Proteoliposome מבוסס הזרימה Assay כדי לקבוע מאפייני מולקולה בודדת של Cl<sup-&gt;</sup&gt; ערוצים ומסועים

Summary

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Abstract

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl^- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl^- from proteoliposomes following the addition of the K⁺ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H⁺/Cl^- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl^- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

Introduction

בשני עשורים האחרונים את יכולת ביטוי יתר ולטהר חלבוני קרום תחבורה גדלה באופן דרמטי: תעלות יונים, מובילים ראשיים ומשניים כעת מטוהרים באופן שיגרתי ממערכות ביטוי Heterologous כמו גם מקורות טבעיים. גישות חדשות כדי לפקח על ביטוי, לשפר ולהקל על החילוץ ולשפר את היציבות של חלבונים אלו נמצאות בעיצומה פיתחו ^1-5. פריצות דרך טכנולוגיות אלה כבר סייעו במפעילים הפיצוץ של מידע מבני ברמה האטומית על חלבוני קרום ש, בתורו, העמיקו את ההבנה של הבסיסים המבניים של תפקידם שלנו. בניגוד לכך, היכולת שלנו לחקור את התכונות פונקציונליות של החלבונים המטוהרים לא גדלה באותו קצב, כך שבמקרים מסוימים מידע מבני ברזולוציה גבוהה מלווה בנתונים פונקציונליים איכותיים, הגבלת היכולת שלנו לבדוק כמותית תחזיות המבוסס על מבנה וכך. לפיכך, development של מבחני פונקציונליים כמותי ולהכליל הוא צעד מפתח כלפי הבהרת היסודות מכניסטית של תפקוד חלבון קרום.

כאן אנו מתארים assay זרימה שיכול לשמש כדי לקבוע כמותית תכונות פעילות מרכזית של Cl מטוהר ומחדש ^- ערוצים ומובילים. העקרונות שבבסיס assay ניתן להכליל את מגוון רחב של מערכות תחבורה, כמו גם לחלבוני הובלת יון שאינו. ליפוזומים מחדש עם Cl מטוהרים ^- ערוץ / מובילים בנוכחות Cl גדול ^- שיפוע (איור 1 א ', ב'). Cl ^- זרימה היא ביוזמת התוספת של ionophore כדי לאפשר לשטף דלפק-יון, במקרה שלנו K ⁺ ionophore valinomycin, אשר לדחוק את המתח שהוקם על ידי Cl ^- השיפוע ולהגדיר את פוטנציאל הקרום הראשוני לפוטנציאל שיווי המשקל של K ^{+ 6,7.} ללא tהוא ionophore לא Cl נטו משמעותי ^- בזרימת מתרחשת, כפי שהוא מונע על ידי הדור של פוטנציאל הטרנסממברני. הנתונים מתואר כמותית על ידי שני פרמטרים הניתנים למדידה (איור 1 ג): τ, מתמיד של Cl זמן ^- בזרימת, וf _0, את החלק היחסי של יפוזומים לא מכילים חלבון פעיל. מτ וf ₀ Cl יחידתי ^- שיעור תחבורה, את החלק היחסי של חלבונים פעילים והמסה המולקולרית של המתחם הפעיל ניתן לגזור ^8. הטכניקה מודגמת כאן על ידי שימוש proteoliposomes מחדש עם CLC-ec1, H CLC-סוג מאופיין היטב ⁺ / Cl ^- מחליף של מבנה ותפקוד ידועים. assay זה להכליל בקלות לערוצים או מובילים עם הסלקטיביות יונית שונה או שפעילותם תלויה בנוכחות של מתח ו / או ligands. יתר על כן, assay זה יכול לשמש כדי לקבוע אם מולקולות קטנות משפיעות ישירות על החלבון מחדש,כדי לכמת את ההשפעות של תרכובות וכיצד הרכב קרום או חומרים כימיים המשנה את שומנים בדם משפיעים על התפקוד של הערוצים ומובילים מחדש אלה.

Protocol

1. הכנה ליפידים

1. Aliquot שומני כמות הרצויה לתוך צינור זכוכית שקוף. השימוש E. תמצית coli קוטב שומנים בדם, אבל רוב יצירות שומנים ניתן להשתמש. אם השומנים הם בצורת אבקה, resuspend אותם בכלורופורם לריכוז של 20 מ"ג / מיליליטר. ייבש את השומנים בRT תחת N ₂ גז עד שכל הממס התאדה.
2. Resuspend השומנים בפנטן ולייבש אותו שוב זרם יציב של הגז N ₂ כדי להסיר עקבות שאריות של כלורופורם. יבש עד שכל הממס התאדה. בעוד ייבוש, בעדינות לסובב את הצינור כך שהשומנים מופץ בסרט אחיד המכסה את השליש התחתון של הצינור ולא מסה צפופה ויוצרת בתחתית.
3. הוסף את חומר הניקוי המכיל חיץ הכינון מחדש (300 מ"מ KCl, 50 חומצת לימון מ"מ, 25 מ"מ K _{2 4} HPO, pH 4.5, 35 מ"מ בחורים) לפזר את השומנים. להשתמש בחומרי ניקוי עדינים אחרים בשלב זה אם החלבון הוא גרוע סובלני לבחורים.
4. Resuspenד השומנים לבהירות באמצעות sonicator אמבט מים. לטבול את הצינור במרכז האמבטיה sonicator מים בכוח מרבי בפולסים קצרים (30 דקות שניות-1) עם (דקות שניות-1 30) קצרות עוצר. הפתרון צריך להיות ברור.
   הערה: התואר האחרון של בהירות השיג תלויה בהרכב השומנים הספציפי בשימוש. איזו וריאציה בשלב זה, אצווה לתצווה אפילו בין שומנים להלכה זהים, הוא גם אפשרית. האובך שיורית הוא עקב פיזור אור על ידי חלקיקים גדולים בהשעיה, אשר ניתן להסירו על ידי צנטריפוגה.
5. דגירה שומני resuspended ב RT עבור 20-60 דקות.

2. כינונה Proteoliposome

הערה: מספר אסטרטגיות יכולה להיות מועסקות על מנת להכניס את חלבון אבקת-solubilized ליפוזומים. לCLC-ec1 דיאליזה עובדת היטב, ולכן השיטה של בחירה ^6,9,10.

1. הוסף את החלבון המטוהר לחלבון הרצוי לשומנים בדם (P / L) יחס (באו לידי ביטוי במיקרוגרם o f חלבון / מ"ג שומנים בדם). הבחירה של יחס P / L תלויה במטרת הניסוי.
   1. אם המטרה היא להעריך את הפעילות של החלבון של עניין, מחדש בP הגבוה L's על מנת למקסם את / האות, כמו כל liposome מכיל מספר עותקים של החלבון. כדי לכמת את הפעילות ו / או שיעור תחבורה אחיד של החלבון, מחדש במשטר דילול Poisson בP הנמוך / L's, כך שכל שלפוחית ​​מכילה חלבון על 1 ממוצע. ראה שלב 7 ודיון ליותר בניתוח המעמיק של מתי להשתמש בכל משטר.
2. כדי לקבוע את ערכי P / L אופטימליים למשטרים השונים, לבצע טיטרציה של הפעילות מלאה כפונקציה של ריכוז חלבון ^8,11-13. עם זאת, לכל חלבון שהמשקל המולקולרי (MW, בא לידי ביטוי בKDA) של היחידה הפעילה ידוע ערכי L / P הבאים יכולים לשמש כguesstimates ראשוני:
   pg "/>
   
3. טען את החלבון ותערובת שומנים בצינור דיאליזה טרום רטוב או קלטת. מניחים את מכשיר הדיאליזה בכוס המכילה 500-1,000x היקף חיץ הכינון מחדש שומנים (כלומר, חיץ L 1 ל1 מיליליטר של resuspension שומנים בדם) תחת ערבוב עדין.
   1. חיץ שינוי 3-4 פעמים במרווחים> 3 שעות. בכל החלפת פתרון, לשטוף את הקלטת / צינורות ואת הכוס עם מים מזוקקים ולמלא את הכוס עם חיץ הכינון מחדש טרי. כולל 1-2 O מרווחי N / לשינוי הפתרון. המספר ומשך הזמן המדויק של שינויי הפתרון תלוי בשומנים המדויקים וחומרי הניקוי המשמשים.
4. לאחר השלב האחרון הוא מלא, להסיר את יפוזומים מספינת הדיאליזה, aliquot אותם בצינורות ופלאש להקפיא אותם בנוזל N ₂ או הקפאה ב -80 מעלות צלזיוס.

3. הקלטת Set-up

הערה: הגדרת הקלטה (איור 2 א) מורכב משני תאים (צילינדרי תחתית שטוחה, ~ 3-4 מיליליטר נפח), Cl ^- (ראה להלן) אלקטרודה, מטר pH עם אנלוגי או פלט דיגיטלי חשמל, digitizer, ומחשב עם תוכנת רכישה מתאימה.

1. חבר את Cl ^- אלקטרודה למטר pH, הפלט של מטר pH לdigitizer אשר מחובר למחשב. מניחים את האלקטרודה ההתייחסות בחדר אחד וחוט הקידוד מחדש באחר (איור 2).
   הערה: הקוטביות של החוטים נכונה אם ΔV _קאל (ראה שלב 6.4 ו -7.2) הוא חיובי.
2. מניחים את התאים על צלחת ומערבבים עם בר ומערבב בחדר ההקלטה (איור 1). ודא שהבר והמערבב לא נוגע באלקטרודה.
3. חבר את התאים באמצעות גשר אגר (איור 2) (100 מ"מ KCl ו -2% Agarose). אחסן את הגשרים אגר ב100 מ"מ KCl.

4. הכנת Cl ^- אלקטרודה

1. קח אלקטרודת תפקוד שאינו ישנה ו-possibly-. לשבור את ציפוי הזכוכית כדי לחשוף את חוטי הכסף לחלוטין.
2. מוציא בזהירות את הציפוי מחוטי הכסף באמצעות להב סכין מנתחים. נקה את החוטים באמצעות כמויות עצומות של H ₂ O וEtOH.
3. מקום בתמיסה רוויה של FeCl ₃ (או אקונומיקה) עד חוטים מכוסה במעיל כהה אחיד של AgCl.

5. הכנת Unilamellar שלפוחית

1. בלילה שלפני הניסויים, להתנפח 1 גרם של Sephadex G-50 חרוזים ב 15 מיליליטר של חיץ חיצוני (1 מ"מ KCl, 150 מ"מ K ₂ SO _4, חומצת לימון 25 מ"מ, pH 4.5) עם רעד עדין (לא לעורר) ל לפחות 3 שעות בRT לפני השימוש. כל ניסוי דורש ~ 3 מיליליטר של חרוזים נפוחים. שמור את חרוזים הנפוחים על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים לכל היותר.
2. , בעוד ליפוזומים הם מפשירים בRT לשפוך בכל עמודה ~ 3 מ 'l של G-50 חרוזים נפוחים. לתת להם להתייבש על ידי זרימת כוח הכבידה בRT; זה בדרך כלל לוקח 1-2 דקות.
3. הכן שלפוחית ​​unilamellar באמצעות משייכת proteoliposomes 11 פעמים באמצעות מיני-Extruder באמצעות חתך 0.4 מ 'טפלון.
4. מניחים את הטור בצינור עגול תחתית פלסטיק. ספין העמודות כדי להסיר פתרון עודף. צנטריפוגה למשך 20-30 שניות ב1,400 XG בצנטריפוגה קלינית.
5. זורק זרימת דרך, עמודת מקום בצינור זכוכית 13 x 100 מ"מ ולהוסיף של שלפוחית ​​extruded 100 μl לעמודה. ספין עמודת דקות 1 ב XG 500 בצנטריפוגה קלינית.
6. לאסוף ~ 200 μl של זרימה דרך שיתווסף לתא ההקלטה בשלב 6.5.

6. בזרימת מדידה

1. מקום 2 מיליליטר של 100 מ"מ KCl בהתייחסות הקאמרית (קרקע) ו -1.8 מיליליטר של החיץ החיצוני (1 מ"מ KCl, 150 מ"מ K ₂ SO _4, 25 חומצת לימון מ"מ, pH 4.5) לתא ההקלטה. חוסר האיזון האוסמוטי הקל בין הפנימיופתרונות חיצוניים אינו משפיעים על
2. הפעל את תכנית הרכישה. בואו הבסיס לאזן, זה עלול לקחת כמה דקות.
3. ברגע שהאות מגיעה לבסיס יציב (ליפוזומים מוכנים ועמודות ייבוש), להתחיל בהקלטה (איור 3 א).
4. הוסף 15 μl של פתרון מ"מ KCl 10 לכייל את המערכת (איור 2 א).
5. הוסף ליפוזומים. קפיצה קטנה עשויה להיות גלויה בשל ההסרה חלקית של Cl החיצוני ^- מproteoliposomes (איור 3 א). חכה עד תחילת המחקר מייצב.
6. להוסיף Valinomycin (1 μl ב1 מ"ג / מיליליטר בEtOH) ליזום בזרימת (איור 3 א).
7. בואו הזרימה מיצתה את עצמו הזמן עד שהוא מישורים (איור 3 א).
8. הוסף 40 μl 1.5 M β-octylglucoside (β-OG) שהוכן במאגר החיצוני לפזר כל יפוזומים (איור 3 א). לסיים את ההקלטה.

7. נתוניםnalysis

1. לייצא את קובץ זכר בפורמט ASCII או טקסט ולייבא אותו לתכנית הניתוח של בחירה.
2. מדוד את מתח בנקודות הבאות (איור 3 א):
   בתחילת ההקלטה (V _0);
   לאחר תוספת של דופק הכיול (V _cal);
   לאחר תוספת של יפוזומים _(שאיבת V);
   בסופו של הזרימה _(סנפיר V);
   לאחר תוספת של חומרי ניקוי _(tot V);
   Baseline המתחים כך שV ₀ = 0.
3. השתמש במשוואת נרנסט-פלאנק כדי לקבוע את הערך הניסיוני של על ידי מדידה
   
   איפה כרך _קאל הוא הנפח של דופק הכיול בμl, 1,800 הוא קאמרי הנפח בתחילת הניסוי בא לידי ביטוי ב1; l, [Cl] _{קאל / בהוא} Cl ^- ריכוזים של דופק הכיול ולמאגר החיצוני במ"מ וΔV _cal הוא הקפיצה בmV נמדדה לאחר דופק הכיול.
   הערה: קביעה אמפירית זה של α משרתת שלוש מטרות: הוא מבטיח כי המערכת מגיבה כראוי, מציעה מידה מסוימת של העקביות של התגובה של המכשיר בין ניסויים, כמו גם לבדוק שאין טעויות נעשו בהתהוות הפתרון.
4. חשב את ריכוזי Cl לאחר כל שלב באופן הבא:
   
   
   
   הגורם 3/400 מגיע מהירידה בשיעור דופק כיול 15 μl לתוך הנפח הסופי 2,000 μl.
5. Calculאכלתי את השינויים ב[ Cl] בכל שלב, _שאיבת ΔCl _{/ סנפיר / tot.}
6. המרת V (t) בCl (t) עם
   
   ישירות לקבוע את הערכים [Cl] בנקודות הקריטיות ולהשוות אותם לערכים מחושבים כבקרה פנימית.
7. לנרמל את העקבות כך ^ששאיבת _rel = 0 Cl וCl _rel ^tot = 1
   
8. להתאים את מהלך הזמן בזרימת למשוואה הבאה:
   
   כאשר L הוא שיעור Cl ^- הדליפה שנקבע באופן ניסיוני על ידי מדידת Cl ^- זרימה מיפוזומים ללא חלבון מוכן באותם תנאים וτ הוא מתמיד של התהליך הזמן.
9. לחשב v, המהירות ההתחלתית:
   
   איפה _סנפיר ΔCl בא לידי הביטוי בmillimolar וV הוא הנפח של החדר בμl.
10. לחשב את שיעור תחבורה / מוליכות
    
    איפה p הוא P / L, MW הוא המשקל המולקולרי של המתחם הפעיל בא לידי ביטוי בkDa

תוצאות

אנו מתארים פרוטוקול מפורט וחזק כדי למדוד Cl ^- תחבורה בתיווכו של CLC-ec1 המטוהר, H פרוקריוטים CLC הסוג ⁺ / Cl ^- מחליף, מחדש ביפוזומים. ייצוג סכמטי של הניסוי מוצג באיור 3 Proteoliposomes מחדש עם CLC-ec1 מטוהר ומכיל Cl הפנימי גבוה ^-. שקוע בפתרון אמבטיה המכיל Cl הנ...

Discussion

יש לנו תיארנו פרוטוקול מפורט למדידת Cl ^- תחבורה בתיווכו של ערוצי אניון סלקטיבי מטוהרים או מובילים מחדש ביפוזומים. הדוגמא בה השתמשה הייתה H ⁺ / Cl פרוקריוטים ^- מחליף CLC-ec1. עם זאת, מתודולוגיה ניתן להתאים בקלות ללמוד ערוצים מגודר על ידי ligands ^12,13,15, מתח

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 Benchtop	Thermo Scientific
Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter			These can be found on Ebay.
Non-functional pH probe			Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.
DI-710 Data Logger	DATAQ instruments
WinDAQ acquisition software	DATAQ instruments
Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass	Kimble Chase	73500-13100
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids Inc.	610000
Computer