Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는<sup&gt; -</sup&gt; 채널 및 전송기

요약

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

초록

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl^- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl^- from proteoliposomes following the addition of the K⁺ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H⁺/Cl^- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl^- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

서문

마지막 두 과발현과 막 수송 단백질을 정제 할 수있는 능력이 크게 증가하고있다 수십 년 : 이온 채널, 일차 및 이차 전송기들은 보통 이종 발현 시스템뿐만 아니라, 천연 공급원으로부터 정제된다. 이 단백질의 안정성을, 표현을 모니터링 개선하고 추출을 용이하게하고 강화하는 새로운 접근 방식은 끊임없이 ^1-5 개발되고있다. 이러한 기술 혁신은 차례로, 그 기능의 구조적 기지에 대한 우리의 이해를 강화, 막 단백질에 원자 수준의 구조 정보의 폭발을 유발하는 데 큰 도움이되고있다. 반면에, 우리의 능력은 어떤 경우에는 고해상도 구조적 정보가 따라서 정량적 구조 기반 예측을 테스트 할 수있는 능력을 제한 질적 기능 데이터에 의해 수반되도록, 동일한 비율로 증가하지 않은 정제 된 단백질의 기능적 특성을 프로빙. 따라서, developmen는양적 일반화 기능 분석의 t는 막 단백질의 기능 기계론 토대 해명 향해 중요한 단계이다.

채널 및 전송기 ^{- 준비} 정량적 정제하고 재구성 CL의 주요 기능적 특성을 결정하기 위해 사용될 수 유출 분석을 기술한다. 분석을위한 원칙은 교통 시스템뿐만 아니라 다양한 비 이온 수송 단백질로 일반화 될 수있다. 채널 / CL 대형의 존재 수송차 ^{- -} 정제 된 리포솜 CL로 녹이고 구배 (도 1A, B). CL이 ^- 유출가 우리의 경우에는, 반대 이온 플럭스 있도록 이온 운반체의 첨가에 의해 개시되는 K ⁺ 이온 운반체 발리 노마 이신 (Valinomycin), CL에 의해 설정된 전압 션트되는 ^- 구배 및 K의 평형 전위로 초기 막 전위를 설정할 ^{+ 6,7.} t없이이 횡단 전위의 발생에 의해 방지로 유출이 발생, ^- 그는 더 중요한 순 (CL)을 이온 운반체가 없습니다. ^- 유출 및 F _0, 활성 단백질을 함유하지 않은 리포좀 분획 τ, CL의 시상수 : 정량적 데이터는 두 개의 측정 파라미터 (도 1C)에 의해 설명된다. τ와 f ₀ CL에서 단일 ^- 전송 속도, 활성 단백질의 활성 분획물 및 복합체의 분자량은 ⁸ 유도 될 수있다. 알려진 구조와 기능의 교환기 ^-이 기술은 CLC-EC1, 잘 특성화 된 CLC 형 H ⁺ / CL로 재구성 테오를 사용하여 여기에 예시되어있다. 상기 분석 용이 전압 활성 및 / 또는 리간드의 존재에 따라 상이한 또는 이온 선택성 채널들 또는 컨베이어로 일반화된다. 또한,이 분석은 소분자 직접 영향을 미치는 단백질 재구성 여부를 결정하는데 사용될 수있다,이들 화합물 및 방법에 막 조성물 또는 지질 - 변경 시약 재구성 채널들 및 수송의 기능에 영향을 미치는 영향을 정량.

프로토콜

1. 지질 준비

1. 투명 유리 튜브로 원하는 양의 지질 나누어지는. 사용 E. 콜라이 극성 지질 추출물하지만 대부분 지질 조성물을 사용할 수있다. 지질이 분말 형태 인 경우, 20 ㎎ / ㎖의 농도로 이들을 클로로포름에 재현 탁. 모든 용매가 증발 할 때까지 N ₂ 가스에서 RT에서 지질을 건조.
2. 펜탄의 지질을 재현 탁 클로로포름의 남은 흔적을 제거하기 위해 다시 가스 N _2를 일정하게 건조시킨다. 드라이 모든 용매를 증발 할 때까지. 건조 동안 지질이 아래쪽 형성 치밀한 질량보다는 튜브의 아래쪽을 덮는 제 균일 한 막 분포되도록 부드럽게 회전 튜브.
3. 재구성 버퍼 함유 세제를 추가 (300 mM의 KCl을 50 mM의 시트르산, 25 mM의 K ₂ HPO _4의 pH 4.5, 35 mM의 CHAPS)은 지질을 용해. 단백질이 CHAPS에 가난하게 허용하는 경우이 단계에서 다른 중성 세제를 사용하십시오.
4. Resuspen물 목욕 초음파기를 사용하여 선명도 지질 거라고. 짧은 (30 초 - 1 분)와 짧은 (30 초 - 1 분) 펄스를 최대 전력에서 물 초음파기 목욕의 중심에 튜브를 담가 일시 중지합니다. 이 솔루션은 명확하게해야한다.
   주 : 최종 명확성 정도 달성​​ 사용될 특정 지질 조성에 의존한다. 심지어 동일한 명목상 지질이 단계 중 일부 뱃치 간 변이는 것도 가능하다. 잔류 헤이즈를 원심 분리에 의해 제거 될 수 현탁액 중의 큰 입자에 의한 광의 산란에 기인한다.
5. 20 ~ 60 분 동안 실온에서 재현 탁 지질을 품어.

2. Proteoliposome 형성

주 : 몇 가지 전략은 리포좀으로 세제 용해 된 단백질을 삽​​입하기 위해 사용될 수있다. CLC-EC1은 투석은 잘 작동하기 때문에 선택 ^6,9,10의 방법이다.

1. 로 정제 된 단백질을 추가 원하는 단백질로 지질 μg의 O를 표현 (P / L) 비율 ( F 단백질 / mg의 지질). P / L 비의 선택은 실험의 목적에 의존한다.
   1. 목표는 관심있는 단백질의 활성을 평가 높은 P에 재구성하는 경우 각 리포좀 단백질의 여러 복사본을 포함합니다 / L'들, 신호를 최대화한다. 각 소포 평균 한 단백질에 포함되도록 활성 및 / 또는 단백질의 단일 전송 레이트를 수치화하기 위해, 낮은 P / L' s의 포아송 희석 정권 재구성한다. 각 체제를 사용하는 경우보다 깊이 분석을위한 7 단계 및 토론을 참조하십시오.
2. 다양한 섭생에 대한 최적의 P / L 값을 결정하려면, ^8,11-13 단백질 농도의 함수로서 활성의 완전한 적정을 수행한다. 그러나, 활성 단위의 분자량 (MW가 kDa의 표시)하는 모든 단백질을 다음 P / ℓ를 초기 값을 절반으로 사용될 수있는 공지되어있다 :
   PG "/>
   
3. 미리 유체 접촉 투석 튜브 또는 카세트에 단백질과 지질 혼합물을로드합니다. 500-1,000x 지질 재구성 버퍼의 양을 함유하는 비이커에 투석 장치를 배치 (즉, 지질 부유 1 ㎖를 1 L 버퍼) 부드러운 교반하에.
   1. 변경 버퍼 간격> 3 시간에 3-4 회. 모든 솔루션 변화에서, 카세트 / 튜브 및 증류수로 비커를 씻어 신선한 재구성 버퍼 비커를 입력합니다. 솔루션 변화 1-2 O / N 간격을 포함합니다. 용액 변경의 정확한 수와 기간이 사용될 정확한 지질 및 세제에 의존한다.
4. 마지막 단계가 완료된 후, 투석 용기로부터 제거 리포좀 튜브들을 분취 플래시 -80 ° C에서 _액상이 N 또는 동결 그들을 동결.

3. 녹화 환경

참고 : 녹화 설정 (그림 2A)이 두 개의 챔버 (평면 바닥 실린더, ~ 3-4 ml의 부피), CL로 구성 ^- 전극, 아날로그와 pH 측정기 (아래 참조) 디지털 전기 출력, 디지타이저 및 적절한 수집 소프트웨어와 컴퓨터 나.

1. pH 미터 전극을, 컴퓨터에 연결되어 디지타이저 pH 미터의 출력 ^- CL을 연결한다. 하나의 챔버에서 기준 전극과 다른 (그림 2B)에서 레코딩 와이어를 놓습니다.
   주 : _{칼 ΔV가} 양수 (단계 6.4 및 7.2 참조)의 경우에는 와이어 극성이 맞는지.
2. 기록 챔버 (그림 1B)에서 교반 막대와 볶음 접시에 챔버를 놓습니다. 교반 막대를 전극에 접촉하지 않도록하십시오.
3. 한천 다리 (그림 2B) (100 mM의 KCl을 2 % 아가로 오스)를 사용하여 챔버를 연결합니다. 100 mM의 KCl을의 한천 다리를 저장합니다.

CL 4. 준비 ^- 전극

1. 과거와 -possibly- 작동하지 않는 pH 전극을 가져 가라. 완전히 실버 와이어를 공개 유리막 브레이크.
2. 조심스럽게 메스 블레이드를 사용하여 실버 와이어에서 코팅을 제거합니다. H ₂ O와의 EtOH 풍부한 양을 사용하여 와이어를 청소합니다.
3. 전선까지 _50ml을 (또는 표백제)의 포화 용액에 장소의 AgCl의 균일 한 어두운 코트 덮여있다.

단일 층 소포 5. 준비

1. 실험 전에 밤, 외부 버퍼 15 ㎖ (1 ㎜의 KCl, SO _4, 25 mM의 구연산, 산도 4.5 150 mM의 K ₂₎ 흔들리는 부드러운와가 (저어하지 않음)에 세파 덱스 G-50 구슬의 1g 팽창 사용하기 전에 실온에서 최소 3 시간. 각 실험은 부어 구슬 ~ 3 ㎖가 필요합니다. 기껏해야 몇 일 동안 4 ° C에서 부어 구슬을 유지합니다.
2. 리포좀을 실온에서 해동하는 동안, 각 열 ~ 3m 부어부어 G-50 구슬의 리터. RT 중력 흐름에 의해 그들을 말리면; 이것은 일반적으로 1 ~ 2 분 걸립니다.
3. 0.4 m 테플론 차단을 사용하여 미니 압출기를 통해 테오에게 11 번을 돌출시켜 단일 층 소포를 준비합니다.
4. 플라스틱 둥근 바닥 튜브에 열을 놓습니다. 여분의 용액을 제거하기 위해 열을 스핀. 임상 원심 분리기에서 1,400 XG에 20 ~ 30 초 동안 원심 분리기.
5. 13 X 100mm 유리 튜브의 흐름을 통해, 장소 열을 버리고 컬럼에 돌출 된 소포의 100 μl를 추가합니다. 임상 원심 분리기 500 XG에서 1 분 동안 열을 스핀.
6. 단계 6.5의 기록 챔버에 첨가한다 관류 ~ 200 μL의 수집.

6. 유출 측정

1. 레퍼런스 (접지) 100mm의 챔버의 KCl 2㎖ 및 외부 버퍼의 1.8 ml의 배치 (1 mM의 KCl을을 150 mM의 K ₂ SO _4, 25 mM의 시트르산, pH를 4.5) 기록 챔버. 내부 사이의 약간의 삼투압의 불균형외부 솔루션에 영향을주지 않습니다
2. 취득 프로그램을 시작합니다. 이 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다, 기준이 평형을 보자.
3. 신호를 안정적으로 기준선 (리포좀 준비하고 건조 컬럼)에 도달하면 (도 3a)을 촬영을 시작.
4. 시스템 (그림 2A)를 교정 된 10 mM의 KCl 용액 15 μl를 추가합니다.
5. 리포좀을 추가합니다. 테오 (그림 3A)에서 ^- 작은 점프 인해 외부 CL의 불완전한 제거로 볼 수 있습니다. 베이스 라인이 안정 될 때까지 기다립니다.
6. 발리 노마 이신 (Valinomycin) 추가 (1 mg의 EtOH 중 / ㎖에서 1 μL)은 유출 (그림 3A)를 시작합니다.
7. 유출은 시간 물론 고원까지 (그림 3A)를 실행하자.
8. 모든 리포좀 (그림 3A)을 용해 할 수있는 외부 버퍼에 준비 1.5 M β-옥틸 글루코 시드 (β-OG)의 40 μl를 추가합니다. 촬영을 완료합니다.

7. 데이터nalysis

1. ASCII 또는 텍스트 형식에서 추적 파일을 내보내고 선택의 분석 프로그램으로 가져옵니다.
2. 다음 사항 (도 3A)에서 전압을 측정한다 :
   기록의 시작시 ₍₀ V);
   교정 펄스 _(CAL V)을 첨가 한 후;
   리포좀 _(리포의 V)을 첨가 한 후;
   유출 (V _{지느러미)의} 끝에;
   세제 (V _{어린 아이)을} 첨가 한 후,
   기준 전압 그래서 V ₀ = 0.
3. 실험의 값을 결정 네른스트 - 플랑크 식을 사용하여 측정하여
   
   여기서 권 _칼 μL의 교정 펄스의 부피로 표현 된 실험의 시작에서 챔버 체적은 1800이다1 ^- 교정 펄스와 mm 단위로 외부 버퍼의 농도 ΔV _CAL은 교정 펄스 후에 측정 MV에서 점프입니다 난, [CL] _{CAL /에서하면} CL 있습니다.
   참고 : α의이 경험적인 결정은 세 가지 목적을 수행합니다 : 그것은 시스템이 제대로 응답하는지 보장, 실험 사이에 악기의 응답의 일관성의 측정을 제공뿐만 아니라 실수는 솔루션 결정에 만든되지 않았 음을 확인합니다.
4. 다음 각 단계 후에 CL 농도를 계산한다 :
   
   
   
   400분의 3 인자는 2000 μL의 최종 부피로 15 μL 교정 펄스의 희석에서 온다.
5. Calcul각 단계, _지느러미 ΔCl의 _{사러가 / / TOT에서} [CL]의 변화를 _먹었다.
6. 와 CL (t)에 V (t)를 변환
   
   직접 중요한 지점에서 [CL] 값을 결정하고 내부 통제로 계산 된 값으로 비교합니다.
7. 추적을 정상화 CL _확인해의 ^리포 = 0, CL _확인해 ^무비 = 1 그래서
   
8. 하기 식 유출 경시 맞는 :
   
   CL 실험적으로 측정함으로써 결정된다 누설 ^{- -} L는 Cl의 비율이다 τ와 동일한 조건에서 제조 된 무 단백질 리포좀으로부터 유출이 공정의 시간 상수이다.
9. V, 초기 속도를 계산한다 :
   
   여기서 ΔCl _핀은 밀리몰의 표현 및 V는 μL의 챔버의 체적이다.
10. 전송 속도 / 전도도를 계산
    
    P는 P / L이고, MW는 활성 착물 ​​kDa의 분자량으로 표현

결과

교환기, 리포좀에 재구성 ^- 정제 CLC-EC1, 원핵 CLC 형 H ⁺ / CL에 의해 매개 교통 ^- 우리는 상세하고 강력한 CL을 측정 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 실험 장치의 개략적 인 대표도도 3에 도시되어 정제 된 CLC-EC1 및 높은 내부 CL 함유 재구성은 테오 ^-. 낮은 CL 함유 용액 욕에 침지 ^-. 이러한 조건 그물 CL에서 ^- 유출은 리포좀 (그림 3A)...

토론

정제 음이온 선택적 채널 또는 리포좀에 재구성 수송에 의해 매개 교통 ^- 우리는 상세한 CL을 측정 할 수있는 프로토콜을 설명했다. CLC-EC1을 기 ^- 사용 된 예는 원핵 H ⁺ / CL이었다. 고려중인 이온에 적합한 하나의 AgCl 전극 : 그러나, 방법론 용이 리간드 ^{12,13,15, 11,12} 전압 또는 AG로 대체하여 다른 음이온 선택성 ^{15,16 스포츠} 의해 게이트 된 채널을 연구하기에 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
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IEC Centra CL2 Benchtop	Thermo Scientific
Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter			These can be found on Ebay.
Non-functional pH probe			Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.
DI-710 Data Logger	DATAQ instruments
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