Un protéoliposome-Based Assay Efflux pour déterminer les propriétés unique molécule de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Chaînes et transporteurs

Résumé

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Résumé

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl^- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl^- from proteoliposomes following the addition of the K⁺ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H⁺/Cl^- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl^- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

Introduction

Dans les deux dernières décennies, la capacité de surexprimer et purifier des protéines de transport membranaire a considérablement augmenté: les canaux ioniques, les transporteurs primaires et secondaires sont maintenant couramment purifiés à partir de systèmes d'expression hétérologues, ainsi que des sources naturelles. De nouvelles approches pour surveiller l'expression, améliorer et faciliter l'extraction et à améliorer la stabilité de ces protéines sont constamment mises au point ^1-5. Ces avancées technologiques ont joué un rôle dans le déclenchement de l'explosion de l'information structurelle niveau atomique de protéines membranaires qui, à son tour, amélioré notre compréhension des bases structurelles de leur fonction. En revanche, notre capacité à sonder les propriétés fonctionnelles des protéines purifiées ne ont pas augmenté au même rythme, de sorte que dans certains cas, des informations structurelles haute résolution est accompagnée de données fonctionnelles qualitatives, limitant ainsi notre capacité à tester quantitativement prédictions basées sur la structure. Par conséquent, la mist des analyses fonctionnelles quantitatives et généralisables est une étape clé pour l'élucidation des fondements mécanistes de la fonction des protéines de la membrane.

Nous décrivons ici un essai d'écoulement qui peut être utilisé pour déterminer quantitativement des propriétés fonctionnelles clés de reconstituées purifiées et Cl ^- canaux et des transporteurs. Les principes qui sous-tendent l'analyse peuvent être généralisés à une variété de systèmes de transport, ainsi que des protéines de transport non-ioniques. Les liposomes sont reconstitués purifiés avec canal Cl ^- / transporteurs en présence d'un grand Cl ^- gradient (Figure 1A, B). Cl ^- efflux est initiée par l'addition d'un ionophore pour permettre un flux contre-ion, dans notre cas le K ⁺ ionophore valinomycine, qui shunter la tension établie par le Cl ^- gradient et régler le potentiel de la membrane initiale au potentiel de K d'équilibre ^{+ 6,7.} Sans til ne ionophore Cl nette significative ^- efflux se produit, comme cela est empêché par la génération d'un potentiel transmembranaire. Les données sont quantitativement décrite par deux paramètres mesurables (figure 1c): τ, la constante de temps de Cl ^- efflux, et f _0, la fraction de liposomes ne contenant pas de protéine active. De τ et f ₀ Cl unitaire ^- taux de transport, la fraction de protéines actives et la masse moléculaire du complexe actif peuvent être dérivées ^8. La technique est illustrée ici en utilisant protéoliposomes reconstituées avec la SIC-CE1, un type bien caractérisé CTC H ⁺ / Cl ^- échangeur de la structure et de la fonction connue. Ce dosage est facilement généralisable à des canaux ou transporteurs à sélectivité ionique ou différent, dont l'activité dépend de la présence de tension et / ou des ligands. En outre, ce test peut être utilisé pour déterminer si petites molécules affectent directement la protéine reconstitué,pour quantifier les effets de ces composés et de la façon dont la composition de la membrane ou des réactifs lipidiques modificateurs affectent la fonction des canaux reconstituées et les transporteurs.

Protocole

1. Préparation des lipides

1. Aliquoter les lipides quantité désirée dans un tube de verre clair. Tu Vois. coli extrait lipidique polaire, mais la plupart des compositions lipidiques peuvent être utilisés. Si les lipides sont sous forme de poudre, les remettre en suspension dans du chloroforme à une concentration de 20 mg / ml. Sécher les lipides à température ambiante sous _N2 gaz jusqu'à ce que tout le solvant se est évaporé.
2. Reprendre les lipides dans le pentane et le sécher à nouveau un flux régulier de gaz N ₂ pour éliminer les traces de restes de chloroforme. Sec jusqu'à ce que tout le solvant se est évaporé. Bien que le séchage, faire tourner doucement le tube de façon que le lipide est distribué dans un film uniforme couvrant le tiers inférieur du tube plutôt que d'une formation d'une masse dense à la base.
3. Ajouter le tampon de reconstitution contenant un détergent (300 mM de KCl, 50 mM d'acide citrique, 25 mM de K ₂ HPO _4, à pH 4,5, CHAPS 35 mM) pour dissoudre les lipides. Utiliser d'autres détergents doux pour cette étape si la protéine est mal tolérants à CHAPS.
4. ResuspenD les lipides à la clarté en utilisant un appareil à ultrasons à bain d'eau. Plonger le tube dans le centre du bain de sonicateur de l'eau à la puissance maximale à court (30 sec-1 min) avec des impulsions de courte durée (30 sec-1 min) pauses. La solution doit devenir clair.
   NOTE: Le dernier degré de clarté atteint dépend de la composition lipidique spécifique utilisé. Une certaine variation de lot à lot dans cette étape, même parmi les lipides nominalement identiques, est également possible. Trouble résiduel est dû à la diffusion de lumière par les grosses particules dans la suspension, qui peuvent être éliminés par centrifugation.
5. Incuber les lipides remises en suspension à température ambiante pendant 20 à 60 min.

2. Formation protéoliposome

REMARQUE: Plusieurs stratégies peuvent être employées pour introduire la protéine solubilisée par un détergent dans des liposomes. Pour CLC-ec1 dialyse fonctionne bien et est donc la méthode de choix ^6,9,10.

1. Ajouter la protéine purifiée de la protéine souhaitée à des lipides (P / L) rapport (exprimé en pg o f protéine / mg de lipide). Le choix du rapport P / L dépend du but de l'expérience.
   1. Si le but est d'évaluer l'activité de la protéine d'intérêt, à haute reconstituer P / L's pour maximiser le signal, chaque liposome contient des copies multiples de la protéine. Pour quantifier l'activité et / ou la vitesse de transport unitaire de la protéine, reconstituer dans un régime à basse dilution Poisson P / L's, de sorte que chaque vésicule contient en moyenne une protéine. Voir l'étape 7 et discussion pour une analyse plus approfondie de l'utilisation de chaque régime.
2. Pour déterminer les valeurs P / L optimales pour les différents schémas, effectuer un titrage complet de l'activité en fonction de la concentration en protéine ^8,11-13. Toutefois, pour toute protéine pour laquelle le poids moléculaire (MW, exprimée en kDa) de l'unité active est connu dans le P / L valeurs suivantes peuvent être utilisés comme des estimations approximatives initiales:
   pg "/>
   
3. Charger le mélange de protéines et de lipides dans un tube de dialyse pré-mouillée ou une cassette. Placer le dispositif de dialyse dans un bêcher contenant 500-1,000x le volume du tampon de reconstitution lipide (par exemple, une mémoire tampon pour L 1 ml de lipide) remise en suspension sous agitation douce.
   1. Changer tampon 3-4 fois à intervalles> 3 h. A chaque changement de solution, laver la cassette / tube et le bécher avec de l'eau distillée et remplir le bécher avec le tampon de reconstitution frais. Inclure 1-2 O N / intervalles pour le changement de solution. Le nombre exact et la durée des changements de la solution dépend de la lipide exacte et les détergents utilisés.
4. Après la dernière étape est terminée, retirez les liposomes de la cuve de dialyse, les aliquoter dans des tubes et flash les congeler dans un liquide N ₂ ou gel à -80 ° C.

3. Enregistrement Set-up

NOTE: L'enregistrement mis en place (figure 2A) se compose de deux chambres (cylindres à fond plat, ~ 3-4 ml de volume), un Cl ^- (voir ci-dessous) électrode, un pH-mètre avec un analogue ou sortie numérique électrique, un numériseur et un ordinateur avec un logiciel d'acquisition appropriée.

1. Connecter le Cl ^- électrode de pH-mètre, la sortie de l'appareil de mesure du pH au numériseur qui est relié à l'ordinateur. Placer l'électrode de référence dans une chambre de recodage et le fil dans l'autre (figure 2B).
   NOTE: La polarité des fils est correct si AV _Cal (voir l'étape 6.4 et 7.2) est positif.
2. Placez les chambres sur une plaque d'agitation avec un barreau d'agitation dans la chambre d'enregistrement (figure 1B). Assurez-vous que la barre d'agitation ne touche pas l'électrode.
3. Raccorder les chambres en utilisant un pont d'agar (figure 2B) (100 mM de KCl et 2% d'agarose). Conserver les ponts Agar dans 100 mM de KCl.

4. Préparation du Cl ^- électrode

1. Prenez un vieux et -possibly- électrode de pH non-fonctionnement. Briser le revêtement de verre pour révéler complètement les fils d'argent.
2. Retirez délicatement le revêtement des fils d'argent en utilisant une lame de scalpel. Nettoyez les fils à l'aide de grandes quantités de H ₂ O et EtOH.
3. Placer dans une solution saturée de FeCl ₃ (ou eau de Javel) jusqu'à ce que les fils sont recouverts d'un manteau sombre uniforme de AgCl.

5. Préparation de vésicules unilamellaires

1. La nuit avant les expériences, gonfler 1 g de Sephadex G-50 perles dans 15 ml de tampon externe (1 mM de KCl, 150 mM de K ₂ SO _4, l'acide citrique 25 mM, pH 4,5) en agitant doucement (Ne pas remuer) pour au moins trois heures à température ambiante avant utilisation. Chaque expérience nécessite ~ 3 ml de perles gonflées. Gardez les perles gonflées à 4 ° C pendant quelques jours au plus.
2. Alors que les liposomes sont décongélation à température ambiante, verser dans chaque colonne ~ 3 ml de gonflées G-50 perles. Laissez-les sécher par gravité à la température ambiante; cela prend habituellement 1-2 min.
3. Préparer vésicules unilamellaires par extrusion des protéoliposomes 11 fois à travers un mini-extrudeuse en utilisant un seuil de coupure de 0,4 m de Teflon.
4. Placer la colonne dans un tube à fond rond en matière plastique. Faites tourner les colonnes pour éliminer l'excès de solution. Centrifuger pendant 20 à 30 secondes à 1400 xg dans une centrifugeuse clinique.
5. Jeter accréditives, lieu colonne dans un tube de verre 13 x 100 mm et ajouter 100 pi des vésicules extrudées à la colonne. Spin colonne pendant 1 min à 500 g dans une centrifugeuse clinique.
6. Recueillir ~ 200 pi d'accréditives qui seront ajoutés à la chambre d'enregistrement à l'étape 6.5.

6. Efflux mesure

1. Placer 2 ml de 100 mM de KCl dans la référence (masse) chambre et 1,8 ml du tampon externe (1 mM de KCl, 150 mM de K ₂ SO _4, l'acide citrique mM 25 à pH 4,5) à la chambre d'enregistrement. Le léger déséquilibre osmotique entre l'interneet des solutions externes ne affecte pas
2. Démarrez le programme d'acquisition. Laissez la ligne de base équilibrer, cela peut prendre quelques minutes.
3. Une fois le signal atteint une ligne de base stable (les liposomes sont prêts et les colonnes sèches), commencer l'enregistrement (figure 3A).
4. Ajouter 15 ul d'une solution 10 mM de KCl pour calibrer le système (figure 2A).
5. Ajouter liposomes. Un petit saut pourrait être visible en raison de l'élimination incomplète de Cl externe ^- des protéoliposomes (figure 3A). Attendez que la ligne de base se stabilise.
6. Ajouter valinomycine (1 ul à 1 mg / ml dans EtOH) pour initier l'efflux (figure 3A).
7. Laissez l'efflux suivre son évolution dans le temps jusqu'à ce qu'il plateaux (figure 3A).
8. Ajouter 40 ul de 1,5 M β-octylglucoside (β-OG) préparé dans le tampon externe pour dissoudre tous les liposomes (figure 3A). Terminez l'enregistrement.

7. A donnéesnalyse

1. Exportez le fichier de trace à partir dans un format ASCII ou texte et l'importer dans le programme d'analyse de choix.
2. Mesurer la tension aux points suivants (figure 3A):
   Au début de l'enregistrement (V _0);
   Après addition de l'impulsion d'étalonnage (V _cal);
   Après addition des liposomes (V _lipo);
   A la fin de l'écoulement (V _fin);
   Après addition de détergent (V _tot);
   Baseline les tensions de sorte que V ₀ = 0.
3. Utilisez l'équation de Nernst-Planck pour déterminer la valeur expérimentale de en mesurant
   
   Où Vol _Cal est le volume de l'impulsion d'étalonnage dans ul, 1800 est le volume de la chambre au début de l'expérience exprimée en1; l, [Cl] _{cal / en} sont les Cl ^- les concentrations de l'impulsion de l'étalonnage et de la mémoire tampon externe mM et AV _cal est le saut en mV mesurée après l'impulsion d'étalonnage.
   NOTE: Cette détermination empirique de α répond à trois objectifs: il se assure que le système répond correctement, offre une mesure de la cohérence de la réponse de l'instrument entre les expériences ainsi que pour vérifier qu'aucun erreurs ont été commises dans la fabrication de la solution.
4. Calculer les concentrations en Cl après chaque étape comme suit:
   
   
   
   Le facteur 3/400 vient de la dilution de l'impulsion de calibrage de 15 ul dans un volume final de 2000 pl.
5. Calculmangé les changements dans [Cl] à chaque étape, ΔCl _{lipo / FIN / tot.}
6. Autre V (t) Cl (t) avec
   
   Directement déterminer les [CL] valeurs aux points critiques et de les comparer aux valeurs calculées comme un contrôle interne.
7. Normaliser la trace de sorte que la ^lipo Cl _rel = 0 et Cl _rel ^tot = 1
   
8. Monter le cours de temps d'écoulement à l'équation suivante:
   
   Où L est le taux de Cl ^- fuite qui est déterminé expérimentalement en mesurant Cl ^- efflux de liposomes exempts de protéines préparés dans les mêmes conditions et τ est la constante de temps du processus.
9. Calculer v, la vitesse initiale:
   
   Lorsque ΔCl _ailette est exprimée en millimoles et V est le volume de la chambre en pi.
10. Calculer le taux de transport / conductance
    
    Où p est le rapport P / L, MW est le poids moléculaire du complexe actif exprimée en kDa

Résultats

Nous décrivons un protocole détaillé et robuste pour mesurer Cl ^- le transport médié par la SIC-ec1 purifiée, un type CTC procaryote H ⁺ / Cl ^- échangeur, reconstituée dans des liposomes. Une représentation schématique de l'expérience est illustré à la figure 3 protéoliposomes reconstituées avec la SIC-ec1 purifié et contenant haute Cl interne ^-. Sont immergés dans une solution de bain contenant faible Cl ^-. Dans ces conditions ...

Discussion

Nous avons décrit un protocole détaillé pour mesurer Cl ^- le transport médié par les canaux ou transporteurs reconstitués dans des liposomes anioniques sélectif purifiés. L'exemple utilisé était le procaryote H ⁺ / Cl ^- Échangeur CLC-CE1. Toutefois, la méthode peut être facilement adapté à l'étude canaux gated par des ligands ^{12,13,15, 11,12} tension, ou de sport différente sélectivité anionique ^15,16 en remplaçant le Ag: AgCl par celle ad...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 Benchtop	Thermo Scientific
Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter			These can be found on Ebay.
Non-functional pH probe			Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.
DI-710 Data Logger	DATAQ instruments
WinDAQ acquisition software	DATAQ instruments
Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass	Kimble Chase	73500-13100
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids Inc.	610000
Computer