بروتوكولات لتنفيذ و<em&gt; كولاي</em&gt; وبناء خلية الحرة TX-TL نظام التعبير عن علم الأحياء الاصطناعية

Summary

يحدد هذا البروتوكول لمدة خمسة أيام كل الخطوات والمعدات والبرمجيات اللازمة تكميلية لخلق وتشغيل فعال الذاتية القولونية يستند TX-TL نظام التعبير خالية من الخلايا من الصفر. مع الكواشف، وبروتوكول يأخذ 8 ساعات أو أقل لإعداد رد فعل، وجمع، ومعالجة البيانات.

Abstract

ويمكن لنظم التعبير خالية من الخلايا مثالية نظريا محاكاة بيئة الخلوية في الجسم الحي في رقابة في منصة المختبر. ¹ وهذا مفيد للتعبير عن البروتينات ودوائر الوراثية في الطريقة التي تسيطر عليها فضلا عن توفير بيئة النماذج الأولية للبيولوجيا الاصطناعية. ^2،3 لتحقيق هذا الهدف الأخير، ونظم التعبير خالية من الخلايا التي تحافظ على آليات النسخ الترجمة الذاتية كولاي هي قادرة أن تعكس بشكل أكثر دقة في الجسم الحي ديناميات الخلوية من تلك القائمة على الحمض النووي الريبي بوليميراز T7 النسخ. نحن تصف إعداد وتنفيذ وكفاءة الذاتية E. القولونية يستند النسخ الترجمة (TX-TL) خالية من الخلايا نظام التعبير التي يمكن أن تنتج كميات من البروتين كما تعادل النظم القائمة T7-في خفض التكاليف 98٪ إلى النظم التجارية مشابهة. ^4،5 إعداد مخازن واستخراج خلية الخام وصفها، وكذلك تنفيذا لثلاثة أنبوب TX-TL رد الفعل. بروتوكول كامل يستغرق خمسة أيام لإعداد وينتج ما يكفي من المواد لمدة تصل إلى 3000 ردود فعل واحد في التحضير واحد. مرة واحدة على استعداد، ويأخذ كل رد فعل أقل من 8 ساعة من الإعداد لجمع البيانات وتحليلها. آليات التنظيم والنسخ الخارجية إلى E. القولونية، مثل repressors أمريكا اللاتينية والكاريبي / تيت وT7 RNA البلمرة، يمكن أن تستكمل. ⁶ الخصائص الذاتية، مثل مرنا ومعدلات تدهور الحمض النووي، كما يمكن تعديلها. ⁷ وقد تجلى هذا النظام حرية التعبير خلايا TX-TL لواسع تتوفر الجمعية على نطاق الدائرة، واستكشاف الظواهر البيولوجية، والتعبير عن البروتينات في إطار كل من المروجين T7 والذاتية. ^6،8 النماذج الرياضية المصاحبة. ^9،10 النظام الناتجة لها تطبيقات فريدة من نوعها في مجال البيولوجيا التركيبية وبيئة النماذج، أو "TX- TL الجزيئية البيولوجية اللوح ".

Introduction

بدأت التكنولوجيا التعبير خالية من الخلايا في 1950s باعتبارها متعدية بحتة، والنهوض بعد سنوات لتشمل آليات النسخ الترجمة يقترن باستخدام الحمض النووي البكتيريا T7. ^11،12 ومنذ ذلك الحين، بذلت جهود عديدة لتحسين إنشاء خلية استخراج الخام (أو E وتشمل. استخراج القولونية S30). ^13،14 هذه التحسينات إطالة تخليق البروتين خالية من الخلايا من خلال تجديد ATP أو تعديلات السلالة، وتقليل الوقت والتكلفة بروتوكول. موجودة ^15-17 نظم التعبير خالية من الخلايا البديلة التي أعيد استخدام مكونات بدلا من النفط الخام وقد وضعت استخراج خلية للتعبير. ⁵ كلا استخراج خلية الخام وأساليب إعادة للاستخدام التجاري.

مع ظهور علم الأحياء الاصطناعية، وهناك حاجة متزايدة لمنصة تتميز جيدا لاختبار والتعبير عن وحدات ودوائر البيولوجية هندسيا. ^18،19 يجب أن تكون هذه المنصةتنوعا، يتميز بشكل جيد، وسهلة التعامل معها، وتركز على مكونات الموفر من قبل المستخدم. على الرغم من كونها وضعت نصف قرن في وقت سابق، وأنظمة خالية من الخلايا استنادا إلى E. القولونية مشاركة في جوهرها هذه المتطلبات، كما هي مبسطة في التمثيل المختبر من العمليات الخلوية دون تعقيد النمو والأيض. بالإضافة إلى ذلك، كل من المعرفة التأسيسية من العمل في الجسم الحي على E. ينطبق القولونية E. بسهولة ل نظم خالية من الخلايا القولونية.

على الرغم من أن أنظمة التعبير خالية من الخلايا يمكن أن تكون لها تطبيقات في مجال البيولوجيا الاصطناعية، وحتى الآن الهدف من معظم النظم التعبير خالية من الخلايا كان تعظيم العائد من البروتين والأيض. ويتم إنجاز هذا باستخدام البكتيريا T7 النسخ من تسلسل يقودها المروجين T7 ²⁰ على الرغم من أن التعبير هو كفاءة وقوية، وهذه النظم تخدم غرضا درجة عالية من التخصص. طرق تنظيم خلية محدودة، ويجب أن تكون قوالب الحمض النووي المستهدفصياغتها لتشمل المروجين T7، وبعض متواليات مثل المجمعات الريباسي لا يمكن نسخها وتجميعها. ^21،22 نظم التعبير خالية من الخلايا الموجودة غير قادرة على الحفاظ على عوائد عالية مع الحفاظ على الآليات التنظيمية الذاتية، وبراعة اللازمة للبيولوجيا الاصطناعية.

قمنا بتطوير E. الذاتية القولونية خالية من الخلايا نظام التعبير الذي يحافظ على كفاءة البروتين التعبير يتبين من الأنظمة السابقة ولكنها تضيف براعة إضافية من خلال السماح التعبير والتنظيم على أساس كل من (T7 أو غيرها) آليات الداخلية والخارجية. بروتوكول الموصوفة هنا يستند أصلا على Kigawa وآخرون (2004) وليو وآخرون (2005)، ولكن لديه تعديلات كبيرة. فإنه يستخدم المغنيسيوم وK-الغلوتامات على المغنيسيوم وK-خلات لزيادة الكفاءة، ويزيل 2 المركابتويثانول، وlyses الخلايا باستخدام حبة الخافق. يتم اختيار ^17،23،24 الخرزة ضرب على التجانس،على أساس أساليب الضغط، أو صوتنة بسبب انخفاض تكلفة وعائدات مماثلة لأنظمة المتنافسة. يستخدم حمض ²³ 3 phosphoglyceric (3-PGA) كمصدر للطاقة كما وجد أن تعطي غلة البروتين متفوقة بالمقارنة مع فوسفات الكرياتين و الفسفوإينول. ^4،25 نظامنا يمكن ان تنتج ما يصل الى 0.75 ملغ / مل من البروتين مراسل باستخدام إما المروج القائم على sigma70 مع مشغلي امدا فج أو المروج T7 يحركها، مماثلة لغلة من الأنظمة التجارية الأخرى. ^4،6 خمسة أيام هناك حاجة لانتاج جميع الكواشف اللازمة (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، فإنه يوفر خفض التكاليف 98٪ بالمقارنة مع أنظمة مماثلة خالية من الخلايا التجارية - التكاليف المادية هي 0،11 $ لكل 10 ميكرولتر رد فعل، والتي ترتفع إلى 0،26 $ مع تضمين العمل (الشكل 2).

Protocol

1. إعداد استخراج خلية الخام

إعداد استخراج خلية الخام على مدى ثلاثة أيام يتطلب شخصين للقيام بكفاءة. بروتوكول يتكون ظيفيا من ثلاثة أجزاء: نمو ثقافة (الخطوة 1.1 إلى الخطوة 1.11)، تحلل الخلية (الخطوة 1.12 إلى الخطوة 1.37)، واستخراج التوضيح (الخطوة 1.38 إلى الخطوة 1.52). تقديمه مقسمة إلى أيام للراحة. استخراج مثالية يمكن أن تنتج 0.75 ملغ / مل من deGFP من البلازميد pBEST-OR2-OR1 والعلاقات العامة، UTR1-deGFP-T500 (Addgene # 40019)، ويحتوي على نسبة استخراج خلية الخام بين 27-30 ملغ / مل من البروتين. ⁴ ومع ذلك ، وخصائص استخراج تختلف من دفعة لدفعة واحدة. الوصفة التالية لوازم يكفي لحوالي 3،000 ردود الفعل واحد (6 مل استخراج خلية الخام). إذا تقليص، فمن المستحسن استخدام ما لا يقل عن 1/6 من القيم المعطاة هنا. نظرا لضيق الوقت، وزيادة نطاق غير مستحسن.

يوم 1

1. إعداد وسائل الإعلام ثقافة البكتيرية، طريق مسدودلوحة تلح، وسائل الإعلام المكملات كما هو موضح في الجدول رقم 1. انظر المواد التكميلية 1 عن وصفات.
2. . خط BL21-Rosetta2 سلالة من -80 ° C على لوحة أجار 2xYT + P + سم واحتضان لمدة لا تقل عن 15 ساعة عند 37 درجة مئوية أو حتى المستعمرات مرئية بسهولة ملاحظة: يتم استخدام الكلورامفينيكول (سم) لتحديد لالبلازميد ترميز tRNAs نادرة في سلالة BL21-Rosetta2.

يوم 2

3. إعداد مخازن والمكملات الغذائية كما هو موضح في الجدول رقم 2. انظر المواد التكميلية 1 عن وصفات.
4. إعداد وتعقيم المواد المطلوبة ليوم 3، بما في ذلك: 6 × 4 قوارير مخروطي L مع غطاء رقائق الألومنيوم (تعقيمها)، 4 × 1 L زجاجات معقمة الطرد المركزي، قمع (تعقيمها)، و 100 غرام من حبات 0.1 ملم الزجاج (تعقيمها)، 2 اثارة بين القضبان (تعقيمها)، 1 لتر و 500 مل تخرج اسطوانة (تعقيمها)، 2 × 1 L الأكواب (تعقيمها)، 3 مل المحاقن مع الإبر 18 G (العقيمة)، 2-3 فلوريداالعوامات الشوفان، 2-3 10K MWCO أشرطة غسيل الكلى (العقيمة)، cuvettes.
5. إعداد مصغرة الثقافة 1. إضافة 4 مل من وسائل الإعلام 2xYT + P و 4 ميكرولتر من سم إلى 12 مل العقيمة أنبوب الثقافة وما قبل الحارة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
6. تطعيم مصغرة الثقافة 1 مع مستعمرة من 2xYT + P + لوحة أجار سم. احتضان عند 220 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية لمدة 8 ساعة.
7. 7 ساعة و 30 دقيقة في وقت لاحق، وإعداد مصغرة الثقافة 2. إضافة 50 مل من وسائل الإعلام 2xYT + P و 50 ميكرولتر من سم إلى قارورة معقمة 250 مل مخروطي وقبل الدافئة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
8. تطعيم مصغرة الثقافة 2 مع 100 ميكرولتر من ثقافة مصغرة 1 واحتضان عند 220 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية لمدة 8 ساعة.

يوم 3

9. تزن أربعة الفارغة العقيمة 50 مل أنابيب فالكون وسجل الشامل في الجدول 3. هدئ أنابيب فالكون على الجليد، وهذه ستستخدم فيما بعد في خطوة 1.18.
10. 7 ساعة و 30 دقيقة بعد الخطوة 1.8، وإعداد النهائي سائل الإعلام والثقافة البكتيرية. باستخدام العقيمة 1 L تخرج اسطوانة، ونقل 660 مل من 2xYT + P وسائل الاعلام طn لكل ستة 4 قوارير مخروطي L وقبل الدافئة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ملاحظة: 4 L أو أكبر ينصح قوارير مخروطي للتهوية المناسبة.
11. إضافة 6.6 مل من ثقافة مصغرة 2 في كل 4 L مخروطي قارورة. احتضان عند 220 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية حتى تصل ثقافة والتطوير التنظيمي من 1.5-2.0 في 600 نانومتر (الموافق مرحلة النمو منتصف سجل). تحقق OD دوريا مع التخفيف 01:10 الثقافة للتأكد من دقتها هذه الخطوة ولا يجب أن تستغرق أكثر من ساعة 3 - 3 ساعة 45 دقيقة؛ السريعة النمو وجمع خلال مرحلة منتصف السجل هو أمر حاسم لاستخراج الجودة.
12. مباشرة بعد النمو، ونقل جميع الثقافات بالتساوي إلى أربع زجاجات الطرد المركزي 1 L وأجهزة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 12 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير الخلايا البكتيرية.
13. بينما الطرد المركزي، واستكمال إعداد S30A العازلة بإضافة 4 مل من 1 M DTT إلى 2 L من معدة مسبقا S30A. مزيج والحفاظ عازلة على الجليد.
14. عندما يتم الانتهاء الطرد المركزي، إزالة طاف من الخطوة 1.12 بواسطة عشاريnting والنشاف الزجاجات الطرد المركزي على منشفة ورقية معقمة.
15. إضافة 200 مل من العازلة S30A في 4 درجات مئوية على كل من أجهزة الطرد المركزي زجاجات الأربعة، ويهز الزجاجات بقوة حتى يتم solubilized بيليه تماما مع عدم وجود كتل المتبقية. أجهزة الطرد المركزي في زجاجات الأربعة في 5،000 ز لمدة 12 دقيقة في 4 درجات مئوية.
16. تماما إزالة طاف من الخطوة السابقة الصب والنشاف الزجاجات الطرد المركزي على منشفة ورقية معقمة.
17. كرر الخطوات من 1.15 و1.16.
18. إضافة 40 مل S30A العازلة عند 4 درجة مئوية إلى كل زجاجة الطرد المركزي. . نقل كل بيليه ومزيج S30A في أنبوب فالكون المبردة من 1.9) ملاحظة: هذه الخطوة هو نقل الكريات في وعاء أصغر.
19. أجهزة الطرد المركزي أنابيب فالكون في 2،000 ز لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف بواسطة الصب.
20. إعادة الطرد المركزي أنابيب فالكون في 2،000 ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية. تماما إزالة طاف المتبقية عن طريق ماصة. الحفاظ على الجليد.
21. وزن وأنابيب فالكون لدينا مع بيليه وسجل الشامل في الجدول 3. حساب كتلة بيليه، S30A حجم المخزن المؤقت الحاجة، وكتلة من الخرز اللازمة استنادا إلى صيغ محددة في الجدول 3.
22. الصحيح التحميل وحبة ضرب بيليه أمر بالغ الأهمية لجعل استخراج الجودة، وهي الخطوة الأكثر تحديا. فمن المستحسن مراجعة الفيديو قبل محاولة. وفشل لتجنب فقاعات الهواء وتوزيع الخرز بالتساوي يؤدي إلى استخراج فعالة.
23. إضافة كمية من العازلة S30A المحسوبة في الجدول 3 إلى كل أنبوب فالكون، دوامة حتى متجانسة، والعودة إلى جليد.
24. مع الحفاظ على أنابيب فالكون الأخرى على الجليد، إضافة الخرز بشكل متقطع إلى أنبوب فالكون واحد في ثلاثة مأخوذة، كل باستخدام 1/3 من مجموع الخرز. بعد إضافة كل قسامة من الخرز، ودوامة لمدة 30 ثانية. وضع أنبوب فالكون على الجليد بين خطوات دوامة وبعد دوامة النهائي. بعد إضافة قسامة الماضي، وضمانوتوزع حبات موحد. يجب أن يتم تشكيل عجينة سميكة.
25. إعداد 5 مل (حجم) ماصة غيض بقطع نهاية باستخدام شفرة حلاقة معقمة لخلق 3-4 مم الافتتاح. اطلب ماصة إلى 2 مل ملاحظة: مجموعات مختلفة ماصة ونصائح توفير كميات مختلفة من الشفط التي قد لا تكون كافية لسحب والافراج سميكة حل خلية حبة؛ غيض ماصة 1 مل مع إزالة نهاية يمكن استخدامها بدلا.
26. وضع 20 حبة أنابيب ضرب على الجليد.
27. التحقق من اللزوجة العالية من حل خلية حبة باستخدام الماصة تعديل. يجب أن تكون لزجة لدرجة لا تكاد تخرج من طرف ماصة أثناء قذف. إذا لزج جدا، وإعادة ضبط ماصة طرف وفقا للخطوة 1.25. إن لم يكن لزجة بما فيه الكفاية، يمكن أن تضاف حبات في الزيادات من (بيليه الشامل * 0.05)، الى كتلة أقصاها (بيليه الشامل * 5.1). بعد كل إضافة من الخرز، ودوامة لمدة 30 ثانية والعودة إلى جليد. انظر الشكل 3A لمظاهرة من اللزوجة.
28. إزالة حل خلية حبة من أنبوب فالكون باستخدام الماصة تعديل، ونقل إلى أنبوب العقيمة الضرب حبة، وملئه ثلاثة أرباع الكامل مع حل خلايا حبة. تدور لفترة وجيزة للغاية (1S) على عداد مصغرة الطرد المركزي لإزالة فقاعات الهواء من دون إعادة توزيع الخرز. أنظر الشكلين 3B-د للصور الثابتة من أنبوب حبة الضرب التحميل.
29. الانتهاء من إضافة حل خلية حبة لتشكيل الغضروف المفصلي مقعرة.
30. إضافة قطرة صغيرة جدا من حل خلية حبة على الجهة الداخلية من غطاء أنبوب حبة الضرب، والحرص على ألا تعوق الشفة خارج الغطاء، وإلا، لن أنبوب الضرب حبة بالقرب ذلك كافيا ذ. اضغط على غطاء على سطح مستو والتحقق من عدم وجود فقاعات الهواء في الجزء السفلي من الغطاء.
31. سقف أنبوب الضرب حبة مع غطاء لضرب حبة من الخطوة السابقة. يد لمساعد لحبة الضرب. إذا فعلت بشكل صحيح، يجب أن تكون مختومة الغطاء بإحكام، شول عدم وجود فقاعات الهواءد أن تكون واضحة، والقليل (إن وجدت) حل خلية حبة ينبغي تجاوز. إعادة عملية التحميل إذا فقاعات الهواء مرئية أو لا سقف ليست قريبة بشكل كامل.
32. دوامة أنبوب فالكون من الخطوة 1.24 مع حل خلية حبة المتبقية لضمان التوزيع حتى من الخرز. كرر الخطوات 1،28-1،31 حتى أنبوب فالكون فارغة، ثم كرر الخطوات 1،24-1،31 لكل أنبوب فالكون إضافية.
33. سلوك الخطوات 1،33-1،38 في وقت واحد. وقد تأخذ مساعد شغل الأنابيب من 1.31-بفوزه على حبة ومكان على الجليد. مرة واحدة وقد تم جمع اثنين شغل أنابيب الضرب حبة وكانت على الجليد لمدة دقيقة واحدة على الأقل، تبدأ حبة الضرب.
34. فاز أنبوب واحد لمدة 30 ثانية في 46 دورة في الدقيقة. وضع رأسا على عقب على الجليد لمدة 30 ثانية في حين ضرب أنبوب أخرى.
35. كرر الخطوة السابقة بحيث تملأ كل أنبوب حبة الضرب وقد فاز لمدة 1 دقيقة المجموع.
36. كرر الخطوات 1،33-1،35 حتى 8 تملأ أنابيب حبة الضرب (أو الحد الأقصى للمبلغ أجهزة الطرد المركزي يمكن أن تعقد) حافي تم تجهيزها. ثم، وبناء جهاز فلتر من 15 مل فالكون (الشكل 3E). إضافة كاب بفوزه على حبة جديدة، مسطحة جزء الوجه لأعلى، إلى أسفل 15 مل فالكون. ثم قم بإزالة الغطاء من معالجتها أنبوب حبة الضرب والصحافة العمود الدقيقة اللوني بشدة على نهاية معالجتها أنبوب حبة الضرب حتى مغلقة تماما. المفاجئة قبالة نهاية شطف من العمود اللوني الصغيرة، ووضع العمود الدقيقة اللوني، وإنهاء شطف أسفل، في أنبوب فارغ حبة الديكور. وضع هذا المجمع في 15 مل فالكون. أكرر للجميع 8 تملأ أنابيب الضرب حبة؛ الحفاظ على الجليد عندما كاملة.
37. 8 أجهزة الطرد المركزي فلتر، فالكون أنبوب لم يسبق لهم اللعب في 6،000 غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لفصل واستخراج وبيليه من الخرز.
38. تحقق أنتجت كل أنبوب حبة الضرب استخراج قابلة للحياة. سوف انتزاع فوز صحيح لا يكون عكر، وسوف يكون بيليه طبقتين متميزة. تجاهل كافة أنابيب العكرة، ونقل طاف من الأنابيب غير عكر طالفردية n ل1.75 مل أنابيب الطرد المركزي الصغيرة، مع بيليه أقل قدر ممكن. الحفاظ على الجليد حتى يتم معالجة كافة أنابيب الضرب حبة. انظر الشكل 3F مقارنة أنبوب حبة ضرب معالجتها بشكل صحيح مقابل بشكل غير صحيح.
39. أنابيب الطرد المركزي الصغيرة الطرد المركزي من الخطوة السابقة في 12،000 ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
40. نقل خالية من بيليه طاف في أنابيب فارغة حبة الضرب باستخدام الماصة، وتوطيد 500 ميكرولتر في أنبوب الضرب حبة جديدة.
41. احتضان الخطوة السابقة، مع قبعات-الضرب حبة إزالتها، في 220 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية لمدة 80 دقيقة. هذه الخطوة يساعد على هضم الأحماض النووية المتبقية باستخدام exonucleases الذاتية صدر أثناء عملية حبة الديكور، ويمكن أن يتم ذلك من خلال الوقوف أنبوب حبة الضرب حتى في أنبوب زراعة الأنسجة.
42. إعداد مواد لغسيل الكلى. كاملة S30B إعداد العازلة بإضافة 2 مل من 1 M DTT إلى 2 L من معدة مسبقا S30B. خلط وإضافة 900 مل في كل من اثنين من شارعerile 1 L الأكواب. إضافة محرك مغناطيسي العقيمة في كل كوب، تبقي على 4 درجات مئوية.
43. بعد الخطوة 1.41، يجب أن ننظر استخراج عكر. تعزيز استخراج إلى 1.5 مل مأخوذة في 1.75 مل أنابيب الطرد المركزي الصغيرة، وأجهزة الطرد المركزي في 12000 ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
44. باستخدام الماصة، وتوطيد خالية من بيليه طاف في 15 مل أنابيب فالكون على الجليد، ومزيج جيد من قبل متوجا الأنبوب وقلب. وفر 10 ميكرولتر من طاف على الجليد لخطوة 1.47.
45. تحديد المبلغ الإجمالي للاستخراج المنتجة، وترطيب العدد اللازم من 10K MWCO أشرطة غسيل الكلى عن طريق الغمر في S30B لمدة 2 دقيقة، على افتراض 2.5 مل من مستخلص في الكاسيت.
46. تحميل أشرطة مع 2.5 مل من استخراج. كل دورق يمكن أن يستغرق فترة تصل الى 2 أشرطة؛ dialyze، واثارة، في 4 درجة مئوية لمدة 3 ساعة ملاحظة: التحميل الجزئي للأشرطة غير مقبولة. Dialyzing يزيد البروتين العائد الإنتاج.
47. خلال الخطوة السابقة، تميز بروتين مستخلصتركيز مع مقايسة برادفورد، وذلك باستخدام مستخلص بحفظه في الخطوة 1.44. انظر المواد التكميلية 2 لمزيد من التفاصيل.
48. بعد اكتمال غسيل الكلى، واستخراج قسامة بنسبة 1.5 مل في 1.75 مل أنابيب الطرد المركزي الصغيرة. أجهزة الطرد المركزي في 12،000 ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. ستشكل A بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
49. توطيد طاف واضحة من الخطوة السابقة من قبل pipetting في أنبوب فالكون 15 مل على الجليد. التجانس بواسطة قلب 5-10X.
50. على أساس تركيز يحدده برادفورد في الخطوة 1.47، وتحديد كمية استخراج لقسامة إلى 1.75 مل أنابيب الفردية. يجب أن يكون لكل فرد أنبوب حجم مع 810-900 ملغ من البروتين الكلي. يجب أن يكون استخراج تركيز البروتين الكلي أكبر من 27 ملغ / مل. هذه الخطوة تتطلب المساعدة لإجراء عاجلا ملاحظة: استخراج قسامة أقل من 30 ملغ / مل في 30 ميكرولتر مأخوذة، وعلى نطاق وإذا تركيز أعلى، على سبيل المثال، استخراج قسامة في 28 ملغ / مل بنسبة 30 ميكرولتر، واستخراج قسامة في 32ملغ / مل بنسبة 28.1 ميكرولتر.
51. استخراج قسامة التالية الخطوة 1.50، مع الحرص على تجنب الفقاعات. استخراج فلاش تجميد في النيتروجين السائل ملاحظة: مأخوذة مع فقاعات يمكن إزالتها عن طريق الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية.
52. إزالة أنابيب من النيتروجين السائل باستخدام مصفاة وتخزينها على الفور في -80 درجة مئوية. السلامة: ارتداء النظارات الواقية، وقبعات من استخراج أنابيب قد تؤتي ثمارها بسبب الفرق في درجة الحرارة بين النيتروجين السائل ودرجة حرارة الغرفة.

2. حمض أميني إعداد الحل

حمض أميني الحل يجب أن يكون مستعدا بكميات كبيرة. الوصفة التالية تستخدم واحدة طقم كامل من الأحماض الأمينية RTS سامبلر، وتوفير ما يكفي لحوالي 11،000 ردود الفعل واحد. إذا تقليص، فمن المستحسن استخدام ما لا يقل عن نصف عدة. ويتم تزويد كل الأحماض الأمينية في السهم عند 1.5 مل، 168 ملم، باستثناء يسين في 140 ملي. التشكيل النهائي من الأحماض الأمينية الحل هو:يسين، 5 ملي، جميع الأحماض الأمينية الأخرى، 6 ملم. هذا هو 4x وتركيز العمل.

1. إزالة جميع الأحماض الأمينية 20 من -20 درجة مئوية، وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. مرة واحدة إذابة، دوامة حتى تذوب الأحماض الأمينية، احتضان عند 37 درجة مئوية إذا لزم الأمر. بعد أن يتم حله الأحماض الأمينية، وطرح جميع الأحماض الأمينية على الجليد باستثناء الأسباراجين، الفنيل ألانين، والسيستئين، التي يتم الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة. السيستئين قد لا تذوب تماما.
2. على الجليد، إضافة 12 مل من الماء المعقم لالعقيمة 50 مل أنبوب فالكون.
3. إضافة 1.5 مل من كل الأحماض الأمينية بالترتيب التالي، مع الحرص على دوامة أنبوب فالكون بعد كل إضافة وللحفاظ على حل على الجليد: علاء، الارجنتين، الأسباراجين، ASP، GLN، غلو، الغليسين، صاحب، إيل، ليز، التقى، الفنيل ألانين، برو، سر، الثريونين، فال، التربتوفان، صور، لوي، السيستئين. يمكن إضافة السيستئين بمثابة تعليق. بعد بالإضافة إلى ذلك، الدوامة حتى الحل واضح نسبيا، احتضان عند 37 درجة مئوية إذا لزم الأمر. السيستئين قد لا تذوب تماما.
4. قسامة الأمينية حمض الحل في 50 أنابيب في26 ميكرولتر كل على الجليد. قسامة بقية في 500 ميكرولتر لكل أنبوب على الجليد. سيتم استخدام مأخوذة ميكرولتر 26 لمعايرة استخراج، في حين سيتم استخدام مأخوذة ميكرولتر 500 لإعداد العازلة. بينما aliquoting، دوامة الأسهم الرئيسي في كثير من الأحيان لتجنب التوزيع غير المتكافئ للتعليق.
5. مأخوذة تجميد فلاش في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية. السلامة: ارتداء النظارات الواقية، وقبعات من استخراج أنابيب قد تؤتي ثمارها بسبب الفرق في درجة الحرارة بين النيتروجين السائل ودرجة حرارة الغرفة.
6. اختياري: إجراء مقايسة النشاط من صنع حديثا الأحماض الأمينية الحل ضد متخذا حلول الأحماض الأمينية.

3. الطاقة إعداد الحل

ويستخدم الحل الطاقة سواء بالنسبة للمعايرة استخراج خلية الخام وخلق العازلة، وينبغي إعداد بكميات كبيرة. الوصفة التالية لوازم يكفي لحوالي 10000 ردود الفعل واحد. إذا تقليص، فمن recommended لاستخدام ما لا يقل عن 1/24 من القيم المعطاة هنا. كحل الطاقة هو التكلفة النقدية الهامة، يمكن للمستخدمين أول مرة تريد أن تعد في 1/24 الحجم. التشكيل النهائي من الحل هو الطاقة: HEPES الرقم الهيدروجيني 8 700 ملي، ATP 21 ملم، 21 ملم GTP، CTP 12.6 ملم، 12.6 ملم UTP، الحمض الريبي النووي النقال 2.8 ملغ / مل، 3.64 ملي جنة الزراعة، NAD 4.62 ملم، مخيم 10.5 ملم، الفولينيك حمض 0.95 ملم، 14 ملم سبيرمدين، 3-PGA 420 ملم. هذا هو 14X تركيز العمل. إذا رغبت في ذلك، يمكن تخزين كل بند على حدة في الجدول 4 في -80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.

1. إزالة جميع المواد الكيميائية في الجدول 4 من -80 درجة مئوية، -20 ° C، أو 4 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
2. إعداد الحلول الأسهم كما هو موضح في الجدول رقم 4. انظر المواد التكميلية 1 عن وصفات. وضع جميع الحلول على الجليد بعد التحضير.
3. في أنبوب فالكون 15 مل، إضافة بالترتيب التالي، مع الحرص على دوامة أنبوب فالكون بعد كل إضافة والحلول للحفاظ على سن الجليد: 3.6 مل 2 M HEPES، 144 ميكرولتر المياه، 1.39 مل النوكليوتيدات المزيج، 576 ميكرولتر 50 ملغ / مل الحمض الريبي النووي النقال، 576 ميكرولتر 65 ملي التميم، 276 ميكرولتر 175 ملي NAD، 170 ميكرولتر 650 ملي المخيم، 288 ميكرولتر حمض 33.9 ملي الفولينيك ، 144 ميكرولتر 1 M سبيرمدين، و3.09 مل 1.4 M 3-PGA.
4. الحل الطاقة قسامة في 50 الأنابيب في 7 ميكرولتر كل على الجليد. قسامة بقية في 150 ميكرولتر لكل أنبوب على الجليد. سيتم استخدام مأخوذة ميكرولتر 7 لمعايرة استخراج، في حين سيتم استخدام مأخوذة ميكرولتر 150 لإعداد العازلة. بينما aliquoting، دوامة الأسهم الرئيسي في كثير من الأحيان.
5. مأخوذة تجميد فلاش في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية. السلامة: ارتداء النظارات الواقية، وقبعات من استخراج أنابيب قد تؤتي ثمارها بسبب الفرق في درجة الحرارة بين النيتروجين السائل ودرجة حرارة الغرفة.
6. اختياري: إجراء مقايسة نشاط مصنوعة حديثا حلول الطاقة ضد متخذا حلول الطاقة.

4. إعداد العازلة

BUFيتطلب إعداد فر الانتهاء من استخراج الخام خلية إعداد والأحماض الأمينية إعداد الحل، والطاقة إعداد الحل. كل العازلة هي فريدة من نوعها لمجموعة من استخراج الخلايا الخام. MG-الغلوتامات، K-الغلوتامات، والتلفزيون الرقمي الأرضي (بهذا الترتيب) هي الأمثل في هذا القسم لإنتاج التفاعلات مع أقصى مستويات التعبير. يستخدم بروتوكول التالية قالب مكتوبة مسبقا، TXTL_e (قالب) _calibration_JoVE.xlsx (التكميلي مادة 3)، لمعايرة معدة سلفا استخراج الخلايا الخام، وإعداد العازلة. ومع ذلك، يمكن للمرء أيضا معايرة استخراج الخلايا الخام، وإعداد العازلة دون القالب عن طريق الاستفادة المثلى المغنيسيوم الغلوتامات، K-الغلوتامات، والتلفزيون الرقمي الأرضي يدويا وإقامة عازلة مثل ذلك جنبا إلى جنب مع استخراج، فمن 75٪ من حجم رد الفعل الكلي. إذا معايرة يدويا، ظروف التفاعل النهائي يمكن العثور عليها في الخطوة 5.

1. إكمال نموذج "البيانات العامة".
2. ذوبان الجليد على الجليد 100 ملي المغنيسيوم الغلوتامات (4 ° C)، 3 M K-الغلوتامات (4 ° C)، 6ملي الأحماض الأمينية الحل (26 ميكرولتر، -80 ° C)، حلول الطاقة (7 ميكرولتر، -80 ° C)، و 100 ملي DTT (-20 ° C)، DNA مراقبة إيجابية (-20 ° C)، و 40٪ PEG- 8000 (4 ° C)، واستخراج الخلايا الخام (-80 ° C)، والمياه (4 ° C) ملاحظة: استخدام 1 نانومتر تركيز العمل pBEST-OR2-OR1 والعلاقات العامة، UTR1-deGFP-T500 (Addgene البلازميد 40019) من أجل السيطرة الايجابية (الإثارة 485 نانومتر، 525 نانومتر الانبعاثات)، أو إشارة أخرى التي تنتج كثافة إشارة عالية. ⁴
3. إعداد سبعة 10.5 ميكرولتر ردود الفعل، واختبار مجموعة من 4-10 ملم إضافية المغنيسيوم الغلوتامات، من خلال مجموعة aliquoting كميات الأسهم المغنيسيوم الغلوتامات في أنابيب الفردية الصغيرة الطرد المركزي. ملاحظة: على الرغم من ردود الفعل 10.5 ميكرولتر مستعدون مبدئيا، فإن رد الفعل النهائي هو 10 ميكرولتر.
4. تحضير مزيج الرئيسي على النحو المبين في قالب تحت عنوان "المعايرة المغنيسيوم الغلوتامات"، مضيفا اضافي 80 ملم من K-الغلوتامات. الحفاظ على الجليد ودوامة بعد إضافة كل بند ملاحظة: القيم الواردة هنا وفي قالب وبالإضافة إلى كميات من المغنيسيوم-الغلوتامات، K-الغلوتامات، وDTT موجودة في المخزن المؤقت S30B تستخدم لجعل استخراج خلية الخام.
5. إضافة مزيج الرئيسي للعينات التي تحتوي على المغنيسيوم، الغلوتامات وإعداد ردود الفعل. نرى الخطوات 5،10-5،13 حصول على التعليمات المفصلة.
6. رد الفعل عند تشغيل 29 درجة مئوية، إما في حاضنة أو قارئ لوحة.
7. . تحديد أفضل تركيز المغنيسيوم الغلوتامات حسب مستوى نهاية التعبير ومعدل القصوى من البروتين التعبير (الشكل 4A) ملاحظة: أوقات التشغيل تختلف اعتمادا على التجربة ولكن عادة الماضي تحت 8 ساعة.
8. كرر الخطوات من 4،2-4،7 لK-الغلوتامات تحت عنوان "-K الغلوتامات المعايرة،" تحديد مستويات المغنيسيوم الغلوتامات لتلك التي وجدت في الخطوة 4.7.
9. كرر الخطوات من 4،2-4،7 لDTT تحت عنوان "DTT المعايرة،" تحديد مستويات المغنيسيوم الغلوتامات لتلك التي وجدت في الخطوة 4.7-K ومستويات الغلوتامات لتلك التي وجدت في الخطوة 4.8 ملاحظة: لقد وجدنا أن أضيف DTT لا يؤثر بشكل ملحوظ نهاية مستويات التعبير.
10. استعمالالقيم الموجودة في المعايرة تحت عنوان "تكوين الاحتياطي" لتحديد تكوين عازلة لتكون مستعدة. على أساس كمية من استخراج الخلايا الخام المنتج، ويتم إنتاج الماجستير مزيج صفة لمبلغ محدد من المخازن المؤقتة.
11. ذوبان الجليد مأخوذة على النحو الوارد في الماجستير مزيج صفة على الجليد. مرة واحدة إذابة، وإعداد مزيج الرئيسي، والحفاظ على الجليد وvortexing لبعد إضافة كل بند.
12. وذكر قسامة من قبل المبلغ في إطار "تكوين الاحتياطي". أنابيب عازلة فلاش تجميد في النيتروجين السائل. بينما aliquoting، دوامة الأسهم الرئيسي في كثير من الأحيان.
13. إزالة أنابيب من النيتروجين السائل باستخدام مصفاة وتخزينها على الفور في -80 درجة مئوية. السلامة: ارتداء النظارات الواقية، وقبعات من استخراج أنابيب قد تؤتي ثمارها بسبب الفرق في درجة الحرارة بين النيتروجين السائل ودرجة حرارة الغرفة.

5. تنفيذ التجريبية من رد الفعل TX-TL

ظروف التفاعل النهائية هي: 8،9-9،9 ملغ / مل المتواجدفي (من استخراج النفط الخام)، 4.5 ملم، 10.5 ملم المغنيسيوم الغلوتامات، 40-160 ملم K-الغلوتامات، 0،33-3،33 ملي DTT، 1.5 ملي كل الأحماض الأمينية باستثناء يسين، 1.25 ملي يسين، 50 ملي HEPES، 1.5 ملي ATP و GTP، 0.9 ملي CTP وUTP، 0.2 ملغ / مل الحمض الريبي النووي النقال، 0.26 ملي التميم، 0.33 ملي NAD، 0.75 ملي المخيم، 0.068 ملي حمض الفولينيك، 1 ملم سبيرمدين، 30 ملي 3-PGA، 2٪ PEG-8000. A TX الأساسية TL-رد فعل له 3 أجزاء (أنابيب): استخراج الخلايا الخام، العازلة، والحمض النووي. النسبة: 75٪ العازلة واستخراج، DNA 25٪ يمكن أن ردود الفعل تختلف في الحجم، ونحن نستخدم 10 ميكرولتر من قبل اتفاقية للحد من حجم رد الفعل وتمكين التشغيل في لوحة 384 جيدا. تتطلب كميات أكبر التحريض على الأوكسجين المناسبة. يستخدم بروتوكول التالية قالب مكتوبة مسبقا، TXTL_JoVE.xlsx (التكميلي مادة 4)، لإجراء رد فعل 10 ميكرولتر. العناصر في الأرجواني تشير القيم المستخدم المدخلات، والعناصر الموجودة في الزرقاء تشير الكواشف إضافية إضافة إلى رد الفعل. ومع ذلك، يمكن للمرء أيضا إجراء الطرافة رد فعلالحوت القالب باتباع ظروف التفاعل المذكورة أعلاه.

1. إكمال نموذج "البيانات العامة".
2. تحت عنوان "إعداد ماستر ميكس" إدراج قيمة النسبة المئوية استخراج من الخطوة 4.1 في مربع الأرجواني.
3. تصميم تجربتك في سيليكون باستخدام "ماستر إعداد ميكس" (الصفوف 10-17) و "إعداد الحمض النووي" (الصفوف 19-50) أقسام. عموما، والثوابت يمكن وضعها في قسم "ماستر إعداد ميكس"، في حين أن المتغيرات يمكن وضعها في قسم "إعداد الحمض النووي". تصغير العينات في التجربة لتجنب التبخر العينة التجريبية وبدء التحيز الوقت. انظر الشكل 6 لإعداد العينة.
4. تحت عنوان "إعداد ماستر ميكس"، إضافة الكواشف مثل محرضات أو البروتينات، والتي سوف تذهب في جميع العينات عند تركيز ثابت. بدءا من الصف 14، وملء المناطق المظللة الأزرق، وحفظ كاشف واحد على كل خط. الوحدات هي النسب النسبية.
5. تحت عنوان "إعداد الحمض النووي" DNA إضافة التي ستكون specif عينةجيم. عينة معرفات رقم 1 ورقم 2 تتوافق مع الضوابط الإيجابية والسلبية، على التوالي. عينة معرفات # 3 وما فوق من المستخدم للتعديل لالحمض النووي، وتركيز الأسهم في نانوغرام / ميكرولتر، وطول قاعدة في أزواج، المطلوب تركيز النهائي في نانومتر، ويكرر (من 10 التفاعلات ميكرولتر). يتم حساب كمية الحمض النووي الأسهم لتصل إلى تركيز النهائي المطلوب تلقائيا. . مجموع المبالغ عبر صف إلى 10.5 * n، حيث n هو عدد من يكرر ملاحظة: على الرغم من أن حجم رد الفعل النهائي هو 10 ميكرولتر، تفترض عملية حسابية في إجمالي حجم 10.5 ميكرولتر في رد الفعل، لحساب حجم المفقود خلال pipetting ل.
6. تحت عنوان "إعداد الحمض النووي" DNA أو إضافة الكواشف إضافية والتي سوف تكون محددة لعينة الأعمدة الزرقاء. ويمكن حساب تركيز الحمض النووي في الأسهم نانومتر تحت عنوان "إعداد الحمض النووي"، في حين الكواشف محددة تتطلب عينة الحساب اليدوي استنادا إلى حجم رد الفعل مجموعه 10.5 * ن. يتم طرح وحدات التخزين دخلت من حجم المياه من نفس الصف.
7. إزالة numbe المطلوبةص من الأنابيب العازلة، واستخراج الخلايا الخام، ومراقبة إيجابية تحت عنوان "أنابيب لذوبان الجليد،" من -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية، وذوبان الجليد على الجليد.
8. إعداد عينات من الحمض النووي. لكل رقم العينة، قسامة من الحمض النووي المشار إليه، والمياه، والمواد التي يتم توفيرها للمستخدم في قسم "إعداد الحمض النووي" في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة، في درجة حرارة الغرفة ملاحظة: لتجنب فقدان العينة، معايرة مؤخرا pipets وانخفاض العصا ينصح نصائح ماصة وأنابيب الطرد المركزي الصغيرة.
9. عندما يتم إذابة أنابيب من الخطوة 5.7، وإعداد مزيج الرئيسي تتكون من العازلة، واستخراج، وأية بنود الموفر من قبل المستخدم عالمي يقوم على مربعات مظللة البرتقال، والحفاظ على الجليد وvortexing لبعد إضافة كل بند ملاحظة: استخراج غاية لزج. مأخوذة مع فقاعات يمكن إزالتها عن طريق الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية.
10. إضافة كمية من مزيج الرئيسي هو مبين في الخلايا تحت اللون البرتقالي "إعداد الحمض النووي" (العمود O) لكل عينة الحمض النووي، والحفاظ على درجة حرارة الغرفةتلح. علاج هذا الأمر وقت بدء التفاعل.
11. دوامة كل عينة، وأجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لاسقاط أي عينة المتبقية والحد من الفقاعات.
12. إذا إجراء التفاعل في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة، واحتضان مباشرة في 29 درجة مئوية. وإلا، ماصة 10 ميكرولتر من العينة إلى لوحة 384 جيدا ملاحظة: ردود الفعل في أحجام أكبر من 10 ميكرولتر قد تتطلب التحريض على الأوكسجين.
13. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لاسقاط أي عينة المتبقية والحد من الفقاعات. ختم لوحة بعد ذلك لمنع التبخر.
14. رد فعل تشغيل في 29 ° C. ملاحظة: أوقات التشغيل تختلف تبعا التجربة ولكن تستمر عادة تحت 8 ساعة.

النتائج

قدمنا ​​بروتوكول لمدة خمسة أيام لإعداد القولونية الذاتية استنادا TX-TL نظام التعبير خالية من الخلايا. جدول زمني عينة لخلق الكواشف - استخراج خلية الخام والعازلة - يمكن العثور عليها في الشكل 1. مرة واحدة تم إنشاؤها، يمكن تخزين هذه في -80 درجة مئوية لمدة سنة واحدة. بعد أن يتم إنشاء الكواشف، ويمكن أن يتم الإعداد التجريبية والتنفيذ في أقل من 8 ساعات.

بالإضافة إلى ذلك، ونحن الأمثل الظروف التعبير عن النظام التعبير خالية من الخلايا TX-TL. الإضافات الموفر من قبل المستخدم الأخرى، مثل المخازن المؤقتة أو الحلول الحمض النووي، ويجب معايرة للسمية مسبقا. على سبيل المثال، وأساليب مختلفة من البلازميدات معالجة يؤدي إلى التعبير مختلفة بسبب محتوى الملح. نحن أيضا اختبار تأثير تريس الكلورين شطف العازلة على كفاءة التفاعل (الشكل 5).

مثال على استخراج النفط الخام خلية المعايرة، مشيرا خطوة 4،1-4،9، يظهرفي الشكل 4A. بشكل عام، وتظهر تجاربنا أن استخراج الخلايا الخام هو الأكثر حساسية لمستويات المغنيسيوم الغلوتامات، تليها مستويات K-الغلوتامات. للتدليل على نظام التعبير خالية من الخلايا، اقمنا واختبارها حلقة ردود الفعل السلبية على أساس تيت القمع ²⁶ (الشكل 6). في نظام التعبير خالية من الخلايا، وهو نفس المدى الدائرة مع وبدون ATC يظهر نقطة النهاية تغير التعبير 7 أضعاف من مراسل deGFP بعد ثماني ساعات من التعبير. على الرغم من أن هذه التجربة لا يتطلب محرضات أو repressors العالمية، إذا لزم الأمر يمكن إضافتها تحت عنوان "إعداد ماستر ميكس".

الشكل 1. جدول زمني لاستخراج الخلايا الخام، والحل الأحماض الأمينية، وإعداد الحل الطاقة. A timelin لمدة خمسة أيام ويرد ه لتنفيذ نموذجي للبروتوكول أعلاه، الأمثل للحضانات بين عشية وضحاها وخطوات العمل خلال النهار.

الشكل 2. تحليل التكاليف والتعبير عن مقتطفات الخلية الخام المتنافسة. أ) توزيع تكاليف العمالة والمواد من نظام حرية التعبير خلايا TX-TL. على أساس التكاليف من الكواشف اعتبارا من ديسمبر 2012، وتكاليف العمالة من 14 دولارا للساعة. ب) مقارنة TX-TL خالية من الخلايا تكاليف نظام التعبير مقابل الأنظمة التجارية الأخرى. يتم تقسيم التكاليف إلى أسفل في ميكرولتر، على الرغم من حجم رد الفعل قد تختلف في عدة. ج) مقارنة TX-TL خالية من الخلايا نظام التعبير العائد مقابل الأنظمة التجارية الأخرى. العائد التعبير البروتين تحددها معايير الشركة المصنعة./ 50762fig2large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

الرقم 3. التحميل وتجهيز أنبوب حبة الضرب. أ) مظاهرة من اللزوجة الصحيح من حل خلية حبة. والحل خلية حبة لها اللزوجة تعتمد على العديد من العوامل، بما في ذلك المبلغ من العازلة S30A المضافة، مبلغ من الخرز المضافة، والوقت الذي يقضيه على الجليد. ب) تحميل من أنبوب حبة الضرب السريع قبل منضدية الطرد المركزي. الطرد المركزي يزيل الفقاعات التي تراكمت أثناء التحميل. ج) فقاعات تطفو على السطح بعد منضدية الطرد المركزي. فإن حجم الفقاعات تختلف، بل يمكن أن برزت أو إزالتها باستخدام طرف ماصة د) شغل تماما أنبوب الضرب حبة قبل متوجا. يتم تشكيل الغضروف المفصلي في تي الضرب حبةيوب، وكأب لديه ما يكفي لتغطية وتسبب كميات صغيرة ليفيض. ه) أجهزة تصفية تحميلها بشكل صحيح. هذه يمكن إعادة استخدامها. و) مقارنة بشكل صحيح مقابل معالجتها بشكل غير صحيح أنبوب الضرب حبة. أنبوب على اليسار عبارة عن أنبوب جيدا ضربات - ويتميز الطبقة العليا الصغيرة ويرسم جيدا، وطاف واضحة جدا. الأنبوب على اليمين هو الأمثل، على أساس أكبر، الطبقة الثانية ضبابي وطاف ضبابي. الأنابيب التي هي دون المستوى الأمثل لا ينبغي الخضوع لمعالجة إضافية.

الشكل 4. خصائص الاستعدادات استخراج النفط الخام. أ) قطع المعايرة النموذجية لاستخراج الخلايا الخام. يتم معايرة لاستخراج النفط الخام إضافية المغنيسيوم الغلوتامات، K-الغلوتامات، ومستويات DTT، في هذا النظام. أظهرت هو نقطة النهاية fluorescencه بعد 8 ساعات، وكذلك معدل القصوى لإنتاج البروتين على أساس المتوسط ​​المتحرك لمدة 12 دقيقة. بناء على هذه المؤامرات، ونطاق مقبول من المغنيسيوم إضافية الغلوتامات هو 4 ملم، K-الغلوتامات هو 60-80 ملم، والتلفزيون الرقمي الأرضي هو 0-3 ملم. لاحظ أن كل استخراج النفط الخام يحتاج إلى معايرة بشكل مستقل عن هذه المتغيرات الثلاثة. ب) التغير من الاستعدادات استخراج. يظهر نقطة النهاية مضان اثنين مقتطفات الخام أعدت في تواريخ مختلفة؛ أشرطة الخطأ هي 1 الانحراف المعياري من ثلاثة أشواط مستقلة في أيام مختلفة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 5. آثار الحمض النووي على كفاءة حل التعبير. أ) مقارنة بين اثنين تنقية مختلفة أساليب لمعالجة البلازميدات. يتم إعداد 1 نانومتر من pBEST-OR2-OR1 والعلاقات العامة، UTR1-deGFP-T500 فقط باستخدام كيت QiaPrep سبين Miniprep (طريقة تنقية 1) أو بعد معالجتها مع مجموعة QiaQuick تنقية PCR (طريقة تنقية 2). أظهرت هو نقطة النهاية مضان بعد 8 ساعات، وكذلك معدل القصوى لإنتاج البروتين على أساس المتوسط ​​المتحرك لمدة 12 دقيقة. أشرطة الخطأ هي 1 الانحراف المعياري من أربعة أشواط مستقلة في أيام مختلفة. ب) تأثير شطف العازلة (تريس، الكلور). تتم مقارنة تركيزات مختلفة من تريس الكلورين في التعبير رد فعل خالية من الخلايا استنادا إلى التعبير من 1 نانومتر من pBEST-OR2-OR1 والعلاقات العامة، UTR1-deGFP-T500. تركيزات معينة هي تركيزات النهائي من تريس الكلورين في رد فعل؛ شطف العازلة المستخدمة هي 10 ملي تريس، الكلور. أشرطة الخطأ هي 1 الانحراف المعياري من ثلاثة أشواط مستقلة في أيام مختلفة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

together.within المحافظة على صفحة = "دائما">
الرقم 6. عينة المدى TX-TL من رد الفعل السلبي. أ) إعداد عينة من رد فعل التنفيذ خالية من الخلايا. اختبارات "على" مقابل "قبالة" حالة رد الفعل السلبي، مع الضوابط الإيجابية والسلبية. ب) خريطة البلازميد من رد الفعل السلبي. ج) ممثل النتائج. تعكس بيانات التجربة في أ) و ب)، مع سيطرة سلبية تطرح من الإشارة. الدائرة الوراثية هو مبين في إدراج. أشرطة الخطأ هي 1 الانحراف المعياري من ثلاثة أشواط مستقلة في أيام مختلفة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

اسم	تركيز	مبلغ	تعقيم	الملاحظات
الكلورامفينيكول (سم)	34 ملغ / مل في الإيثانول	1 مل	فلتر تعقيم (0.22 ميكرون)	ويمكن إجراء في حجم أكبر تخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
2xYT + P + لوحة سم أجار	31 ز / L 2xYT، 40 ملم ثنائي القاعدة فوسفات البوتاسيوم، 22 ملي أحادى فوسفات البوتاسيوم، 34 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول	1 لوحة	الأوتوكلاف
2xYT + P وسائل الإعلام	31 ز / L 2xYT، 40 ملم ثنائي القاعدة فوسفات البوتاسيوم، 22 ملي فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة	4 L	الأوتوكلاف

الجدول 1. الكواشف ليوم 1 من خلية الخام بروتوكول استخراج.

اسم	تركيز	مبلغ	تعقيم	الملاحظات
قاعدة تريس	2 M	250 مل	فلتر تعقيم (0.22 ميكرون) أو الأوتوكلاف	يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
DTT	1 M	6 مل	فلتر تعقيم (0.22 ميكرون)	ويمكن إجراء في أحجام أكبر وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
العازلة S30A	14 ملي المغنيسيوم الغلوتامات، 60 ملي K-الغلوتامات، و 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.7	2 L	الأوتوكلاف	لتصل إلى 7.7 درجة الحموضة، عاير مع حمض الخليك. إضافة DTT إلى 2 ملي تركيز النهائي قبل الاستخدام. تخزين عند 4 درجات مئوية.
العازلة S30B	14 ملي المغنيسيوم الغلوتامات، 60 ملي K-الغلوتامات، ~ 5 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.2	2 L	الأوتوكلاف	لتصل إلى 8.2 درجة الحموضة، عاير مع 2Mتريس. إضافة DTT إلى 1 ملي تركيز النهائي قبل الاستخدام. تخزين عند 4 درجات مئوية.

الجدول 2. الكواشف ليوم 2 من خلية الخام بروتوكول استخراج.

	صقر
	1	2	3	4
فارغة 50 مل فالكون (ز)
50 مل فالكون مع بيليه (ز)
كتلة بيليه (50 مل فالكون مع بيليه - فارغة 50 مل فالكون) (ز)
S30A حجم المخزن المؤقت لإضافة (بيليه الشامل * 0.9) (مل)
مجموع كتلة من الخرز لإضافة (بيليه الشامل * 5.0) (ز)

الجدول 3. S30A العازلة وحبة الشامل آلة حاسبة، ليوم 3 من خلية الخام بروتوكول استخراج.

اسم	تركيز	مبلغ	تعقيم	الملاحظات
HEPES	2 M، ودرجة الحموضة 8	4 مل	لا شيء	للوصول إلى الرقم الهيدروجيني 8، عاير مع KOH.
النوكليوتيدات ميكس	156 ملي ATP وGTP، 94 ملم وCTP UTP، ودرجة الحموضة 7.5	1.5 مل	لا شيء	لتصل إلى 7.5 درجة الحموضة، عاير مع KOH.
الحمض الريبي النووي النقال	50 ملغ / مل	600 ميكرولتر	لا شيء
لجنة الزراعة	65 ملي	600 ميكرولتر	لا شيء
NAD	175 ملم، ودرجة الحموضة 7.5-8	300 ميكرولتر	لا شيء	للوصول إلى الرقم الهيدروجيني 7.5-8، عاير مع تريس في 2 M.
المخيم	650 ملم، ودرجة الحموضة 8	200 ميكرولتر	لا شيء	للوصول إلى الرقم الهيدروجيني 8، عاير مع تريس في 2 M.
حمض الفولينيك	33.9 ملي	300 ميكرولتر	لا شيء	على الرغم من أن فقط 300 ميكرولتر هو مطلوب، وصفة في تكميلية هو 1.15 مل.
سبيرمدين	1 M	150 ميكرولتر	لا شيء	تخزينها في 4 درجة مئوية، والحرارة إلى 37 درجة مئوية في الذوبان.
3-PGA	1.4 M، ودرجة الحموضة 7.5	3.2 مل	لا شيء	لتصل إلى 7.5 درجة الحموضة، عاير مع تريس في 2 M.

الجدول 4. الكواشف للتحضير لبروتوكول الحل الطاقة.

تكميلية مادة 1. وصفات للعناصر.

الكلورامفينيكول، 34 ملغ / مل: 0.51 ز إعداد الكلورامفينيكول وإضافة الإيثانول إلى 15 مل. فلتر تعقيم (0.22 ميكرون)، قسامة إلى 1 مل أنابيب، ومخزن في -20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.

2xYT + P + لوحة سم أجار: إعداد 1.24 ز 2xYT، 1.6 مل فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة الحل 1 @ M، 0.88 مل حل أحادى فوسفات البوتاسيوم 1 @ M، 0.6 غرام آغار، والمياه إلى 40 مل. الأوتوكلاف. السماح لتبرد إلى 50 درجة مئوية وإضافة 40 ميكرولتر سم. قسامة 25 مل الى 100 × 15 مم طبق بتري، والسماح لتبرد لمدة ساعة.

2xYT + P وسائل الإعلام: إعداد 124 غ 2xYT، 160 مل فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة الحل 1 @ M، حل أحادى 88 مل فوسفات البوتاسيوم 1 @ M، والمياه إلى 4 L. Aliquبعد التمديد للخروج الى 2 × 1.88 و 0.24 L L. الأوتوكلاف.

قاعدة تريس، 2 M: إعداد قاعدة ز 60.57 تريس والماء إلى 250 مل. تعقيم وتخزين في RT لاستخدامها لاحقا.

التلفزيون الرقمي الأرضي (1)، M: إعداد 2.31 ​​ز DTT والمياه إلى 15 مل. فلتر تعقيم (0.22 ميكرون)، قسامة إلى 1 مل أنابيب، ومخزن في -20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.

العازلة S30A: تحضير 10.88 ز المغنيسيوم الغلوتامات و24.39 ز K-الغلوتامات، 50 مل تريس في 2M، وحامض الخليك (لدرجة الحموضة 7.7)، والماء إلى 2 L. الأوتوكلاف وتخزينها في 4 درجات مئوية، إضافة 4 مل 1 M DTT قبل الاستخدام.

العازلة S30B: تحضير 10.88 ز المغنيسيوم الغلوتامات و24.39 ز K-الغلوتامات، تريس في 2 M (لدرجة الحموضة 8.2)، والماء إلى 2 L. الأوتوكلاف وتخزينها في 4 درجات مئوية، إضافة 2 مل 1 M DTT قبل الاستخدام.

HEPES: إعداد 1.91 ز HEPES (MW 238.21)، KOH (لدرجة الحموضة 8)، والماء إلى 4 مل.

الحمض الريبي النووي النقال: إعداد 30 ملغ من الحمض الريبي النووي النقال والمياه إلى 600 ميكرولتر.

لجنة الزراعة: إعداد 30 ملغ من لجنة الزراعة (MW 767.53) والمياه إلى 600 ميكرولتر.

NAD: إضافة 34.83 ملغ من NAD (MW 663.43)، تريس في 2 M (لدرجة الحموضة 7.5-8)، والمياه إلى 300 ميكرولتر. (إضافة 27 ميكرولتر من تريس في 2 M لتحقيق الحل لدرجة الحموضة 7.5-8).

المخيم: إضافة 42.80 ملغ من المخيم (MW 329.22)، تريس في 2 M (لدرجة الحموضة 8)، والمياه إلى 200 ميكرولتر. (إضافة 73 ميكرولتر من تريس في 2 M لتحقيق الحل لدرجة الحموضة 8).

حمض الفولينيك (33.9 ملم): ل20 ملغ من الكالسيوم ملح حمض الفولينيك الصلبة (MW 511.5)، إضافة 1.15 مل من الماء.

سبيرمدين: تحضير 23.55 ميكرولتر من سبيرمدين (MW 145.25) والمياه إلى 150 ميكرولتر. إعداد في درجة حرارة الغرفة لفترة وجيزة بعد ذوبان عند 37 درجة مئوية.
3-PGA: إضافة 1.03 غرام من 3-PGA (MW 230.02)، تريس في 2 M (لدرجة الحموضة 7.5)، والمياه إلى 3.2 مل. (إضافة 1.73 مل من تريس في 2 M لتحقيق الحل لدرجة الحموضة 7.5).

Nucleotبيئة تطوير متكاملة ميكس: إضافة 145 ملغ من ATP dipotassium تبلور الملح (MW 619.4)، 133 ملغ من الصوديوم والملح GTP (MW 567.14)، 79.4 ملغ من الصوديوم CTP تبلور الملح (MW 563.16)، 82.6 ملغ من تبلور UTP صوديوم الملح (MW 586.12) ، KOH 15٪ في التخفيف (لدرجة الحموضة 7.5)، والمياه إلى 1.5 مل. (إضافة 353 ميكرولتر من KOH 15٪ في التخفيف لتحقيق الحل لدرجة الحموضة 7.5).

تكميلية مادة 2. برادفورد الفحص.

1. إزالة عامل برادفورد من 4 ° C وضعت في درجة حرارة الغرفة.
2. إعداد 50 ميكرولتر BSA قياسي في 1 ملغ / مل وعند 0.1 ملغ / مل.
3. إعداد 40 ميكرولتر 20x والتخفيف من مستخلص من الخطوة 1.47.
4. إضافة 800 ميكرولتر المياه إلى 7 cuvettes.
5. إعداد cuvettes القياسية ل0 ملغ / مل، 1 ملغ / مل (10 ميكرولتر 0.1 ملغ / مل BSA)، 2 ملغ / مل (20 ميكرولتر 0.1 ملغ / مل BSA)، 4 ملغ / مل (4 ميكرولتر 1 ملغ / مل BSA) ، 6 ملغ / مل (6 ميكرولتر 1 ملغ / مل BSA).
6. إعداد cuvettes تجريبية لمدة 2 ميكرولتر من العينة و 4 ميكرولتر من العينة.
7. إضافة 200 ميكرولتر من وكيل برادفورد إلى كل كفيت وتخلط جيدا بذ pipetting ل. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة على الأقل.
8. إنتاج منحنى القياسية في OD 595 نانومتر باستخدام cuvettes من الخطوة 6.5. رفض منحنى القياسية إذا ص ² <0.95.
9. تحديد تركيز مستخلص OD في 595 نانومتر باستخدام cuvettes من الخطوة 6.6.

تكميلية مادة 3. العازلة معايرة البيانات.

انظر TXTL_e (قالب) _calibration_JoVE.xlsx .

تكميلية المادة 4. خالية من الخلايا التعبير تشغيل البيانات.

انظر TXTL _JoVE.xlsx .

Discussion

والإشريكية القولونية الذاتية استنادا TX-TL نظام التعبير خالية من الخلايا الموصوفة هنا هو وسيلة سهلة للتشغيل أنبوب ثلاثة ردود الفعل التي يمكن أن تستغرق أقل من ثماني ساعات من وضع لجمع البيانات. عملية إنشاء جميع الكواشف يتطلب خمسة أيام الوقت الكلي (مع متطلبات العمل كبيرة في يوم واحد فقط)، ولكن تنتج استخراج النفط الخام ل3،000 ردود الفعل وردود الفعل الكواشف ل10،000 (الشكل 1) صنع العازلة. وعلاوة على ذلك، واستخراج النفط الخام والكواشف مستقرة لا يقل عن 1 سنة في -80 درجة مئوية، مما يسمح لاستخدامات متعددة من التحضير واحد صنع العازلة ^4. في 0،11 $ لكل 10 رد فعل ميكرولتر (0،26 $ بما في ذلك العمل)، وتكاليف أقل 98٪ من مقارنة الأنظمة التجارية (الشكل 2).

هناك بعض القيود التي لم تحل، ولكن، إلى النظام. كفاءة نهاية كل خلية إعداد مستخلص الخام يمكن أن تختلف على أساس الكفاءة المستخدم وعلى الظروف البيئية، على الرغم من راختلاف العائد ypical ما بين 5-10٪ (الشكل 4B). ونتيجة لذلك، وتقلب دفعة إلى دفعة في كل من التعبير نقطة النهاية وديناميكية في التعبير وينتظر أن تتم. ومن المرجح أن تظل هذه الاختلافات حتى يتميز استخراج بالكامل أو حتى يتم إنشاء آلية استخراج بالكامل. إذا تم استخدام نظام التعبير خالية من الخلايا لإجراء التجارب الكمي الحساسة، فإنه من المستحسن لتشغيل جميع التجارب مع نفس دفعة من استخراج الخلايا الخام. العائد من نفس واحدة استخراج الخام دفعة الخلية، حوالي 3000 ردود الفعل، ينبغي أن يكون كافيا لدورات تجريبية نموذجية. على الرغم من أن نشك يمكن إزالة الاختلاف من خلال زيادة وأتمتة الإجراءات، فإن مثل هذه المحاولات تنطوي على استثمار الموارد كبيرة.

بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن مستويات نقطة النهاية التعبير هي سهلة لتحديد معقول، يحتاج إلى المزيد من العمل الذي يتعين القيام به في فهم الديناميات الجوهرية لنظام خالية من الخلايا. ومن المعروف أن كلا competitio المواردن والموارد قيود يمكن أن تؤثر على ديناميات التعبير. على سبيل المثال، يمكن محدودة سيغما الذاتية 70 يؤدي إلى تشبع النظام مع زيادة إنتاج الحمض النووي قالب ملف تعريف التعبير مماثلة لتلك التي النوكليوتيدات أو استنزاف الأحماض الأمينية. ^9،27 ومع ذلك، وديناميات لا يجب أن تكون مفهومة تماما للاستفادة من النظام. لزيادة نقية من الغلة، ويمكن أن يتم من خلال النهج الأمثل آلة التعلم. ²⁸ أسئلة من التنافس على الموارد والحد يمكن معالجتها من خلال نماذج رياضية التحقق باستخدام البيانات التجريبية.

هو الأمثل لبروتوكول المعروضة هنا للحصول على سلالة BL21-Rosetta2، ولكن هو للتعميم إلى أخرى E. سلالات القولونية. تعديلات في BL21-Rosetta2، مثل إزالة الجين الترميز خط الطول البروتيني وإضافة ترميز الجينات tRNAs نادرة، والسماح لإنتاج البروتين القصوى. حاولنا بروتوكول مع اثنين من سلالات استخراج أخرى - BL21 BL21 فقط وtrxA خروج المغلوب، ووجد د 50٪ أقل من البروتين العائد. نحن نفترض أن الغلات تنخفض بالمثل عند استخدام السلالات الأخرى. ، وقد أدت التغييرات الأخرى في المعلمات، مثل تبديل 2xYT متوسطة النمو لLB والمرق الغنية الأخرى في تناقص الغلة البروتين.

نظم التعبير خالية من الخلايا باستخدام الداخلية والخارجية على حد سواء آلات النسخ الترجمة وآليات التنظيم لها تطبيقات واسعة في كل من البروتين والأيض والتعبير في البيولوجيا التركيبية. ^3،29 بدلا من أن يقتصر على دوائر التنظيم T7، يمكن للمرء أن يتصور إنتاج الجزيئات الحيوية المعقدة في وضع المستخدم السيطرة عليها باستخدام مزيج من الأم E. المروجين القولونية وآليات النسخ وتنظيم الموردة خارجيا. دون قيود من انقسام الخلايا والتمثيل الغذائي، وتقلب في الدوائر الاصطناعية مثل repressilator أو في التمثيل الغذائي المهندسة مسارات مثل تلك التي تنتج مادة الأرتيميسينين يمكن تخفيض أو مفهومة على نحو أفضل. ^30،31 نحن هفه تستخدم هذه المزايا لتنفيذ مفاتيح الوراثية، وكذلك لفهم سيغما عامل تنحية يمكن ^9،32 هذه التكنولوجيا أيضا تشكل العمود الفقري لل"الحد الأدنى" أو خلايا "مصطنعة" - صغيرة، وتتميز بشكل جيد وحدات المجسدة الاكتفاء الذاتي من استخراج. ^33،34

في نهاية المطاف، ونحن نتوقع الاستخدامات الفوري لهذا النظام حرية التعبير الخلايا الذاتية كبيئة النماذج للبيولوجيا الاصطناعية. الملقب ب "TX-TL اللوح الجزيئية البيولوجية،" يوفر نظام حرية التعبير خلايا بيئة يمكن السيطرة عليها حيث الدوائر الاصطناعية المخصصة في نهاية المطاف لفي الجسم الحي التعبير يمكن أن تخضع لجولات من النماذج - دورات الاختبار على البلازميد الأساسية، الخطي، أو الحمض النووي synthetized كيميائيا، يليه عن طريق التحليل والتعديل السريع. جولات النماذج يمكن بمساعدة النماذج الرياضية التنبؤية التي يجري تطويرها حاليا. عن طريق إزالة الاستنساخ والتلاعب في الجسم الحي للدوائر غير نهائية، ونحن نتوقع إنجيدورة مرات neering أن تنخفض إلى 1-3 أيام بدلا من معيار الأسابيع الحالية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2xYT	MP biomedicals	3012-032
3-PGA	Sigma-Aldrich	P8877
ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Bacto-agar	BD Diagnostics	214010
Bead-beating tubes (polypropylene microvials)	BioSpec	522S
Beads, 0.1mm dia.	BioSpec	11079101
BL21 Rosetta 2 E. coli strain	Novagen	71402
Bradford BSA Protein Assay Kit	Bio-rad	500-0201
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
CoA	Sigma-Aldrich	C4282
CTP	USB	14121
Cuvettes, 1.5ml	Fisher	14-955-127
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Folinic acid	Sigma-Aldrich	F7878
GTP	USB	16800
HEPES	Sigma-Aldrich	H6147
K-glutamate	Sigma-Aldrich	G1149
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605
Micro Bio-Spin Chromatography Columns	Bio-Rad	732-6204
NAD	Sigma-Aldrich	N6522
Nunc 384-well optical bottom plates	Thermo-Scientific	142761
Nunc sealing tape	Thermo-Scientific	232701
PEG-8000	Promega	V3011
Potassium phosphate dibasic solution	Sigma-Aldrich	P8584
Potassium phosphate monobasic solution	Sigma-Aldrich	P8709
RTS Amino Acid Sampler	5 Prime	2401530
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)	Thermo-Scientific	66382
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558
Tris base	Fischer	BP1521
tRNA (from E. coli)	Roche Applied Science	MRE600
UTP	USB	23160
1L Centrifuge Bottle	Beckman-Coulter	A98813	This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.
4L Erlenmeyer Flask	Kimble Chase	26500-4000
Avanti J-26XP Centrifuge	Beckman-Coulter	393127	Or 1L-capable centrifuge equivalent.
Forma 480 Orbital Shaker	Thermo Scientific	480	Or chest-size 6x4L shaker equivalent.
JLA-8.1000 Rotor	Beckman-Coulter	363688	Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.
Mini-Beadbeater-1	BioSpec	3110BX
Supplemental Material 1. Recipes for Items. Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use. 2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 °C and add 40 μl Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use. S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 4 ml 1 M DTT before use. S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 2 ml 1 M DTT before use. HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 μl. CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 μl. NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 μl. (Add 27 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 μl. (Add 73 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. Spermidine: Prepare 23.55 μl of spermidine (MW 145.25) and water to 150 μl. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 °C. 3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 μl of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). Supplemental Material 2. Bradford Assay. Remove Bradford agent from 4 °C and set at room temperature. Prepare 50 μl BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml. Prepare 40 μl 20x dilution of extract from step 1.47. Add 800 μl water to 7 cuvettes. Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 μl 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 μl 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 μl 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 μl 1 mg/ml BSA). Prepare experimental cuvettes for 2 μl of sample and 4 μl of sample. Add 200 μl of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min. Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 < 0.95. Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6. Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx. Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. See TXTL _JoVE.xlsx.