这些分析是独自开发，以评估在小学人类嗜中性粒细胞淋球菌存活，但应该是一个pplicable任何细菌宿主细胞的相互作用。这些协议结合膜可渗透荧光染料（SYTO9和4'，6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚[DAPI]），其染色所有的细菌，具有不可透过膜的荧光染料（碘化丙锭和SYTOX绿），这是唯一的访问不能存活的细菌。前的真核细胞透化，抗体或荧光试剂加入到识别细胞外细菌。因而这些测定鉴别细菌粘附于和里面的真核细胞的生存能力。一种协议还提供了使用的可行性染料结合的荧光抗体的真核细胞的标记物，以确定个别细菌的亚细胞定位。这篇文章中讨论的细菌存活染料是一个敏感的补充和/或替代传统的微生物学技术来评估个体细菌的生存能力，并提供有关在细菌的宿主细胞生存信息秒。

引言

有一个动态的互动和在其居住的细菌和宿主之间的共同进化。细菌已经进化粘附细胞器，分泌系统，和/或产生毒素，使宿主吞噬细胞和非吞噬细胞的生产性感染的能力。此外，细菌还必须与认可与宿主免疫系统的抗菌活性。宿主的免疫系统包括先天性和适应性组件，包括物理和化学屏障，免疫细胞，补体系统，免疫和体液免疫的其它部件。虽然许多细菌很容易受到杀伤和清除由多层宿主的免疫反应，一些致病性和投机细菌已经进化机制来感染多种宿主细胞和宿主的免疫反应1颠覆间隙。 淋球菌是一种细菌病原体的一个例子这是高度适应坚持其人类宿主。Ñ。淋病容易定殖泌尿生殖道癌，咽癌，结膜，和直肠的粘膜上皮细胞的腔表面。定植触发嗜中性粒细胞的大量招聘在粘膜部位。中性粒细胞是专业的吞噬细胞是具有多种抗微生物过程，以杀死微生物，但是，N。淋病是能够存活在嗜中性粒细胞2-5的存在。了解如何细菌病原体如N。淋球菌颠覆，压制，并劫持了免疫反应通常在恶劣的环境中主机的最终生存是至关重要的防治传染性疾病的新疗法的发展。

常用于宿主细胞研究细菌生存实验的协议包括菌落总数测定，庆大霉素保护法和电子显微镜。在菌落计数测定法，受感染的细胞群被裂解（例如，用洗涤剂的whICH细菌有抗药性）解放细菌。将裂解物稀释并涂布在琼脂上的媒体，以及集落形成单位中的溶胞产物被列举为每个时间点和/或实验条件。此方法报道的全部细菌群体的生存力，但并不能够胞内和胞外生存区分的。上的菌落计数测定法，庆大霉素保护测定法，一种变化明确地测量细胞内细菌存活，基于抗生素庆大霉素无法越过的真核细胞膜6。但是，这种测定法是依赖于细菌会受影响杀庆大霉素（或另一种抗生素是类似的真核细胞膜透性）和抗生素的无力获得内部的细菌。因此，庆大霉素保护法可能无法有效检查所有细菌种类或检查高度细菌生存时胞饮细胞如嗜中性粒细胞。这些方法都不揭示了亚细胞定位或个人的细菌等行为（ 例如 ，如果细菌形成聚集体或行为不同于单个细菌细胞菌落）。另一种经常使用的方法，检查单个外部和内部的细菌的生存能力是薄截面的透射电子显微镜（TEM）。这种方法的优点在于，它可以提供有关该细菌在宿主细胞中的位置（ 例如，吞噬体，细胞质，自噬体），它可以被进一步研究通过免疫电镜用金偶联抗体亚细胞标记信息。然而，电子显微镜是不是在评估细菌生存力特别敏感。当包埋切片进行染色用醋酸双氧铀，柠檬酸铅，或其他电子密度试剂和通过电子显微镜成像，电子致密的细菌被认为是可行的和电子角TRON朗讯不能存活7,8。然而，这个假设高估细菌生存能力，因为只有那些死去的细菌严重破坏细胞膜和细胞质泯灭的出现电子透亮。此外，某些细菌种可能显示的范围内的电子密度取决于生长的阶段，因此很难确定可行性。

作为替代或除了这些广泛使用的方法，在这里我们提供的协议和原理为利用荧光染料，表明细菌生存力评估附着并通过宿主细胞内在化细菌的存活。以识别细胞外的细菌，感染的细胞首先暴露于荧光试剂，如凝集素或菌特异性抗体。然后将感染的细胞透化，并暴露于DNA特异性染料是差分访问的细菌与完整与退化的膜，作为替代的细菌存活率。在第一protocol，膜渗透性染料SYTO9识别细菌总人口，而碘化丙啶是只对那些破坏细胞膜，因此被认为无法存活的细菌。碘化丙锭和SYTO9已被用于评价细菌存活在生物膜中，判别从非致病性细菌致病，并且列举可行的水性细菌9-12。在第二协议，4'，6'-二脒基-2 - 苯基吲哚（DAPI）确定总的细菌，而SYTOX Green是唯一可访问的无活力的人口。这些活力染料对可与免疫有关的感兴趣的蛋白质，以确定各细菌的位置，例如以限定细菌亚细胞定位进行组合。利用这些分析提供关键洞察导致宿主细胞的感染过程中杀死细菌或生存的相互作用。在这篇文章中列出的协议被用来评估的可行性是连接到与内初级人嗜中性粒细胞，包括中性粒细胞的吞噬体5,13,14的不同人群淋病奈瑟氏球菌 。然而，这些协议可以被用于评估在专业的吞噬细胞，非专业吞噬细胞和原生动物15-24的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的生存能力。

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研究方案

1。评估细菌存活与碘化丙啶和SYTO9

  1. 感染的细胞，粘附到12毫米直径的圆形盖玻片在24孔板中与感兴趣的细菌。 不修复的细胞与醛或有机溶剂。
  2. 漂洗细胞一次轻轻地在0.1M 3 - （N-吗啉代）丙磺酸（MOPS），pH值7.2，含1mM的MgCl 2（MOPS / MgCl 2的）。
  3. 孵育细胞在黑暗中10分钟，在室温下用的Alexa Fluor 647 -偶联抗体或凝集素，其结合到感兴趣的细菌菌种来说，在MOPS / MgCl 2的，以检测外部细菌。

注：行为与活的和死的细菌控制，在没有宿主细胞，表明感兴趣的凝集素或抗体结合所有的细菌，无论生存能力（ 图1）。

  1. 冲洗细胞两次，MOPS / 氯化镁 。
  2. 吸米EDIA从细胞和加入0.5毫升活/死染色溶液。活/死染色溶液为5微米SYTO9，30微米碘化丙啶，并在MOPS / 氯化镁 0.1％皂素（终浓度）。
  3. 孵育细胞15分钟，在室温下在黑暗中。
  4. 冲洗细胞两次在公开资讯观测站/ 氯化镁。
  5. 反转盖玻片面朝下放置玻片和密封用透明指甲油。不要使用安装媒体。
  6. 在30分钟内采集图像，使用荧光显微镜与绿色，红色和远红色图像采集兼容的过滤器集。

注意：两个常规荧光显微镜和共焦激光扫描显微镜可以使用。经过30分钟的荧光染料开始从细菌到泄漏和获取的数据不再准确。本文中显示图像，在使用的OpenLAB软件滨松的Orca-ER数码相机尼康的Eclipse E800直立荧光显微镜收购。 650纳米和663的发射滤波器 - - 使用过滤器以590激发波长检测的Alexa Fluor 647的荧光735纳米，并且是伪色的蓝色。 580纳米和600的发射滤波器 - - 660纳米使用过滤器以540激发波长检测从碘化丙啶荧光。 495 nm和515发射滤光片 - - 555 nm处使用过滤器具有465激发波长检测从SYTO9荧光。

  1. 该协议将导致在外部不能存活的细菌出现蓝色+红色图像，内部自生能力的细菌仅出现红色，外​​部活菌出现蓝+绿，内部活菌只呈现绿色。由眼计数的细菌是没有自生能力的外部，内部没有自生能力，外部可行的，并且内部可行的数字。
  2. 通过将外部的活菌数由外部细菌的总数（计算外部活菌百分比可行加nonvi能）。通过将内部的活菌数由内部的细菌总数（可行加上不能存活）（ 图4）计算出内部的存活细菌的百分比。
  3. 有两个基本的控制与此协议来执行。首先，验证所有的自生能力的细菌是碘化丙啶阳性和所有活细菌是SYTO9阳性。细菌（在没有任何宿主细胞）在对数中期文化应> 95％SYTO9阳性。 如图2中所示为N的对数中期培养淋病 （10 8菌落形成每毫升为单位）孵育活/死染色溶液。第二，验证这两个碘化丙锭和SYTO9可以进入通透，感染的宿主细胞。
    1. 为了产生死菌的群体，收集2×10 8菌落形成单位在1.5 ml离心管中，加入70％的异丙醇和坐10分钟。沉淀的细菌在微量一个第二次洗，细菌在PBS中以除去残留的异丙醇。然后，按照协议执行步骤1.5 - 1.7。添加5μl的细菌悬浮液在载玻片上并覆盖盖玻片。图像样本作为协议的步骤1.9。在这些条件下，人口的100％应是碘化丙啶阳性（ 图2）。在某些细菌物种，碘化丙啶未必完全压倒SYTO9染色，并不能存活的细菌可能会出现黄色或橙色。
    2. 对吞噬细胞如嗜中性粒细胞，暴露细胞异丙醇-杀死的细菌，并确保该胞内细菌的100％的碘化丙啶阳性（ 图3）。对于非吞噬细胞，可能不内化死的细菌，它可以是足以治疗感染的细胞中与叠氮化钠或其它渗透细胞的抗微生物剂添加的活/死染色溶液之前。

2。细菌性评估与可行性格力SYTOXn和DAPI

  1. 与10微克/毫升的DAPI 20分钟，在室温下在黑暗中在莫尔斯的定义中25兴趣标签细菌。
  2. 感染的细胞，粘附到12毫米直径的圆形盖玻片在24孔板用DAPI标记的细菌。 不修复的细胞与醛或有机溶剂。
  3. 与MOPS / 氯化镁冲洗一次细胞。
  4. 孵育细胞10分钟，在室温下在黑暗中的Alexa Fluor 647 -偶联抗体或凝集素，其结合到感兴趣的细菌菌种来说，在MOPS / MgCl 2的，以检测外部细菌。见注在协议的步骤1.3中建议的控制。
  5. 从细胞中吸媒体和加入0.5毫升0.4微米SYTOX格林在MOPS / 氯化镁 。
  6. 孵育细胞5分钟，在室温下在黑暗中。
  7. 冲洗细胞两次在公开资讯观测站/ 氯化镁 。
  8. 在MOPS / 氯化镁 5分钟洗涤细胞一次。
  9. 采集用荧光显微镜在30分钟内的图像。看显微镜，数码相机和采集软件描述协议的步骤1.9。

注意：使用过滤器具有590激发波长检测到的Alexa Fluor 647荧光 - 650 nm和663发射滤光片 - 735纳米，是假色红。 495 nm和515发射滤光片 - - 555 nm处使用过滤器具有465激发波长检测从SYTOX绿色荧光。 375 nm和400 nm的屏障过滤器 - 使用过滤器以355激发波长检测来自DAPI的荧光。

  1. 该协议将导致在外部不能存活的细菌出现红光+绿光图像，内部自生能力的细菌出现绿+蓝，外部活菌出现红+蓝，和内部活菌出现蓝色只（ 图4）。作为协议的输注液定量描述外部和内部的细菌的百分比p 1.11。
  2. 在协议步骤1.12中描述的控制应与DAPI / SYTOX Green染料组合（ 图2和图3）来执行。

3。评估细菌生存能力除了亚细胞定位

  1. 在莫尔斯的定义中20分钟，在室温下在黑暗中有10微克/毫升的DAPI兴趣标签细菌。
  2. 感染的细胞，粘附到12毫米直径的圆形盖玻片在24孔板用DAPI标记的细菌。 不修复的细胞与醛或有机溶剂。
  3. 与MOPS / 氯化镁冲洗一次细胞。
  4. 孵育10分钟，在室温下在黑暗中的Alexa Fluor 647 -偶联抗体或凝集素，其结合到感兴趣的细菌菌种来说，在MOPS / MgCl 2的，以检测外部细菌。见注在协议的步骤1.3中建议的控制。
  5. 从细胞中吸媒体和冲洗细胞2 TIMES在MOPS / 氯化镁。
  6. 培养细胞的Alexa Fluor针对感兴趣的亚细胞标记物555偶联抗体20分钟，在MOPS / MgCl 2的含有0.2％皂苷。
  7. 冲洗细胞两次在公开资讯观测站/ 氯化镁 。
  8. 在MOPS / 氯化镁 5分钟洗涤细胞一次。
  9. 从细胞中吸媒体，并添加0.4微米SYTOX格林在MOPS / 氯化镁 。
  10. 孵育细胞5分钟，在室温下在黑暗中。
  11. 冲洗细胞两次在公开资讯观测站/ 氯化镁 。
  12. 在MOPS / 氯化镁 5分钟洗涤细胞一次。
  13. 在荧光显微镜30分钟获得的幻灯片图像。看显微镜，数码相机和采集软件描述协议的步骤1.9。

注意：使用过滤器具有590激发波长检测到的Alexa Fluor 647荧光 - 650 nm和663发射滤光片 - 735纳米，是假色紫色。的荧光F580纳米和600的发射滤波器 - - 660纳米的ROM的Alexa Fluor 555使用滤波器540的激发波长进行检测。 495 nm和515发射滤光片 - - 555 nm处使用过滤器具有465激发波长检测从SYTOX绿色荧光。 375 nm和400 nm的屏障过滤器 - 使用过滤器以355激发波长检测来自DAPI的荧光。

  1. 该协议将导致在外部不能存活的细菌出现紫色+绿色的图像，内部自生能力的细菌出现绿+蓝，外部活菌出现紫色+蓝色，内生菌只出现蓝色，和亚细胞蛋白质呈红色（ 图4）。量化外部和内部活菌如协议中描述的perecent步骤1.11。
  2. 在协议步骤1.12中描述的控制应与DAPI / SYTOX Green染料组合（ 图2和图3）来执行。
  3. 在除了计数可行的和无法存活的细菌，细菌每一个分类为正或负的共定位与所关注的亚细胞标记。
  4. 计算除以共同定位的存活细菌的数量通过活菌总数共定位与亚细胞标记物的存活细菌的百分比。计算除以无活力共定位的细菌数量由无活力的细菌总数共定位与亚细胞标记物不能存活的细菌的百分比。

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结果

概括的协议被用来研究N的生存淋球菌暴露于人原后中性粒细胞5,26。中性粒细胞被感染N.淋病和与方案1进行处理，利用绿色荧光活力染料SYTO9和红色荧光碘化丙啶（ 图4A）。染料被加入以皂角苷的存在下，该螯合胆固醇优先透化的宿主细胞的质膜，而不是全淋球菌膜。其他洗涤​​剂可能需要进行测试，如果感兴趣的细菌的细胞膜含有高量的胆固醇?...

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讨论

这里呈现的是使用DNA结合和可行性染料与荧光凝集素识​​别连接到内部和人体细胞活的和死的细菌结合两种协议。由于这两种协议都有效地死菌歧视的活，要使用哪个协议的选择取决于实验的目的。第一个协议使用碘化丙啶检测不能存活的细菌和SYTO9检测的细菌。 如图4A所示是方案1的代表性图像施加到感染N.人中性粒细胞淋球菌 。这些染料结合的凝集素，大豆凝集素?...

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披露声明

作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。

致谢

我们感谢阿霞斯米尔诺夫和Laura Gonyar的手稿的批判性阅读。这项工作是由美国国立卫生研究院资助R00 TW008042和R01 AI097312到AKCMBJ部分由美国国立卫生研究院的T32 AI007046被支承。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collectionBecton Dickinson367251 
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 mlBecton Dickinson366480 
Sterile water for irrigationBaxter07-09-64-070 
Dextran 500Sigma31392 
Sodium ChlorideFisher ScientificS641 
DextroseRicca Chemical CompanyRDCD0200 
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+Thermo ScientificSH3002802 
Ficoll solutionGE Healthcare17-1440-03 
Acetic AcidFisher ScientificBP2401 
12 mm circular glass coverslipsFisher Scientific12-545-80 12CIR-1 
24-well platesCorning Incorporated3524 
Pooled Human SerumSigmaS7023 
RPMIMediatech15-040-CV 
Fetal Bovine SerumThermo ScientificSH3007103 
Human interleukin-8R&D Systems208-IL/CF 
MOPSSigmaM3183 
MgCl2Fisher ScientificBP214 
Propidium IodideLife TechnologiesL7007 or L7012 
SYTO9Life TechnologiesL7007 or L7012 
SaponinFluka Analytical47036 
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectinLife TechnologiesL-32463 
DAPISigmaD8417 
SYTOX GreenLife TechnologiesS7020 
Mouse anti-CD63Developmental Studies Hybridoma BankH5C6 
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling KitLife TechnologiesA20187 
Hemacytometer Bright LineHausser Scientific1492 
ForcepsEMS78320 
Sorvall Legend RT + CentrifugeThermo Scientific75004377 

参考文献

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