وProteoliposome القائم على الدفق الفحص تحديد خصائص جزيء واحدة من الكلور<sup&gt; -</sup&gt; القنوات وأنظمة نقل

Summary

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Abstract

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl^- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl^- from proteoliposomes following the addition of the K⁺ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H⁺/Cl^- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl^- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

Introduction

في اثنين العقود الماضية القدرة على بإفراط وتنقية البروتينات النقل الغشاء قد زاد بشكل كبير: القنوات الأيونية، والآن تنقيته النقل الابتدائية والثانوية بشكل روتيني من النظم التعبير مغاير وكذلك المصادر الطبيعية. ويجري باستمرار تطوير مناهج جديدة لمراقبة التعبير، وتحسين وتسهيل استخراج وتعزيز الاستقرار من هذه البروتينات ^1-5. وكانت هذه الاختراقات التكنولوجية دورا أساسيا في إحداث انفجار المعلومات الهيكلية المستوى الذري على بروتينات الغشاء الذي، بدوره، وتعزيز فهمنا للقواعد الهيكلية وظيفتها. في المقابل، فإن قدرتنا على تحقيق في الخصائص الوظيفية لبروتينات المنقى لا تزيد بنفس المعدل، حتى أنه في بعض الحالات ويرافق المعلومات الهيكلية عالية الدقة من خلال بيانات وظيفية نوعية، مما يحد من قدرتنا على اختبار كميا التنبؤات القائمة على بنية. وبالتالي، فإن التنطن من المقايسات الفنية الكمية وتعميم هو خطوة رئيسية نحو استجلاء هذه الأسس الميكانيكية للوظيفة البروتين الغشاء.

نحن هنا وصف مقايسة هروب رأس المال التي يمكن استخدامها لتحديد كميا الخصائص الفنية الرئيسية لتنقية وإعادة تشكيل الكلور ^- القنوات والنقل. المبادئ الأساسية للمقايسة يمكن تعميمها على مجموعة متنوعة من أنظمة النقل، فضلا عن البروتينات غير نقل أيون. وأعيد الجسيمات الشحمية مع تنقية الكلور ^- قناة / النقل في وجود الكلور كبير ^- التدرج (الشكل 1A، B). CL ^- يبدأ هروب رأس المال من خلال إضافة لحامل الأيون للسماح لتدفق مكافحة أيون، في حالتنا K ⁺ حامل الأيون valinomycin، الذي إنتقل الجهد الذي أنشأه الكلور ^- التدرج وتعيين غشاء المحتملة الأولية إلى إمكانية التوازن K ^{+ 6،7.} دون رانه حامل الأيون لا صافي الكلور كبير ^- يحدث هروب رأس المال، كما منعت من قبل جيل من إمكانات عبر الغشاء. وكميا وصف البيانات بواسطة معلمتين قابلة للقياس (الشكل 1C): τ، ثابت وقت الكلور ^- هروب رأس المال، وو _0، وجزء من الجسيمات الشحمية لا تحتوي على البروتين النشط. من τ وو ₀ من الكلور الوحدوي ^- معدل النقل، وجزء من البروتينات النشطة والكتلة الجزيئية للمجمع نشط يمكن أن تستمد ^8. ويتضح هنا باستخدام تقنية proteoliposomes تشكيلها مع CLC-EC1، وتتميز كذلك CLC من نوع H ⁺ / CL ^- مبادل من هيكل معروف وظيفة. وتعميم هذا الاختبار بسهولة إلى قنوات أو النقل مع مختلف الانتقائية الأيونية أو التي تعتمد على وجود التيار الكهربائي و / أو بروابط النشاط. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد ما إذا جزيئات صغيرة تؤثر بشكل مباشر على البروتين المعاد،ل quantitate آثار هذه المركبات وكيفية تكوين غشاء أو الكواشف-تعديل المادة الدهنية تؤثر على وظيفة من القنوات وشركات النقل تشكيلها.

Protocol

1. إعداد الدهون

1. قسامة الدهون المبلغ المطلوب في أنبوب الزجاج واضحة. أنت ترى. القولونية استخراج الدهون القطبي، ولكن معظم التراكيب الدهون يمكن استخدامها. إذا كانت الدهون هي في شكل مسحوق، و resuspend لهم في الكلوروفورم إلى تركيز من 20 ملغ / مل. تجفيف الدهون في RT تحت N ₂ الغاز حتى يتبخر كل المذيبات.
2. Resuspend والدهون في البنتان وجففها مرة أخرى وجود تدفق مستمر من الغاز N ₂ لإزالة بقايا آثار من الكلوروفورم. الجاف حتى تبخرت كل المذيبات. بينما التجفيف، وتناوب بلطف الأنبوب بحيث يتم توزيع الدهون في فيلم موحدة تغطي ثلث السفلي من أنبوب بدلا من تشكيل كتلة كثيفة في الجزء السفلي.
3. إضافة المخزن المؤقت إعادة تحتوي المنظفات (300 ملي بوكل، 50 ملي حمض الستريك، 25 ملي K ₂ هبو _4، ودرجة الحموضة 4.5، 35 ملي CHAPS) لإذابة الدهون. استخدام المنظفات معتدل الأخرى لهذه الخطوة إذا كان البروتين هو متسامح سيئة لCHAPS.
4. Resuspenد الدهون إلى الوضوح باستخدام sonicator حمام الماء. تزج الأنبوب في وسط sonicator باث الماء في أقصى قدر من السلطة وباختصار (30 ثانية-1 دقيقة) نبضات قصيرة (30 ثانية-1 دقيقة) مؤقتا. وينبغي أن تصبح الحل واضح.
   ملاحظة: درجة النهائية من الوضوح حققت تعتمد على تكوين الدهون المحددة المستخدمة. بعض الاختلاف دفعة إلى دفعة في هذه الخطوة، حتى بين الدهون متطابقة اسميا، ممكن أيضا. ومن المقرر أن تشتت الضوء من قبل الجزيئات الكبيرة في التعليق، والتي يمكن إزالتها عن طريق الطرد المركزي الضباب المتبقية.
5. احتضان الدهون معلق في RT 20-60 دقيقة.

2. تشكيل Proteoliposome

ملاحظة: العديد من الاستراتيجيات التي يمكن أن تستخدم لادخال البروتين المنظفات تذوب في الجسيمات الشحمية. لCLC-EC1 غسيل الكلى يعمل بشكل جيد وبالتالي فهي طريقة اختيار ^6،9،10.

1. إضافة البروتين النقي إلى المطلوب البروتين إلى الدهون (P / L) نسبة (معبرا عنها ميكروغرام س و البروتين / ملغ الدهون). اختيار نسبة P / L يعتمد على الغرض من التجربة.
   1. إذا كان الهدف هو تقييم النشاط من البروتين من الفائدة، وإعادة تشكيل في ارتفاع P / L'الصورة لتعظيم إشارة، حيث أن كل الحويصلية تحتوي على نسخ متعددة من البروتين. لقياس النشاط و / أو معدل النقل الوحدوي من البروتين، وإعادة تشكيل في نظام التخفيف بواسون في انخفاض P / L'الصورة، بحيث يكون لكل حويصلة تحتوي في المتوسط ​​1 البروتين. راجع الخطوة 7 و مناقشة لأكثر في عمق تحليل متى تستخدم كل نظام.
2. لتحديد القيم المثلى P / L لمختلف الأنظمة، إجراء المعايرة كاملة من النشاط بوصفها وظيفة من تركيز البروتين ^8،11-13. ومع ذلك، لأي البروتين التي الوزن الجزيئي (MW، أعرب في كيلو دالتون) وحدة نشطة هو معروف يمكن استخدام القيم L P / التالية كما تخمينات أولية:
   خريج "/>
   
3. تحميل البروتين والدهون الخليط في أنبوب غسيل الكلى قبل المبللة أو الكاسيت. وضع الجهاز غسيل الكلى في دورق يحتوي على 500-1،000x حجم المخزن المؤقت الدهون إعادة (أي 1 L عازلة لل1 مل من الدهون إعادة تعليق) تحت التحريك لطيف.
   1. تغيير عازلة 3-4 مرات على فترات> 3 ساعة. في كل تغيير الحل، وغسل كاسيت / أنابيب والكأس مع الماء المقطر وملء كوب مع العازلة إعادة الطازجة. تشمل 1-2 O / N فترات لتغيير الحل. يعتمد العدد الدقيق ومدة التغيرات حل على الدهون الدقيق والمنظفات المستخدمة.
4. بعد الخطوة الأخيرة هي كاملة، وإزالة الجسيمات الشحمية من السفينة غسيل الكلى، وقسامة لهم في أنابيب وفلاش تجميد لهم في السائل N ₂ أو التجميد في -80 ° C.

3. تسجيل مجموعة المتابعة

<ص الطبقة = "jove_content"> ملاحظة: تسجيل انشاء (الشكل 2A) ويتكون من مجلسين (اسطوانات مسطحة القاع، ~ 3-4 حجم مل)، والكلور ^- (انظر أدناه) الكهربائي، ودرجة الحموضة متر مع التناظرية أو الإخراج الرقمي الكهربائية، والتحويل الرقمي، وجهاز كمبيوتر مع برنامج الحصول المناسب.

1. ربط الكلور ^- القطب إلى متر الرقم الهيدروجيني، والإخراج للمتر الرقم الهيدروجيني إلى التحويل الرقمي التي يتم توصيلها إلى الكمبيوتر. وضع القطب المرجع في غرفة واحدة وسلك إعادة ترميز في الآخرين (الشكل 2B).
   ملاحظة: قطبية من الأسلاك هو الصحيح إذا ΔV _كال (انظر الخطوة 6.4 و 7.2) موجبة.
2. ضع غرف على طبق من ذهب ضجة مع بقضيب في تسجيل غرفة (الشكل 1B). تأكد من أن بقضيب لا تلمس القطب.
3. ربط الدوائر باستخدام جسر أجار (الشكل 2B) (100 ملي بوكل و 2٪ الاغاروز). تخزين الجسور أجار في 100 ملي بوكل.

4. إعداد الكلور ^- الكهربائي

1. خذ غير عاملة القطب درجة الحموضة القديم و-possibly-. كسر طلاء الزجاج لتكشف تماما أسلاك الفضة.
2. إزالة بعناية طلاء من الأسلاك الفضة باستخدام شفرة المشرط. تنظيف الأسلاك باستخدام كميات وفيرة من H ₂ O وETOH.
3. يتم تغطية مكان في محلول مشبع من FeCl ₃ (أو التبييض) حتى الأسلاك مع معطف الظلام موحد للأجكل.

5. إعداد Unilamellar الحويصلات

1. في الليلة التي سبقت التجارب، تنتفخ 1 غرام من باستخدام Sephadex-50 حبات في 15 مل من العازلة الخارجي (1 ملم بوكل، 150 ملي K ₂ SO _4، 25 ملم حمض الستريك، ودرجة الحموضة 4.5) مع طيف والهز (لا يحرك) ل على الأقل 3 ساعة على RT قبل الاستخدام. كل تجربة تتطلب ~ 3 مل من الخرز منتفخة. الحفاظ على حبات منتفخة عند 4 درجة مئوية لمدة بضعة أيام على الأكثر.
2. في حين أن الجسيمات الشحمية والذوبان في RT، صب في كل عمود ~ 3 ملتر من تورم G-50 الخرز. السماح لهم الجافة قبل تدفق الجاذبية في RT. هذا عادة ما يستغرق 1-2 دقيقة.
3. إعداد الحويصلات unilamellar بواسطة البثق في proteoliposomes 11 مرة من خلال ميني الطارد باستخدام قطع 0.4 م تفلون.
4. وضع عمود في أنبوب الجولة القاع من البلاستيك. تدور الأعمدة لإزالة حل الزائد. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20-30 ثانية في 1،400 x ج في جهاز للطرد المركزي السريري.
5. تجاهل التدفق من خلال عمود مكان في 13 × 100 مم أنبوب زجاجي وإضافة 100 ميكرولتر من الحويصلات مقذوف إلى العمود. تدور العمود لمدة 1 دقيقة في 500 x ج في جهاز للطرد المركزي السريري.
6. جمع ~ 200 ميكرولتر من التدفق من خلال التي ستضاف إلى غرفة تسجيل في الخطوة 6.5.

6. الدفق القياس

1. ضع 2 مل من 100 ملي بوكل في إشارة الغرفة (الأرض) و 1.8 مل من المخزن المؤقت الخارجي (1 ملم بوكل، 150 ملي K ₂ SO _4، 25 ملم حمض الستريك، ودرجة الحموضة 4.5) إلى غرفة تسجيل. عدم التوازن الاسموزي طفيف بين الداخليةوالحلول الخارجية لا يؤثر
2. بدء تشغيل البرنامج الاستحواذ. السماح للخط الأساس تتوازن، وهذا قد يستغرق بضع دقائق.
3. وبمجرد وصول إشارة خط الأساس مستقرة (والجسيمات الشحمية جاهزة والأعمدة الجافة)، بدء التسجيل (الشكل 3A).
4. إضافة 15 ميكرولتر من 10 ملي بوكل حل لمعايرة نظام (الشكل 2A).
5. إضافة الجسيمات الشحمية. قفزة صغيرة قد تكون واضحة بسبب إزالة كاملة من الكلور خارجي ^- من proteoliposomes (الشكل 3A). الانتظار حتى تستقر خط الأساس.
6. إضافة Valinomycin (1 ميكرولتر من 1 ملغ / مل في ETOH) لبدء هروب رأس المال (الشكل 3A).
7. السماح للهروب رأس المال مجراها وقته حتى أنه الهضاب (الشكل 3A).
8. إضافة 40 ميكرولتر من 1.5 M β-octylglucoside (β-OG) التي أعدت في المخزن المؤقت الخارجي على حل جميع الجسيمات الشحمية (الشكل 3A). إنهاء التسجيل.

7. البيانات Analysis

1. تصدير ملف التتبع من في شكل ASCII أو النص واستيراده إلى برنامج تحليل الاختيار.
2. قياس الجهد في النقاط التالية (الشكل 3A):
   في بداية التسجيل (V _0)؛
   بعد إضافة نبض معايرة (V _كال)؛
   بعد إضافة الجسيمات الشحمية (V _يبو)؛
   في نهاية هروب رأس المال (V _{زعنفة)؛}
   بعد إضافة المنظفات (V _TOT)؛
   خط الأساس الفولتية بحيث V ₀ = 0.
3. استخدام معادلة نرنست-بلانك لتحديد القيمة التجريبية ل عن طريق قياس
   
   حيث المجلد _كال هو حجم نبض المعايرة في ميكرولتر، 1،800 وحجم الغرفة في بداية أعربت التجربة في1؛ ل، [الكلور] _{كال / في} هم الكلور ^- تركيزات نبض المعايرة والمخزن المؤقت الخارجي في ملي وΔV _كال هو قفزة في بالسيارات قياسها بعد نبض المعايرة.
   ملاحظة: هذا التحديد التجريبي للα يخدم ثلاثة أغراض: أنه يضمن أن النظام يستجيب بشكل صحيح، ويقدم مقياسا لاتساق استجابة الصك بين التجارب وكذلك للتأكد من أن تم إجراء أية أخطاء في صنع الحل.
4. حساب تركيزات الكلور بعد كل خطوة على النحو التالي:
   
   
   
   عامل 3/400 يأتي من التخفيف من 15 ميكرولتر معايرة النبض في الحجم النهائي 2،000 ميكرولتر.
5. CALCULيأكل من التغيرات في [الكلور] في كل خطوة، ΔCl _{يبو / الزعانف / طفل.}
6. تحويل V (ر) في الكلورين (ر) مع
   
   تحديد مباشرة [الكلور] القيم في النقاط الحرجة ومقارنتها مع القيم المحسوبة باعتبارها الرقابة الداخلية.
7. تطبيع التتبع بحيث ^يبو الكلور _يختلط = 0 و الكلور _يختلط ^TOT = 1
   
8. تناسب دوام هروب رأس المال إلى المعادلة التالية:
   
   حيث L هو معدل الكلور ^- تسرب أن يتم تحديد تجريبيا من خلال قياس الكلور ^- هروب رأس المال من الجسيمات الشحمية خالية من البروتين أعدت في نفس الظروف وτ هو ثابت وقت العملية.
9. حساب الخامس، سرعة الأولية:
   حيث يتم التعبير عن ΔCl _زعنفة في millimolar وV هو حجم الغرفة في ميكرولتر.
10. حساب معدل النقل / تصرف
    
    حيث p هو P / L، MW هو الوزن الجزيئي للمجمع نشط أعرب في كيلو دالتون

النتائج

وصفنا بروتوكول مفصلة وقوية لقياس الكلور ^- النقل بوساطة النقى CLC-EC1، وبدائيات النواة من نوع CLC H ⁺ / CL ^- مبادل، تشكيلها في الجسيمات الشحمية. ويرد التمثيل التخطيطي للتجربة في الشكل 3 Proteoliposomes تشكيلها مع النقى CLC-EC1 والتي تحتوي على الكلور عالية الدا?...

Discussion

وصفناها بروتوكول مفصلة لقياس الكلور ^- النقل بوساطة قنوات أنيون انتقائية المنقى أو النقل تشكيلها في الجسيمات الشحمية. كان المثال المستخدم في بدائيات النواة H ⁺ / CL ^- مبادل CLC-EC1. ومع ذلك، فإن منهجية يمكن تكييفه بسهولة لدراسة قنوات بوابات بواسطة بروابط

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 Benchtop	Thermo Scientific
Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter			These can be found on Ebay.
Non-functional pH probe			Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.
DI-710 Data Logger	DATAQ instruments
WinDAQ acquisition software	DATAQ instruments
Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass	Kimble Chase	73500-13100
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids Inc.	610000
Computer