Proteoliposome-Based Efflux Анализ для определения одиночных молекул Свойства Cl<sup&gt; -</sup&gt; Каналы и перевозчиков

Резюме

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Аннотация

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl^- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl^- from proteoliposomes following the addition of the K⁺ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H⁺/Cl^- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl^- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

Введение

В последние два десятилетия способность сверхэкспрессировать и очистить мембранные транспортные белки, резко возросло: ионных каналов, первичные и вторичные транспортеры настоящее время регулярно очищается от гетерологичных системах экспрессии, а также природных источников. Новые подходы к мониторингу выражение, улучшить и облегчить добычу и повышают устойчивость этих белков постоянно разрабатываются ^1-5. Эти технологические прорывы сыграли важную роль в инициировании взрыва структурной информации атомного уровня на мембранных белков, которые, в свою очередь, усилили нашу понимания структурных основ их функции. В отличие от этого, наша способность исследовать функциональные свойства очищенных белков не увеличится с той же скоростью, так что в некоторых случаях структурная информация высокого разрешения сопровождается качественными функциональных данных, тем самым ограничивая нашу способность количественно тестовой структуры на основе прогнозов. Таким образом, РАЗРАБОТКАт количественных и обобщению функциональных анализов является важным шагом на пути к выяснению механистических основ функции мембранных белков.

Здесь мы описываем оттока анализа, который может использоваться для количественного определения ключевых функциональные свойства очищенной и восстановленных Cl ^- каналов и транспортеров. Принципы, лежащие в основе анализа могут быть обобщены на различных транспортных систем, а также лицам, не являющимся ионно-транспортировки белков. Липосомы восстанавливали с очищенными Cl ^- канал / Транспортировка в присутствии большого Cl ^- градиента (рис 1а, б). Cl ^- истечение инициируется добавлением ионофора, чтобы обеспечить поток контр-ионов, в нашем случае К ⁺ ионофор валиномицина, которые шунта напряжение, установленную Cl ^- градиент и установить начальный мембранный потенциал к равновесному потенциалу К ^{+ 6,7.} Без тон не ионофором никакого существенного чистый Cl ^- истечение происходит, как это предотвратить генерации трансмембранного потенциала. Данные количественно описывается двумя измеряемых параметров (Рисунок 1С): τ, постоянная времени Cl ^- истечение, и F _0, фракции липосом, не содержащих активный белок. С τ и F ₀ унитарное Cl ^- транспорт скоростью, доля активных белков и молекулярная масса активного комплекса может быть получена ^8. Способ показан здесь с помощью Протеолипосомы восстановленные с CLC-EC1, хорошо охарактеризованной CLC-типа Н ⁺ / Cl ^- теплообменник известной структуры и функции. Этот анализ легко обобщается на каналы или транспортеры с разной ионной избирательности и чья деятельность зависит от наличия напряжения и / или лигандов. Кроме того, этот анализ может быть использован, чтобы определить, является ли малые молекулы, непосредственно влияет на восстановленный белок,Для количественной оценки влияния этих соединений и, как состав мембраны или липидные модификации реагенты влияют на функцию восстановленных каналов и транспортеров.

протокол

1. липидов Подготовка

1. Алиготе требуемое количество липидов в прозрачной стеклянной трубки. Ты Видишь. палочка полярный липидный экстракт, но большинство липидов композиции могут быть использованы. Если липиды в форме порошка, ресуспендируют их в хлороформе до концентрации 20 мг / мл. Высушите липидов при комнатной температуре под N ₂ газа, пока все растворитель испаряется.
2. Ресуспендируют липидов в пентана и сушат его снова постоянный поток газа N ₂ для удаления оставшихся следов хлороформа. Сухая, пока весь растворитель не испарится. В то время как сушка, осторожно повернуть трубку таким образом, что липидный распространяется в однородной пленки, покрывающей нижнюю треть трубки, а не образующего плотную массу в нижней части.
3. Добавить восстановление буфера, содержащего моющее средство (300 мМ KCl, 50 мМ лимонной кислоты, 25 мМ K ₂ HPO _4, pH 4,5, 35 мМ CHAPS), чтобы растворить липиды. Используйте другие мягкие моющие средства для этого шага, если белок плохо терпимо к гл.
4. ResuspenD липиды ясности с использованием водяной бани ультразвукового. Погрузить трубку в центре обработки ультразвуком воды бане при максимальной мощности короче (30 сек-1 мин) импульсы с короткой (30 сек-1 мин) паузы. Решение должно стать ясно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: конечная степень ясности достигнуто, зависит от конкретного состава липидов используется. Некоторые вариации от партии к партии на этой стадии, даже среди номинально идентичных липидов, также возможно. Остаточный мутности из-за рассеяния света крупными частицами в суспензии, которые могут быть удалены путем центрифугирования.
5. Инкубируйте ресуспендировали липидов при комнатной температуре в течение 20-60 мин.

2. Proteoliposome Формирование

Примечание: несколько стратегий можно использовать для вставки моющего средства, солюбилизированного белка в липосомы. Для CLC-EC1 диализ работает хорошо и поэтому методом выбора ^6,9,10.

1. Добавить очищенный белок нужный белок-чтобы-липида (P / L) соотношение (выраженное в мкг O F белок / мг липида). Выбор коэффициента P / L зависит от целей эксперимента.
   1. Если цель состоит в том, чтобы оценить активность белка, представляющего интерес, восстановить при высокой P / L с максимально сигнал, так как каждый липосом содержит несколько копий белка. Для количественной оценки активности и / или унитарную скорость транспортного белка, восстановить в разведении режима Пуассона при низких P / единиц, так что каждый пузырек содержит в среднем 1 белка. См Шаг 7 и обсуждение на более глубокий анализ, когда использовать каждый режим.
2. Для определения оптимальных значений P / L для различных режимов, выполнить полную титрование деятельности в зависимости от концентрации белка ^8,11-13. Тем не менее, для любого белка, для которых молекулярная масса (MW, выраженного в кДа) активного блока известны следующие значения P / L могут быть использованы в качестве исходных guesstimates:
   PG "/>
   
3. Загрузка белок и липидной смеси в предварительно увлажненной диализа трубки или кассеты. Поместите диализа устройство в химический стакан, содержащий 500-1,000x объем буфера липидов восстанавливающей (т.е. 1 л буфера для 1 мл липидной ресуспендирования) при осторожном перемешивании.
   1. Изменить буфер 3-4 раза с интервалом в> 3 ч. В каждой смене раствора, промойте кассета / трубки и стакан с дистиллированной водой и заполнить стакан со свежим буфером восстановления. Включить 1-2 O / N интервалов для решения меняются. Точное количество и продолжительность раствора изменяется в зависимости от конкретного липида и моющих средств, используемых.
4. После последнего шага завершена, удалите липосом из диализной судна, аликвоту их в трубах и флэш заморозить их в жидком N ₂ или заморозить при температуре -80 ° C.

3. Запись Set-до

Примечание: запись настройки (2А) состоит из двух палат (плоскодонных цилиндров, ~ 3-4 мл объема), в Cl ^- (см ниже) электрод, рН-метр с аналоговым или цифровой выходной электрический, дигитайзер, и компьютер с соответствующим программным обеспечением сбора данных.

1. Подключение Cl ^- электрод рН-метра, выход рН-метра к цифровым преобразователем, который подключен к компьютеру. Поместите электрод сравнения в одной камере и перекодирования провод в другой (рис 2б).
   ПРИМЕЧАНИЕ: полярность проводов правильная, если у Av _Cal (см Шаг 6.4 и 7.2) положительно.
2. Поместите камеры на мешалке с мешалкой в записи камеры (рис 1б). Убедитесь в том, мешалки не прикасайтесь к электроду.
3. Подключите камеры, используя агар мост (рис 2B) (100 мМ КСl и 2% агарозном). Храните мосты агара в 100 мМ KCl.

4. Подготовка Cl ^- Электрод

1. Возьмите старый и -possibly- нефункционирующих рН электрод. Разбить стекло покрытие полностью раскрыть серебряные провода.
2. Осторожно снимите покрытие из серебра проводов, используя лезвие скальпеля. Очистите провода, используя обильное количество H ₂ O и этанола.
3. Место в насыщенном растворе FeCl ₃ (или отбеливателя) до проводов покрыты однородным слоем темно-AgCl.

5. Получение однослойные везикулы

1. Ночь перед экспериментов, зыбь 1 г Сефадекса G-50 шариков в 15 мл внешнего буфера (1 мМ KCl, 150 мМ K ₂ SO _4, 25 мМ лимонной кислоты, pH 4,5) при осторожном встряхивании (не мешают) для по меньшей мере, 3 ч при комнатной температуре перед использованием. Каждый эксперимент требует ~ 3 мл набухшего бисером. Держите опухшие бисером при 4 ° С в течение нескольких дней максимум.
2. В то время как липосомы тают при комнатной температуре, влить в каждый столбец ~ 3 мл опухших G-50 шариков. Дайте им высохнуть самотеком при комнатной температуре; это, как правило, занимает 1-2 мин.
3. Подготовка однослойные везикулы экструзией Протеолипосомы 11 раз через мини-экструдере с использованием 0,4 м тефлоновую среза.
4. Поместите колонку в пластиковом круглым дном трубки. Спин столбцы, чтобы удалить излишки раствора. Центрифуга в течение 20-30 сек при 1400 мкг в клинической центрифуге.
5. Выбросить, положите столбец в 13 х 100 мм стеклянной трубки и добавить 100 мкл экструдированных везикул в колонке. Спин колонка течение 1 мин при 500 х г в клинической центрифуге.
6. Соберите ~ 200 мкл проточные, которые будут добавлены к записи камеры в шаге 6.5.

6. Efflux Измерение

1. Поместите 2 мл 100 мМ KCl в контрольном (земля) камеры и 1,8 мл внешнего буфера (1 мМ KCl, 150 мМ K ₂ SO _4, 25 мМ лимонной кислоты, pH 4,5) в записи камеры. Небольшой осмотическое дисбаланс между внутренними внешние решения не влияет
2. Запустите программу приобретения. Пусть исходная равновесие, это может занять несколько минут.
3. После того, как сигнал достигнет стабильного базовой линии (липосомы готовы и столбцы сухой), начните запись (рис 3а).
4. Добавить 15 мкл 10 мМ KCl решение для калибровки системы (рис 2а).
5. Добавить липосомы. Небольшой скачок может быть видна из-за неполного удаления внешнего Cl ^- от протеолипосом (3А). Подождите, пока базовый стабилизируется.
6. Добавить валиномицина (1 мкл при концентрации 1 мг / мл в этаноле), чтобы инициировать отток (фиг.3А).
7. Пусть истечение запустить его ход времени, пока не наступит плато (рис 3А).
8. Добавить 40 мкл 1,5 М β-октилглюкозида (β-OG), полученного в внешнего буфера для растворения всех липосом (фиг.3А). Конец записи.

7. Данныенализ

1. Экспорт файла трассировки из в формате ASCII или текстовом и импортировать его в программу анализа выбора.
2. Измерьте напряжение в следующих пунктах (3А):
   В начале записи (V _0);
   После добавления калибровочного импульса (V _CAL);
   После того липосом (V _липо);
   В конце оттока (V _ребра);
   После добавления моющего средства (V _TOT);
   Базовый уровень напряжения, так что V ₀ = 0.
3. Используя уравнение Нернста-Планка для определения экспериментальное значение путем измерения
   
   Где Vol _Кэл объем калибровки импульса в мкл, 1800 в объем камеры в начале эксперимента выражается в1, л, [Cl] _{кал / в} являются Cl ^- концентрация калибровочного импульса и внешнего буфера в мм и у Av _кал является скачок в мВ измеряется после калибровки импульса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это эмпирическое определение α служит трем целям: он гарантирует, что система должным образом реагирует, предлагает меру согласованности ответ прибора между экспериментов, а также проверьте, нет ли ошибки не были сделаны в процессе становления решений.
4. Рассчитайте концентрации хлора после каждого следующего шага:
   
   
   
   Коэффициент 3/400 происходит от разведения калибровки импульса 15 мкл в 2000 мкл конечного объема.
5. Calculели изменения в [CL] на каждом шаге, ΔCl _{липосакции / FIN / малыш.}
6. Преобразование V (T) в Cl (Т) с
   
   Непосредственно определить [CL] значения в критических точках и сравнить их с расчетными значениями в качестве внутреннего контроля.
7. Нормализация проследить, чтобы Cl _отн ^липо = 0 и Cl _отн ^малыш = 1
   
8. Установите время отток курс к следующему уравнению:
   
   Там, где L представляет собой скорость Cl ^- утечки, что определяется экспериментально путем измерения Cl ^- отток из небелковых липосом, полученных в тех же условиях, и τ является постоянной времени процесса.
9. Рассчитать V, начальную скорость:
   
   Там, где ΔCl _ребра выражается в миллимолей и V представляет собой объем камеры в мкл.
10. Рассчитайте транспорт / скорость проводимости
    
    Где р P / L, МВт является молекулярная масса активного комплекса выражены в кД

Результаты

Мы описываем подробный и надежный протокол для измерения Cl ^- транспорт, опосредованный очищенной CLC-EC1, прокариотической CLC-типа Н ⁺ / Cl ^- теплообменник, восстановленного в липосомы. Схематическое представление опыта показана на рисунке 3 Протеолипосомы восстан...

Обсуждение

Мы описали подробный протокол для измерения Cl ^- транспорт, опосредованный очищенных анион-селективным каналов или перевозчиков восстановленных в липосомы. Пример был использован прокариотической H ⁺ / Cl ^- теплообменник CLC-EC1. Тем не менее, методика может быть легко адап?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 Benchtop	Thermo Scientific
Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter			These can be found on Ebay.
Non-functional pH probe			Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.
DI-710 Data Logger	DATAQ instruments
WinDAQ acquisition software	DATAQ instruments
Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass	Kimble Chase	73500-13100
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids Inc.	610000
Computer