포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

요약

세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다.

초록

세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 현재의 프로토콜은 식민지 카운트 분석, 겐타 마이신 보호 분석 및 전자 현미경 (가) 있습니다. 콜로니 수와 겐타 마이신 보호 분석은 전체 세균 집단의 생존 능력을 평가하고 각각의 세균 가능성을 확인할 수 없습니다. 전자 현미경 개별 박테리아의 생존을 결정하고 숙주 세포에서의 지역화에 관한 정보를 제공하는데 사용될 수있다. 그러나 박테리아는 종종 생존 능력의 평가는 어렵게, 전자 밀도의 범위를 표시합니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 분석은 인간의 기본 호중구에 임균의 생존을 평가하기 위해 원래 개발 된, 그러나해야한다어떤 박테리아 숙주 세포의 상호 작용에 pplicable. 이러한 프로토콜은 막 투과 형광 염료 결합 만 액세스 할 수있는 막 투과성 형광 염료 (요오드화 프로피 듐 및 SYTOX 녹색)로, 모든 박테리아를 얼룩 (SYTO9 및 4 ', 6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 [DAPI), 생존 할 박테리아. 종래 진핵 세포 permeabilization에, 항체 또는 형광 시약을 세포 외 박테리아를 식별하기 위해 추가된다. 따라서 이러한 분석은 진핵 세포와 내부에 부착 박테리아의 생존 능력을 차별. 프로토콜은 또한 개별 박테리아 세포 내 현지화를 결정하기 위해, 진핵 세포 마커 형광 항체와 조합 생존력 염료를 사용하여 제공된다. 이 문서에서 설명하는 박테리아의 생존 염료 개별 박테리아의 생존 능력을 평가하고 박테리아가 숙주 세포에서 살아 남기 위치에 관한 정보를 제공하기 위해 기존의 미생물 기술에 민감한 보완 및 / 또는 대안의.

서문

동적 상호 작용과 그들이 거주하는 박테리아와 호스트 사이의 공동 발전이있다. 박테리아 부착 소기관, 분비 시스템, 및 / 또는 호스트 식세포 및 비 식세포 그들의 생산적 감염을 활성화 독소를 생산하는 능력을 진화 해왔다. 박테리아는 또한 인식과 숙주 면역 시스템의 항균 활동을 주장해야합니다. 숙주 면역 시스템은 물리적 및 화학적 장벽, 면역 세포, 보체계 및 체액 성 면역의 다른 구성 요소들을 포함하는 선천성 및 적응 구성 요소로 구성된다. 많은 박테리아가 다층 호스트 면역 반응에 의해 살해 및 통관에 민감하지만, 몇 가지 병원성 및 기회 박테리아가 숙주 세포의 다양한 감염 및 숙주 면역 반응 ^(1)에 의해 허가를 파괴하는 메커니즘을 진화했다. 임균은 세균성 병원체의 한 예입니다 그는 매우 그 사람의 호스트. N에서 지속하도록되어있다. 임질은 쉽게 비뇨 생식기의 기관, 인두, 결막, 그리고 직장의 점막 상피 세포의 내강 표면을 식민지화한다. 식민지 점막 사이트에서 호중구의 풍부한 모집을 트리거합니다. 호중구는 미생물을 죽이는 항균 다양한 공정을 가지고 전문 식세포 있습니다하지만, N. 임질은 호중구 ^2-5의 존재하에 생존 할 수있다. 같은 N. 같은 방법 세균성 병원균에 대한 이해 임질은, 파괴 억제하고 궁극적으로 일반적으로 적대적 호스트 환경에서 살아 남기 위해 면역 반응을 납치하는 것은 전염성 질병을 퇴치에 대한 새로운 치료법의 개발에 매우 중요합니다.

종종 숙주 세포에서 박테리아의 생존을 조사하는 데 사용 실험 프로토콜은 식민지 카운트 분석, 겐타 마이신 보호 분석 및 전자 현미경 (가) 있습니다. 콜로니 카운트 분석법에서, 감염 세포의 집단은 ㅁ하는 세제, 예를 들어 (용해된다무형 문화 유산 박테리아는 박테리아를 해방하는) 저항한다. 해물 희석 한천 기반 미디어에 도금하고, 용 해물의 콜로니 형성 단위는 각 시점 및 / 또는 실험 조건에 대해 열거된다. 이 접근법은 전체 세균 집단의 생존 능력을보고하지만, 세포 내 및 세포 생존을 구별 할 수 없다는 것이다. 식민지 카운트 분석, 겐타 마이신 보호 분석에 변화가 구체적으로 진핵 생물의 세포막 ^{6 교차하는} 항생제 겐타 마이신의 무능력에 따라 세포 내 박테리아의 생존을 측정한다. 그러나이 분석은 겐타 마이신 (또는 유사 진핵 막 impermeant 또 다른 항생제)와 내부 박테리아에 액세스 할 수있는 항생제의 무능력에 의해 살해에 감염되는 박테리아에 의존합니다. 따라서, 겐타 마이신 보호 분석은 모든 세균 종의 검사를 위해 효과적 일 또는하지 않을 수 있습니다 높은 세균의 생존을 검사 할 때이러한 호중구로 pinocytic 세포. (박테리아가 집계 또는 다른 개별 박테리아 세포에서 행동 microcolonies을 형성하는 경우 예) 둘 중 어떤 방법을 사용해도 세포 내 현지화 각각의 박테리아 또는 다른 동작을 보여준다. 각각의 외부 및 내부 박테리아의 생존을 조사하는 또 다른 자주 사용되는 방법은 얇은 단면 투과 전자 현미경 (TEM)이다. 이 방법은 상기 세포 내 마커에 대해 골드 결합 항체로 면역 전자 현미경으로 조사 할 수있는 숙주 세포에서 박테리아의 위치 (예 phagosome에, 세포질 autophagosome)에 관한 정보를 제공 할 수 있다는 점에서 유리하다. 그러나 전자 현미경은 세균의 생존 능력을 평가에 특히 구분하지 않습니다. 포함 된 섹션은 우라 닐 아세테이트, 리드 시트 레이트, 또는 다른 전자 밀도 시약으로 염색과 전자 현미경에 의해 촬영하는 경우, 전자 밀도가 박테리아는 생존과 ELEC 간주됩니다트론 - 루슨트 생존 할 ^7,8. 그러나이 가정은 심각한 혼란 세포막과 세포질의 결여와 만 죽은 박테리아 때문에 전자 - 루슨트 표시, 세균의 생존 능력을 과대 평가. 또한, 일부 세균 종은 어려운 생존력을 결정하게하는, 성장의 그들의 단계에 따라 전자 밀도의 범위를 표시 할 수있다.

대체 또는 이러한 널리 사용되는 방법에 추가로, 여기에서 우리는에 부착 숙주 세포에 의해 내면화 된 박테리아의 생존을 평가하는 세균 생존 능력을 나타내는 형광 염료의 사용을위한 프로토콜과 이론적 근거를 제공한다. 세포 외 박테리아를 식별하기 위해, 감염된 세포는 최초의 렉틴이나 박테리아의 특정 항체로 형광 시약에 노출되어 있습니다. 감염된 세포는 다음 permeabilized 및 세균 생존을위한 대리로, 성능이 저하 된 막 대 손상과 세균에 차별적으로 액세스 할 수있는 DNA 특정 염료에 노출되어 있습니다. 제 P 있음프로피 디움 요오드는 세포막을 손상하고, 따라서 생존 불가능한 것으로 간주되는 그 박테리아 만이 액세스 할 수있는 동안 rotocol, 막 투과성 염색 SYTO9는 총 세균 집단을 식별합니다. 프로피 디움 요오드 및 SYTO9는 바이오 필름 ​​세균 생존 능력을 평가하는 비병원성 박테리아 병원성 차별, 실행 가능한 수 인성 박테리아 ^9-12을 열거하는 데 사용되었습니다. SYTOX 녹색 생존 할 인구 만 액세스 할 수있는 동안 두 번째 프로토콜에서, 4 ', 6'-diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI)는 총 박테리아를 식별합니다. 이들 생존 염료 쌍은 박테리아 세포 내 현지화를 정의하는 예를 들어, 관심있는 단백질과 관련하여, 각 세균의 위치를​​ 결정하기 위해 면역 형광과 결합 될 수있다. 이러한 분석법의 사용은 숙주 세포의 감염시 세균 살상 또는 생존을 초래할 상호 작용에 대한 통찰력을 제공한다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 생존을 평가하기 위해 사용되었다호중구 된 phagosomes ^5,13,14의 다른 인구를 포함하여 인간의 기본 호중구와 내부에 부착되어 N. 임질. 그러나, 이들 프로토콜은 프로 식세포, 비전문 식세포 및 원생 동물에 ^15-24 그람 양성 및 그람 음성 세균의 생존 능력을 평가하기 위해 적용될 수있다.

프로토콜

1. 프로피 디움 요오드 및 SYTO9와 세균 생존 능력을 평가

1. 그 박테리아를 24 - 웰 플레이트에있는 12 mm 직경의 원형 유리 커버 슬립에 부착되어 세포를 감염. 알데히드 또는 유기 용제로 세포를 고정하지 마십시오.
2. 회 부드럽게 세포를 헹구 0.1 M 3 - (N-모르 폴리 노) 1 mM의 _MgCl2를 (MOPS / MgCl2를 _2)를 함유하는 프로판 술폰산 (MOPS)의 pH 7.2.
3. 외부 세균을 검출하기 위해, MOPS / MgCl2를 _2, 관심의 세균 종에 결합 알렉사 플 루어 647-결합 항체 또는 렉틴과 실온에서 어둠 속에서 10 분 동안 세포를 품어.

참고 : 행동이 관심의 렉틴 또는 항체 (그림 1)에 관계없이 생존의 모든 박테리아를 바인딩 것을 보여주기 위해, 숙주 세포의 부재에서, 라이브와 죽은 세균 제어합니다.

4. MOPS / _MgCl2를 가진 세포를 두 번 씻어.
5. 기음 M세포 edia 및 0.5 ㎖ 라이브 / 죽은 염색 솔루션을 추가합니다. 라이브 / 죽은 염색 솔루션 MOPS / _MgCl2를 5 μM의 SYTO9, 30 μM의 propidium 요오드화, 0.1 %의 사포닌 (최종 _{농도)입니다.}
6. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 세포를 배양한다.
7. MOPS / _MgCl2를 셀을 두 번 _씻어.
8. 반전의 coverslips는 유리 슬라이드에 얼굴을 아래로하고 명확한 매니큐어로 밀봉. 설치 미디어를 사용하지 마십시오.
9. 녹색, 빨강, 및 원적외선 이미지 수집과 호환 필터 세트와 형광 현미경을 이용하여 30 분 이내에 이미지를 획득.

NOTE : 종래의 형광 현미경과 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용할 수있다 둘. 30 분 후, 형광 염료가 세균으로부터 새기 시작해야하며 취득한 데이터를 더 이상 정확하다. 이 문서에 표시된 이미지는 Openlab 소프트웨어를 사용하여 하마 오카-ER 디지털 카메라 니콘 이클립스 E800 강직 한 형광 현미경에 인수했다. 650 nm의 663의 발광 필터 - - 알렉사 플 루어 647의 형광은 590 여기 파장 필터를 사용하여 발견 된 735 nm의, 거짓 색 파란색입니다. 580 ㎚, 600의 방출 필터 - - 660 nm의 요오드화 프로피 듐에서 형광 540의 여기 파장을 가진 필터를 사용하여 검출 하였다. 495 ㎚, 515의 방출 필터 - - 555 nm의 SYTO9의 형광은 465의 여기 파장을 가진 필터를 사용하여 검출 하였다.

10. 이 프로토콜은 외부 생존 할 박테리아가 적색 + 청색으로 이미지가 발생합니다 내부 생존 할 박테리아가 빨간색 만 표시, 외부 가능한 박테리아는 녹색 + 청색으로, 내부 가능한 세균은 녹색 나타납니다. 눈으로 외부 생존 할 내부 생존 할 외부 가능한, 내부 가능한 박테리아의 수를 계산합니다.
11. 외부 박테리아의 총 수 (기준 외부 생균의 수를 분할함으로써 외부 생균의 퍼센트를 계산 가능한 플러스 nonvi수). 내부 박테리아의 총 수 (가능한 플러스 생존 불가능한) (도 4)에 의해 내부의 생균 수를 나눔으로써 내부 생균의 퍼센트를 계산한다.
12. 이 프로토콜을 사용하여 수행 할 수있는 두 가지 중요한 컨트롤이 있습니다. 첫째, 모든 생존 할 박테리아의 propidium 요오드화 양성과 모든 살아있는 박테리아가 SYTO9 양성임을 확인합니다. (모든 호스트 세포의 부재) 박테리아의 중간 대수 문화> 95 % SYTO9 양성해야한다. N.의 중간 로그 문화는 그림 2에 보이는 임질은 라이브 / 죽은 염색 용액을 배양 (10에서 ⁸ 식민지 밀리리터 당 단위를 형성). 둘째, 요오드화 프로피 듐 및 SYTO9 모두 permeabilized, 감염된 숙주 세포를 입력 할 수 있음을 확인합니다.
    1. 죽은 박테리아의 인구를 생성하려면, 1.5 ML의 microfuge 튜브의 단위를 형성하는 2 × 10 ⁸ 세균성 식민지를 수집, 70 % 이소프로판올을 추가하고 10 분 동안 앉아있다. 의 microfuge에 박테리아 펠렛차 잔류 이소프로판올을 제거하기 위해 PBS에 두 번 박테리아를 씻어. 1.7 - 다음에 따라 프로토콜은 1.5 단계를 반복합니다. 유리 슬라이드에 세균 현탁액의 5 μl를 추가하고 coverslip에와 오버레이. 프로토콜 단계 1.9에서와 같이 이미지 샘플. 이러한 조건에서, 인구의 100 %의 propidium 요오드화 양성 (그림 2)이어야한다. 일부 세균 종에 요오드화 프로피 듐 완전히 SYTO9 염색을 압도하지 않으며, 생존 할 박테리아는 황색 또는 오렌지 나타날 수 있습니다.
    2. 호중구와 같은 식세포를 들어, 이소프로판올 - 살해 박테리아 세포를 노출하고 세포 내 박테리아의 100 %의 propidium 요오드화 양성 (그림 3)되어 있는지 확인하십시오. 죽은 박테리아를 내면화하지 않을 수 있습니다 nonphagocytic 세포의 경우, 아 지드 화 나트륨 또는 이전에 라이브 / 죽은 염색 솔루션을 추가하는 다른 세포 투과 항균제에 감염된 세포를 치료하기에 충분할 수있다.

2. SYTOX GREE와 평가 세균의 생존n 및 DAPI

1. 라벨 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 모스의 정의 매체 ^(25)에서 10 ㎍ / ㎖의 DAPI와 관심의 박테리아.
2. DAPI 표지 박테리아와 24 - 웰 플레이트에있는 12 mm 직경의 원형 유리 커버 슬립에 부착되어 세포를 감염. 알데히드 또는 유기 용제로 세포를 고정하지 마십시오.
3. MOPS / _MgCl2를 한 번 세포를 _씻어.
4. 외부 세균을 검출하기 위해, MOPS / MgCl2를 _2, 관심의 세균 종에 결합 알렉사 플 루어 647-결합 항체 또는 렉틴과 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 세포를 품어. 제안 컨트롤 프로토콜 단계 1.3에서 참고 사항을 참조하십시오.
5. 기음 세포에서 미디어와는 MOPS / _MgCl2를 0.5 ml의 0.4 μM SYTOX 녹색을 추가합니다.
6. 어둠 속에서 실온에서 5 분 동안 세포를 배양한다.
7. MOPS / _MgCl2를 셀을 두 번 씻어.
8. 5 분 MOPS / _MgCl2를 세포를 한 번 씻으십시오.
9. 형광 현미경으로 30 분 이내의 이미지를 획득. 현미경, 디지털 카메라, 및 수집 소프트웨어의 설명 프로토콜 단계 1.9를 참조하십시오.

참고 : 알렉사 플 루어 647에서 형광이 590 여기 파장 필터를 사용하여 감지되었습니다 - 650 ㎚, 663의 발광 필터 - 735 nm의, 거짓 색 빨간색입니다. 495 ㎚, 515의 방출 필터 - - 555 nm의 SYTOX 녹색에서 형광 465의 여기 파장 필터를 이용하여 검출 하였다. 375 ㎚, 400 ㎚의 장벽 필터 - DAPI에서 형광은 355 여기 파장 필터를 사용하여 검출되었다.

10. 이 프로토콜은 외부 생존 할 박테리아가 녹색 + 빨강 이미지가 나타날 발생합니다 내부 생존 할 박테리아가 파란색 + 녹색 표시, 외부 가능한 박테리아는 파란색 + 빨간색 표시, 내부 가능한 박테리아는 (그림 4) 블루 나타납니다. 프로토콜 인트의 설명에 따라 외부 및 내부 세균의 비율을 정량화P 1.11.
11. 프로토콜 단계 1.12에 기재된 제어 DAPI / SYTOX 녹색 염료 조합 (도 2 및 3)으로 수행되어야한다.

3. 세포 내 현지화 외에도 세균 생존 능력을 평가

1. 라벨 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 모스의 정의 중간에 10 ㎍ / ㎖의 DAPI와 관심의 박테리아.
2. DAPI 표지 박테리아와 24 - 웰 플레이트에있는 12 mm 직경의 원형 유리 커버 슬립에 부착되어 세포를 감염. 알데히드 또는 유기 용제로 세포를 고정하지 마십시오.
3. MOPS / _MgCl2를 한 번 세포를 _씻어.
4. 외부 세균을 검출하기 위해, MOPS / MgCl2를 _2, 관심의 세균 종에 결합 알렉사 플 루어 647-결합 항체 또는 렉틴과 어둠 속에서 실온에서 10 분 알을 품다. 제안 컨트롤 프로토콜 단계 1.3에서 참고 사항을 참조하십시오.
5. 기음 세포에서 미디어와 세포 두 TI 린스MOPS / MgCl2를 _{2 MES.}
6. 0.2 %의 사포닌을 포함 MOPS / MgCl2를 _2, 20 분에 대한 관심의 세포 내 마커에 대한 알렉사 플 루어 555-결합 항체와 세포를 품어.
7. MOPS / _MgCl2를 셀을 두 번 씻어.
8. 5 분 MOPS / _MgCl2를 세포를 한 번 씻으십시오.
9. 기음 세포에서 미디어와는 MOPS / _MgCl2를 0.4 μM SYTOX 녹색을 추가합니다.
10. 어둠 속에서 실온에서 세포에게 5 분을 품어.
11. MOPS / _MgCl2를 셀을 두 번 씻어.
12. 5 분 MOPS / _MgCl2를 세포를 한 번 씻으십시오.
13. 형광 현미경에 30 분 이내에 슬라이드의 이미지를 획득. 현미경, 디지털 카메라, 및 수집 소프트웨어의 설명 프로토콜 단계 1.9를 참조하십시오.

참고 : 알렉사 플 루어 647에서 형광이 590 여기 파장 필터를 사용하여 감지되었습니다 - 650 nm의 663의 방출 필터 - 735 nm의, 거짓 색 보라색입니다. 형광 F580 ㎚, 600의 방출 필터 - - 660 nm의 ROM 알렉사 형석 555은 540의 여기 파장을 가진 필터를 사용하여 검출 하였다. 495 ㎚, 515의 방출 필터 - - 555 nm의 SYTOX 녹색에서 형광 465의 여기 파장 필터를 이용하여 검출 하였다. 375 ㎚, 400 ㎚의 장벽 필터 - DAPI에서 형광은 355 여기 파장 필터를 사용하여 검출되었다.

14. 이 프로토콜은 외부 생존 할 박테리아가 녹색 + 보라색 이미지가 나타날 발생합니다 내부 생존 할 박테리아가 파란색 + 녹색 표시, 외부 가능한 박테리아가 파란색 + 보라색 표시, 내부 가능한 박테리아는 파란색 표시하고, 세포 내 단백질 (그림 4) 빨간색이 나타납니다. 프로토콜의 설명에 따라 외부 및 내부 가능한 박테리아의 PERECENT 1.11 단계를 정량화.
15. 프로토콜 단계 1.12에 기재된 제어 DAPI / SYTOX 녹색 염료 조합 (도 2 및 3)으로 수행되어야한다.
16. 에실행 가능하고 생존 할 박테리아를 계산에 추가, 관심의 세포 내 마커 colocalization을 긍정적이거나 부정적인 각 박테리아를 분류합니다.
17. 생균의 전체 숫자로 colocalized 생균의 수를 분할함으로써 세포 내 마커 colocalized 생균의 퍼센트를 계산한다. 생존 불가능한 박테리아의 총 수에 의해 생존 할 colocalized 박테리아의 수를 분할함으로써 세포 내 마커 colocalized 생존 불가능한 박테리아의 퍼센트를 계산한다.

결과

설명 된 프로토콜은 N.의 생존을 검사하는 데 사용되었다 임질은 인간의 기본에 노출 된 후 ^5,26를 호중구. 호중구는 N. 감염된 임질 및 녹색 형광 생존력 염료 SYTO9 및 빨간색 형광 프로피 디움 아이오다 이드 (도 4A)를 사용하여, 한 프로토콜로 처리. 염료는 우선적으로 숙주 세포의 원형질막 아닌 N.을 투과하는 콜레스테롤 sequesters는 사포닌의 ?...

토론

DNA는 인간의 세포와 내부에 부착 된 라이브 및 죽은 박테리아를 식별 할 수있는 형광 렉틴과 함께 결합과 생존의 염료를 사용하는 두 개의 프로토콜은 여기에서 소개하고 있습니다. 두 프로토콜 효과적으로 사균의 라이브 판별하기 때문에, 사용하는 프로토콜의 선택은 실험의 목표에 의존한다. 제 1 프로토콜은 생존 불가능한 박테리아 그대로 박테리아를 검출하는 SYTO9를 검출 프로피 듐 요오다 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection	Becton Dickinson	367251
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml	Becton Dickinson	366480
Sterile water for irrigation	Baxter	07-09-64-070
Dextran 500	Sigma	31392
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S641
Dextrose	Ricca Chemical Company	RDCD0200
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+	Thermo Scientific	SH3002802
Ficoll solution	GE Healthcare	17-1440-03
Acetic Acid	Fisher Scientific	BP2401
12 mm circular glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
24-well plates	Corning Incorporated	3524
Pooled Human Serum	Sigma	S7023
RPMI	Mediatech	15-040-CV
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH3007103
Human interleukin-8	R&D Systems	208-IL/CF
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Propidium Iodide	Life Technologies	L7007 or L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 or L7012
Saponin	Fluka Analytical	47036
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
Mouse anti-CD63	Developmental Studies Hybridoma Bank	H5C6
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit	Life Technologies	A20187
Hemacytometer Bright Line	Hausser Scientific	1492
Forceps	EMS	78320
Sorvall Legend RT + Centrifuge	Thermo Scientific	75004377