Ein Proteoliposom Basierte Efflux-Assay auf Einzelmoleküleigenschaften von Cl Bestimmen<sup&gt; -</sup&gt; Kanäle und Transporter

Zusammenfassung

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Zusammenfassung

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl^- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl^- from proteoliposomes following the addition of the K⁺ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H⁺/Cl^- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl^- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

Einleitung

In den letzten zwei Jahrzehnten die Fähigkeit, Überexpression und Reinigung von Membrantransportproteine ​​hat sich dramatisch erhöht: Ionenkanäle, primäre und sekundäre Transporter werden nun routinemäßig von heterologen Expressionssystemen sowie natürlichen Quellen gereinigt. Neue Wege in der Ausdrucks überwachen, zu verbessern und die Extraktion und erhöhen die Stabilität dieser Proteine ​​werden ständig weiterentwickelt ^1-5. Diese technologischen Durchbrüche haben dazu beigetragen, das Auslösen der Explosion der Atomebene Informationen über die Struktur von Membranproteinen, die wiederum verbessert das Verständnis der strukturellen Grundlagen ihrer Funktion. Im Gegensatz dazu können wir auch die funktionellen Eigenschaften der gereinigten Proteine ​​Sonde nicht mit der gleichen Geschwindigkeit zu erhöhen, so dass in einigen Fällen hochauflösende Strukturinformation durch qualitative Funktionsdaten begleitet, wodurch die Fähigkeit zur quantitativen Test strukturbasierte Prognosen einschränkend. Daher ist die development quantitativer und verallgemeinerbare funktionellen Tests ist ein wichtiger Schritt zur Aufklärung der mechanistischen Grundlagen von Membranproteinfunktion.

Hier beschreiben wir eine Auslauf Assay, der verwendet werden kann, wichtige Funktionseigenschaften gereinigt und wiederhergestellt Cl quantitativ zu bestimmen ^- Kanäle und Transporter. Die Prinzipien des Assays Basiswert kann auf eine Vielzahl von Transportsystemen, sowie auf nichtIonenTransportProteine ​​verallgemeinern. Kanal / Transporter in Gegenwart eines großen Cl ^{- -} ​​Liposomen werden mit gereinigtem Cl rekonstituiert Gradienten (1A, B). Cl ^- Ausfluß wird durch die Zugabe eines Ionophors initiiert, um für Gegenionenfluss zu ermöglichen, in unserem Fall der K ⁺ Ionophor Valinomycin, der die Spannung von der etablierten Cl Shunt ^- Gradienten und den ursprünglichen Membranpotential auf das Gleichgewichtspotential von K ^{+ 6,7.} Ohne ter Ionophor keine signifikante Netto Cl ^- Efflux auftritt, wie es durch die Erzeugung eines Transmembranpotentials verhindert. ^- Efflux und f _0, die Fraktion von Liposomen keine aktive Protein enthaltenden τ die Zeitkonstante von Cl: Die Daten werden quantitativ durch zwei messbare Parameter (Abbildung 1C) beschrieben. Von τ und f ₀ die unitäre Cl ^- Transportgeschwindigkeit kann der Anteil von aktiven Proteinen und die Molekularmasse des aktiven Komplexes ⁸ abgeleitet werden. Tauscher bekannter Struktur und Funktion ^- Die Technik wird hier mit Proteo mit CLC-ec1, einem gut charakterisierten CLC-Typ H ⁺ / Cl wiederhergestellt dargestellt. Dieser Assay wird leicht um Kanäle oder Transporteure mit unterschiedlicher Ionenselektivität, oder deren Aktivität von der Anwesenheit von Spannung und / oder Liganden verallgemeinert. Darüber hinaus kann dieser Assay verwendet werden, um zu bestimmen, ob kleine Moleküle unmittelbar auf die rekonstituierte Protein,um die Wirkungen dieser Verbindungen und wie die Zusammensetzung der Membran oder Lipidmodifizierungsreagenzien auf die Funktion der rekonstituierten Kanäle und Transporter zu quantifizieren.

Protokoll

1. Lipid Vorbereitung

1. Aliquot die gewünschte Menge Lipide in eine klare Glasröhre. Du Siehst. coli polaren Lipidextrakt, aber die meisten Lipidzusammensetzungen verwendet werden. Wenn die Lipide in Form von Pulver, resuspendieren sie in Chloroform bis zu einer Konzentration von 20 mg / ml. Trocknen der Lipide bei RT unter N _{2 -Gas,} bis das gesamte Lösungsmittel verdampft ist.
2. Resuspendieren der Lipide in Pentan und trocknen Sie es wieder einen stetigen Strom von Gas N ₂ zu übrig gebliebenen Spuren von Chloroform zu entfernen. Trocken, bis alle Lösungsmittel verdampft. Während des Trocknens, stark drehen das Rohr, so dass das Lipid in einer gleichförmigen Film, der die untere Drittel des Rohres anstelle einer Bildung einer dichten Masse am Boden verteilt.
3. Hinzufügen der Rekonstitutionspuffer enthält Detergens (300 mM KCl, 50 mM Zitronensäure, 25 mM K ₂ HPO _4, pH 4,5, 35 mM CHAPS), um die Lipide zu lösen. Benutzen Sie anderen milden Reinigungsmitteln für diesen Schritt, wenn das Protein ist schlecht, tolerant zu CHAPS.
4. Resuspend die Lipide zur Klarheit mit einem Wasserbad Sonicator. Tauchen Sie den Schlauch in der Mitte des Wassers Ultraschallbad bei maximaler Leistung in kurzen (30 sec-1 min) mit kurzen Impulsen (30 sec-1 min) unterbricht. Die Lösung sollte klar sein.
   HINWEIS: Die endgültige Grad an Klarheit erreicht, hängt von der spezifischen verwendeten Lipid-Zusammensetzung. Einige von Charge zu Charge Variation in diesem Schritt auch bei nominell identischen Lipiden ist ebenfalls möglich. Resttrübung aufgrund der Lichtstreuung durch große Partikel in der Suspension, welche durch Zentrifugation entfernt werden kann.
5. Inkubieren der resuspendierten Lipide bei RT für 20-60 min.

2. Proteoliposom Bildung

HINWEIS: Verschiedene Strategien können verwendet werden, um das Detergens-solubilisierten Protein in Liposomen einfügen. Für CLC-ec1 Dialyse funktioniert gut und ist daher das Mittel der Wahl ^6,9,10.

1. Füge das gereinigte Protein, das gewünschte Protein-zu-Lipid (P / L) Verhältnis (in ug o ausgedrückt f Protein / mg Lipid). Die Wahl von P / L-Verhältnis hängt von dem Zweck des Experiments.
   1. Wenn es das Ziel ist es, die Aktivität des Proteins von Interesse zu bewerten, zu rekonstituieren bei hohen P / L's, um das Signal zu maximieren, da jedes Liposom mehrere Kopien des Proteins enthält. Um die Aktivität und / oder einheitlichen Transportrate des Proteins zu quantifizieren, zu rekonstituieren in einer Poisson Verdünnungsregelung bei niedrigen P / L's, so daß jedes Vesikel enthalten durchschnittlich 1 Protein. Siehe Schritt 7 und Diskussion für eine tiefergehende Analyse, wann die einzelnen Regime zu nutzen.
2. Um die optimale P / L-Werte für die verschiedenen Schemata zu bestimmen, führen eine vollständige Titration der Aktivität als Funktion der Proteinkonzentration ^8,11-13. Jedoch für jedes Protein, für das das Molekulargewicht (MW, in kDa exprimiert) der aktiven Einheit ist bekannt folgende P / L-Werte als Anfangs guesstimates verwendet werden:
   pg "/>
   
3. Geladen, die das Protein und Lipidgemisch in eine vorbefeuchtete Dialyserohr oder eine Kassette. Platzieren der Dialyseeinrichtung in einem Becherglas mit 500-1,000x das Volumen der Lipid Rekonstitutionspuffer (dh 1 l Puffer für 1 ml Lipid Resuspension) unter vorsichtigem Rühren.
   1. Ändern Puffer 3-4 mal im Abstand> 3 Std. Bei jeder Lösung Wechsel, waschen Sie die Kassette / Schläuche und das Becherglas mit destilliertem Wasser und füllen Sie den Becher mit frischem Rekonstitutionspuffer. Fügen Sie 1-2 O / N Intervalle für die Lösung zu ändern. Die genaue Anzahl und die Dauer der Lösung ändert sich abhängig von der genauen Lipid und Detergentien verwendet.
4. Nachdem der letzte Schritt ist, entfernen Sie die Liposomen aus dem Dialysegefäß, aliquotieren sie in Rohre und Flash frieren sie in flüssigem N ₂ oder Einfrieren bei -80 ° C.

3. Aufnahme Set-up

Hinweis: Die Aufnahme-Setup (Abbildung 2A) besteht aus zwei Kammern (Flachboden-Zylinder, ~ 3-4 ml Volumen), eine Cl ^- (siehe unten) Elektrode, einem pH-Meter mit einem Analog- oder digitale elektrische Ausgang, einen Digitalisierer und einen Computer mit einem entsprechenden Erfassungssoftware.

1. Verbinden der Cl ^- Elektrode mit dem pH-Meter, das Ausgangssignal des pH-Meter auf dem Digitalisierer die an den Computer angeschlossen ist. Legen Sie die Referenzelektrode in einer Kammer und die Umkodierung Draht in die andere (2B).
   HINWEIS: Die Polarität der Leitungen ist korrekt, wenn AV _Cal (siehe Schritt 6.4 und 7.2) ist positiv.
2. Legen Sie die Kammern auf einer Rührplatte mit einem Rührstäbchen in den Aufnahmeraum (Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, der Rührstab nicht die Elektrode berühren.
3. Schließen der Kammern mit einem Agarbrücke (2B) (100 mM KCl und 2% Agarose). Bewahren Sie die Agar-Brücken in 100 mM KCl.

4. Vorbereitung der Cl ^- Elektroden

1. Nehmen Sie einen alten und -possibly- nicht funktionierende pH-Elektrode. Brechen Sie die Glas-Beschichtung, um die Silberdrähte vollständig offenbaren.
2. Die Beschichtung vorsichtig aus der Silberdrähte mit einem Skalpell. Reinigen Sie die Drähte mit reichlich H ₂ O und EtOH.
3. Platz in einer gesättigten Lösung von FeCl ₃ (oder Bleichmittel), bis Drähte mit einem einheitlichen dunklen Mantel AgCl bedeckt.

5. Herstellung von unilamellaren Vesikeln

1. In der Nacht vor den Experimenten, schwellen 1 g Sephadex G-50-Perlen in 15 ml externen Puffer (1 mM KCl, 150 mM K ₂ SO _4, 25 mM Zitronensäure, pH 4,5) unter leichtem Schütteln (nicht rühren) für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur vor dem Gebrauch. Jedes Experiment erfordert ~ 3 ml geschwollene Perlen. Halten Sie die geschwollenen Perlen bei 4 ° C für ein paar Tage in den meisten.
2. Während die Liposomen bei RT aufgetaut, gießen Sie in jeder Spalte ~ 3 ml geschwollene G-50-Perlen. Lassen Sie sie trocknen durch Schwerkraft bei RT; Dies dauert in der Regel 1-2 min.
3. Bereiten unilamellare Vesikel durch Extrudieren des Proteo 11 Mal durch ein Mini-Extruder mit einer 0,4 m Teflon-Cutoff.
4. Die Säule in einem Kunststoffrundrohr. Drehen Sie die Spalten, um überschüssige Lösung zu entfernen. Zentrifugieren Sie für 20 bis 30 s bei 1400 x g in einer klinischen Zentrifuge.
5. Durchfluss verwerfen, statt Spalte in einer 13 x 100 mm Glasröhrchen und fügen Sie 100 ul der extrudierte Vesikel an der Säule. Spin Säule für 1 min bei 500 xg in einer klinischen Zentrifuge.
6. Sammeln ~ 200 ul Durchströmung zu dem Aufzeichnungskammer in Schritt 6.5 hinzugefügt wird.

6. Efflux Mess

1. Je 2 ml 100 mM KCl in der Referenz (Masse) Kammer und 1,8 ml der externen Puffer (1 mM KCl, 150 mM K ₂ SO _4, 25 mM Citronensäure, pH 4.5) zur Aufnahme Kammer. Der leichte osmotischen Ungleichgewicht zwischen der internenund externe Lösungen wirkt sich nicht auf
2. Starten Sie die Aufnahme-Programm. Lassen Sie die Grundlinie ins Gleichgewicht kommen, dies kann einige Minuten dauern.
3. Sobald das Signal eine stabile Basislinie (die Liposomen bereit sind und die Spalten trocknen) erreicht, startet die Aufnahme (3A).
4. Werden 15 ul einer 10 mM KCl-Lösung, um das System (2A) zu kalibrieren.
5. In Liposomen. Von Proteoliposomen (3A) ^- ein kleiner Sprung vielleicht aufgrund einer unvollständigen Entfernung der externen Cl sichtbar. Warten Sie, bis die Grundlinie stabilisiert.
6. Hinzufügen Valinomycin (1 ul 1 mg / ml in EtOH) zum Ausströmen (3A) zu initiieren.
7. Lassen Sie die Auslauf laufen ihr zeitlicher Verlauf, bis es Plateaus (3A).
8. Hinzufügen von 40 ul von 1,5 M β-Octylglucosid (β-OG) in dem externen Puffer alle Liposomen (3A) zu lösen, hergestellt. Beenden Sie die Aufnahme.

7. Daten Analyse

1. Exportieren Sie die Trace-Datei von der im ASCII- oder Text-Format und importieren Sie sie in die Analyse-Programm der Wahl.
2. Messen Sie die Spannung an den folgenden Punkten (3A):
   Zu Beginn der Aufnahme (V _0);
   Nach Zugabe des Eichpulses (V _cal);
   Nach der Zugabe der Liposomen (V _lipo);
   Am Ende des Auslauf (V _fin);
   Nach Zugabe von Reinigungsmittel (V _ges);
   Grundlinie die Spannungen so dass V ₀ = 0 ist.
3. Verwenden Sie die Nernst-Planck-Gleichung, um den experimentellen Wert bestimmen durch Messung
   
   Wo Vol _Cal ist das Volumen der Kalibrierungspuls in ul, 1.800 wird das Kammervolumen zu Beginn des Experiments in exprimiert1, l, [Cl] _{cal / in} sind die Cl ^- Konzentrationen der Kalibrierungsimpuls und der externen Puffer in mM und AV _cal ist der Sprung in mV nach dem Kalibrierungsimpuls gemessen.
   ANMERKUNG: Diese empirische Bestimmung α dient drei Zwecken: sie gewährleistet, dass das System korrekt reagiert, bietet ein Maß für die Konsistenz der Reaktion des Instruments zwischen den Experimenten als auch zu prüfen, dass keine Fehler in der Lösung Herstellung hergestellt.
4. Berechnen Sie die Cl-Konzentrationen nach jedem Schritt wie folgt:
   
   
   
   Der Faktor 3/400 kommt von der Verdünnung der 15 & mgr; l Kalibrierungspuls in die 2.000 & mgr; l Endvolumen.
5. Calculaßen die Veränderungen in [Cl] bei jedem Schritt, ΔCl _{Lipo / end / ges.}
6. Konvertieren V (t) in Cl (t) mit
   
   Die [Cl] Werte direkt zu bestimmen, an den kritischen Punkten und vergleicht sie mit den berechneten Werten als eine interne Kontrolle.
7. Normalisieren der Spur, so dass das Cl _rel ^Lipo = 0 und Cl _rel ^tot = 1
   
8. Den Auslaufzeit natürlich der folgenden Gleichung:
   
   Wobei L die Rate der Cl ^- Leck, die experimentell durch Messung bestimmt wird Cl ^- Efflux aus proteinfreien Liposomen unter den gleichen Bedingungen und τ hergestellt wird die Zeitkonstante des Prozesses.
9. Berechnen v, die Anfangsgeschwindigkeit:
   
   Wo ΔCl _Rippe in millimolaren ausgedrückt und V das Volumen der Kammer in ul.
10. Berechnen Sie die Transportgeschwindigkeit / Leitwert
    
    Wobei p der P / L, MW das Molekulargewicht des aktiven Komplexes, ausgedrückt in kDa

Ergebnisse

Wir beschreiben eine detaillierte und robuste Protokoll zu messen Cl ^- Transport von gereinigtem CLC-ec1, einem prokaryontischen CLC-Typ H ⁺ / Cl vermittelt ^- Tauscher, in Liposomen rekonstituiert. Eine schematische Darstellung des Experiments ist in Abbildung 3 dargestellt Proteoliposomen mit gereinigtem CLC-EC1 und mit hohen internen Cl rekonstituiert. ^- In einer Badlösung, die geringe Cl taucht ^-. Unter diesen Bedingungen net Cl ^- Aus...

Diskussion

Transport von gereinigtem anionenselektive Kanäle oder Transporter in Liposomen rekonstituiert vermittelt ^- haben wir ein ausführliches Protokoll zu messen Cl beschrieben. Das verwendete Beispiel war der prokaryotischen H ⁺ / Cl ^- Tauscher CLC-ec1. Jedoch kann die Methodik leicht angepasst, um Kanäle durch Liganden ^{12,13,15, 11,12} Spannung oder sportlich verschiedenen anionischen Selektivität ^15,16 durch Ersetzen des Ag gated untersuchen: AgCl-Elektrode mit eine...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 Benchtop	Thermo Scientific
Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter			These can be found on Ebay.
Non-functional pH probe			Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.
DI-710 Data Logger	DATAQ instruments
WinDAQ acquisition software	DATAQ instruments
Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass	Kimble Chase	73500-13100
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids Inc.	610000
Computer