A Proteoliposome-Based Efflux Assay per determinare le proprietà singola molecola di Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canali e trasportatori

Riepilogo

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Abstract

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl^- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl^- from proteoliposomes following the addition of the K⁺ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H⁺/Cl^- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl^- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

Introduzione

Negli ultimi due decenni la capacità di iperespressione e purificare proteine ​​di trasporto di membrana è drammaticamente aumentato: i canali ionici, trasportatori primari e secondari sono ormai di routine purificati da sistemi di espressione eterologhi e fonti naturali. Nuovi approcci per monitorare l'espressione, di migliorare e facilitare l'estrazione e migliorare la stabilità di queste proteine ​​sono in continua evoluzione ^1-5. Queste innovazioni tecnologiche sono state fondamentali per innescare l'esplosione di livello atomico informazioni sulla struttura delle proteine ​​di membrana che, a sua volta, migliorato la nostra comprensione delle basi strutturali della loro funzione. Al contrario, la nostra capacità di sondare le proprietà funzionali delle proteine ​​purificate non aumenta alla stessa velocità, in modo che in alcuni casi alta risoluzione informazione strutturale è accompagnato da dati qualitativi funzionali, limitando così la possibilità di verificare quantitativamente predizioni basati sulla struttura. Quindi, la SVILUPPOt di saggi funzionali quantitativi e generalizzabili è un passo fondamentale verso la delucidazione delle basi meccanicistiche della funzione delle proteine ​​di membrana.

Qui si descrive un saggio di efflusso che può essere usato per determinare quantitativamente importanti proprietà funzionali purificati e ricostituiti Cl ^- canali e trasportatori. I principi alla base del dosaggio può essere generalizzati ad una varietà di sistemi di trasporto, nonché proteine ​​non-ionici trasporto. I liposomi vengono ricostituiti con purificati Cl ^- canale / trasportatori in presenza di un grande Cl ^- gradiente (Figura 1A, B). Cl ^- efflusso viene avviata mediante l'aggiunta di uno ionoforo per consentire flusso contro-ione, nel nostro caso il K ⁺ ionoforo valinomicina, che shunt la tensione stabilita dal Cl ^- gradiente e impostare il potenziale di membrana iniziale al potenziale di equilibrio di K ^{+ 6,7.} Senza tegli ionoforo significative netto Cl ^- verifica efflusso, in quanto è impedita dalla generazione di un potenziale transmembrana. I dati sono quantitativamente descritto da due parametri misurabili (Figura 1C): τ la costante di tempo di Cl ^- efflusso, e f _0, la frazione di liposomi contenenti una proteina attiva. Da τ e f ₀ unitario Cl ^- velocità di trasporto, la frazione di proteine ​​attive e la massa molecolare del complesso attivo possono essere derivate ^8. La tecnica è illustrata qui utilizzando proteoliposomi ricostituiti con CLC-EC1, un ben caratterizzato CLC-type H ⁺ / Cl ^- scambiatore di struttura e funzione nota. Questo saggio è facilmente generalizzabile a canali o trasportatori con selettività ionica differente o la cui attività dipende dalla presenza di tensione e / o leganti. Inoltre, questo test può essere utilizzato per determinare se piccole molecole influenzano direttamente la proteina ricostituito,per quantificare gli effetti di questi composti e come composizione membrana o reagenti ipolipemizzanti influiscono sulla funzione dei canali ricostituiti e trasportatori.

Protocollo

1. Lipid Preparazione

1. Aliquota lipidi quantità desiderata in un tubo di vetro trasparente. Vedi. coli estratto lipidico polare, ma la maggior parte delle composizioni lipidiche possono essere usati. Se i lipidi sono in forma di polvere, risospendere in cloroformio ad una concentrazione di 20 mg / ml. Asciugare i lipidi a RT in N ₂ gas fino a quando tutto il solvente è evaporato.
2. Risospendere i lipidi in pentano e asciugare nuovamente un flusso costante di gas N ₂ per eliminare tracce residue di cloroformio. Dry fino a che tutto il solvente è evaporato. Mentre l'essiccazione, ruotare delicatamente il tubo in modo che il lipide è distribuito in una pellicola uniforme che copre la parte inferiore del tubo piuttosto che formare una densa massa sul fondo.
3. Aggiungere il tampone di ricostituzione contenente detersivo (KCl 300 mm, 50 acido citrico mM, 25 mm K ₂ HPO _4, pH 4.5, 35 CHAPS mm) per sciogliere i lipidi. Utilizzare altri detergenti delicati per questo passo se la proteina è scarsamente tollerante CHAPS.
4. Resuspend i lipidi di chiarezza con un sonicatore bagnomaria. Immergere il tubo nel centro del bagno sonicatore acqua alla potenza massima breve (30 sec-1 min) con impulsi brevi (30 sec-1 min) interrompe. La soluzione dovrebbe diventare chiaro.
   NOTA: Il grado finale di chiarezza raggiunto dipende dalla composizione lipidica specifico utilizzato. Alcune variazioni da lotto a lotto in questa fase, anche tra lipidi nominalmente identici, è anche possibile. Haze residuo è dovuta alla dispersione della luce da grandi particelle in sospensione, che può essere rimosso mediante centrifugazione.
5. Incubare i lipidi risospeso a RT per 20-60 min.

2. Proteoliposome Formazione

NOTA: Diverse strategie può essere impiegato per inserire la proteina detergente solubilizzato in liposomi. Per CLC-EC1 dialisi funziona bene ed è quindi il metodo di scelta ^6,9,10.

1. Aggiungere la proteina purificata alla desiderata proteina-to-lipidi (P / L) Rapporto (espressa in mg o f Proteine ​​/ mg lipidi). La scelta del rapporto P / L dipende dallo scopo dell'esperimento.
   1. Se l'obiettivo è quello di valutare l'attività della proteina di interesse, ricostituire ad alta P / L's per massimizzare il segnale, in quanto ogni liposoma contiene più copie della proteina. Per quantificare l'attività e / o velocità di trasporto unitario della proteina, ricostituire in un regime di diluizione Poisson a bassa P / L's, in modo che ogni vescicola contiene in media 1 proteine. Vedere il punto 7 e discussione per una più approfondita analisi di quando usare ogni regime.
2. Per determinare i valori ottimali P / L per i vari regimi, effettuare una titolazione completa dell'attività in funzione della concentrazione proteica ^8,11-13. Tuttavia, per ogni proteina per la quale il peso molecolare (MW, espresso in kDa) dell'unità attiva è noto i seguenti valori P / L possono essere utilizzati come guesstimates iniziali:
   pg "/>
   
3. Caricare la miscela di proteine ​​e lipidi in un tubo di dialisi pre-bagnata o una cassetta. Posizionare il dispositivo di dialisi in un becher contenente 500-1,000x il volume del buffer lipidi ricostituzione (cioè, 1 tampone L per 1 ml di lipidi risospensione) sotto leggera agitazione.
   1. Change tampone 3-4 volte a intervalli> 3 ore. Ad ogni cambio soluzione, lavare la cassetta / tubo e il bicchiere con acqua distillata e riempire il bicchiere con tampone di ricostituzione fresca. Includere 1-2 O / N intervalli per il cambio soluzione. Il numero esatto e durata delle modifiche soluzione dipende lipide esatta e detergenti utilizzati.
4. Dopo l'ultimo passo, rimuovere i liposomi dalla nave di dialisi, le aliquote in tubi e flash li congelare in N liquido ₂ o congelamento a -80 ° C.

3. Registrazione Set-up

NOTA: La registrazione set-up (Figura 2A) si compone di due camere (cilindri a fondo piatto, ~ 3-4 volumi ml), un Cl ^- (vedi sotto) elettrodo, un pH-metro con un analogo o uscita digitale elettrica, un digitalizzatore, e un computer con un appropriato software di acquisizione.

1. Collegare il Cl ^- elettrodo al pH-metro, l'uscita del misuratore di pH al digitalizzatore, che è collegata al computer. Inserire l'elettrodo di riferimento in una camera e il filo ricodifica nell'altro (Figura 2B).
   NOTA: La polarità dei fili è corretto se ΔV _Cal (vedi punto 6.4 e 7.2) è positivo.
2. Mettere le camere su un piatto mescolare con un ancoretta in camera di registrazione (Figura 1B). Assicurarsi che la ancoretta non tocchi l'elettrodo.
3. Collegare camere utilizzando un ponte di agar (Figura 2B) (KCl 100 mM e 2% agarosio). Conservare i ponti Agar in KCl 100 mm.

4. Preparazione del Cl ^- Elettrodo

1. Prendete un vecchio e -possibly- elettrodo non funzionante pH. Rompere il rivestimento di vetro per rivelare completamente i fili d'argento.
2. Rimuovere delicatamente il rivestimento dai fili d'argento con una lama di bisturi. Pulire i fili con abbondanti quantità di H ₂ O e EtOH.
3. Mettere in una soluzione satura di FeCl ₃ (o candeggina) fino fili sono coperti con un mantello scuro uniforme di AgCl.

5. Preparazione di unilamellari vescicole

1. La notte prima degli esperimenti, si gonfiano 1 g di Sephadex G-50 perle in 15 ml di tampone esterna (1 mM KCl, 150 mm K ₂ SO _4, acido citrico 25 mM, pH 4.5) con agitando delicatamente (non mescolare) per almeno 3 ore a temperatura ambiente prima dell'uso. Ogni esperimento richiede ~ 3 ml di perle gonfie. Mantenere le perle gonfie a 4 ° C per pochi giorni al massimo.
2. Mentre i liposomi sono scongelamento a RT, versare in ogni colonna ~ 3 ml di gonfiore G-50 perline. Lasciate asciugare per flusso di gravità a RT; questo richiede di solito 1-2 min.
3. Preparare vescicole unilamellari estrudendo i proteoliposomi 11 volte attraverso un mini-estrusore utilizzando un taglio 0,4 m Teflon.
4. Porre la colonna in un tubo a fondo tondo di plastica. Gira le colonne per rimuovere la soluzione in eccesso. Centrifugare per 20-30 secondi a 1.400 xg in una centrifuga clinica.
5. Scartare flow-through, colonna posto in un tubo di vetro 13 x 100 mm e aggiungere 100 ml di vescicole estrusi alla colonna. Spin colonna per 1 min a 500 xg in una centrifuga clinica.
6. Raccogliere ~ 200 ml di flusso continuo che verranno aggiunti alla camera di registrazione al punto 6.5.

6. Efflux misura

1. 2 ml di KCl 100 mm di riferimento (terra) da camera e 1,8 ml del tampone esterna (1 mM KCl, 150 mm K ₂ SO _4, 25 acido citrico mM, pH 4,5) per la camera di registrazione. Il leggero squilibrio osmotico tra l'internoe soluzioni esterne non influisce
2. Avviare il programma di acquisizione. Lasciate che la linea di base equilibrare, l'operazione potrebbe richiedere alcuni minuti.
3. Una volta che il segnale raggiunge una linea di base stabile (liposomi sono pronti e le colonne asciugare), avviare la registrazione (Figura 3A).
4. Aggiungere 15 ml di una soluzione 10 mM KCl per calibrare il sistema (Figura 2A).
5. Aggiungi liposomi. Un piccolo salto potrebbe essere visibile a causa della rimozione incompleta di Cl esterni ^- dalle proteoliposomi (Figura 3A). Aspetta la linea di base si stabilizza.
6. Aggiungere Valinomicina (1 ml a 1 mg / ml in EtOH) per avviare efflusso (Figura 3A).
7. Lasciate che l'efflusso suo corso tempo fino a che altipiani (Figura 3A).
8. Aggiungere 40 ml di 1,5 M β-octylglucoside (β-OG) preparato nel buffer esterna per sciogliere tutti liposomi (Figura 3A). Terminare la registrazione.

7. Dati AANALISI

1. Esportare il file di traccia da in formato ASCII o testo e importarlo nel programma di analisi di scelta.
2. Misurare la tensione nei seguenti punti (Figura 3A):
   All'inizio della registrazione (V _0);
   Dopo aggiunta dell'impulso di taratura (V _cal);
   Dopo l'aggiunta dei liposomi (V _lipo);
   Alla fine del efflusso (V _fin);
   Dopo l'aggiunta di detergente (V _tot);
   Baseline le tensioni in modo che V ₀ = 0.
3. Utilizzare l'equazione di Nernst-Plank per determinare il valore sperimentale misurando
   
   Dove Vol _Cal è il volume dell'impulso di taratura in ml, 1.800 è il volume della camera all'inizio dell'esperimento espressa1; l, [Cl] _{cal / a} sono il Cl ^- concentrazioni di impulso di calibrazione e del cuscinetto esterno in mM e ΔV _cal è il salto in mV misurata dopo l'impulso di taratura.
   NOTA: Questa determinazione empirica di α tre scopi: garantisce che il sistema risponde correttamente, offre una misura della coerenza della risposta dello strumento tra esperimenti e controllare che errori sono stati fatti nella fabbricazione soluzione.
4. Calcolare le concentrazioni Cl dopo ogni passaggio come segue:
   
   
   
   Il fattore 3/400 proviene dalla diluizione dell'impulso di taratura 15 microlitri nel volume finale di 2000 ml.
5. Calculmangiato i cambiamenti [Cl] ad ogni passo, ΔCl _{lipo / def / tot.}
6. Convertire V (t) in Cl (t) con
   
   Direttamente determinare i valori [Cl] nei punti critici e confrontarle con i valori calcolati come controllo interno.
7. Normalizzare la traccia in modo che la ^lipo Cl _rel = 0 e Cl _rel ^tot = 1
   
8. Montare corso tempo di efflusso la seguente equazione:
   
   Quando L è il tasso di Cl ^- perdita che è sperimentalmente determinata misurando Cl ^- efflusso da liposomi privi di proteine ​​preparati nelle stesse condizioni e τ è la costante di tempo del processo.
9. Calcolare v, la velocità iniziale:
   
   Dove ΔCl _pinna è espresso in millimolare e V è il volume della camera in microlitri.
10. Calcolare il tasso di trasporto / conduttanza
    
    Dove P è il P / L, MW è il peso molecolare del complesso attivo espresso in kDa

Risultati

Descriviamo un protocollo dettagliato e robusto per misurare Cl ^- il trasporto mediato da purificato CLC-EC1, un procariotico CLC-tipo H ⁺ / Cl ^- scambiatore, ricostituito in liposomi. Una rappresentazione schematica dell'esperimento è mostrato in Figura 3 proteoliposomi ricostituiti con purificato CLC-CE1 e con alta Cl interna ^-. Sono immersi in una soluzione bagno contenente bassa Cl ^-. In queste condizioni net Cl ^- efflusso è imp...

Discussione

Abbiamo descritto un protocollo dettagliato per misurare Cl ^- il trasporto mediato da canali anione selettivo purificati o trasportatori ricostituiti in liposomi. L'esempio è stato utilizzato il procariote H ⁺ / Cl ^- Scambiatore CLC-EC1. Tuttavia, il metodo può essere facilmente adattato per studiare canali gated da ligandi ^{12,13,15, 11,12} tensione, o sportive diversa selettività anionico ^15,16 sostituendo l'Ag: Elettrodo AgCl con uno adatto ione in esame...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 Benchtop	Thermo Scientific
Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter			These can be found on Ebay.
Non-functional pH probe			Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.
DI-710 Data Logger	DATAQ instruments
WinDAQ acquisition software	DATAQ instruments
Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass	Kimble Chase	73500-13100
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids Inc.	610000
Computer