Bir Proteoliposome Tabanlı effluks Deney Cl Tek-molekül Properties belirleme<sup&gt; -</sup&gt; Kanallar ve Nakliyeciler

Özet

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Özet

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl^- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl^- from proteoliposomes following the addition of the K⁺ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H⁺/Cl^- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl^- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

Giriş

Son iki aşırı ifade eden ve zar nakil proteinleri saflaştırmak için yeteneği önemli ölçüde artmıştır yıllarda: iyon kanalları, birincil ve ikincil taşıyıcıları rutin heterolog sentezleme sistemleri ile olduğu gibi, doğal kaynaklardan saflaştırılır. Bu proteinlerin istikrar, ifade izlemek geliştirmek ve çıkarma kolaylaştırmak ve geliştirmek için yeni yaklaşımlar sürekli ^1-5 geliştirilmektedir. Bu teknolojik devrimler da, kendi işlevinin yapısal üsleri anlayışımızı gelişmiş, membran proteinlerinin atom düzeyinde yapısal bilgi patlamasını tetikleyen vesile olmuştur. Buna karşılık, bizim yetenek bazı durumlarda yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler, böylece kantitatif yapı-tabanlı tahminler sınamak için yeteneğini sınırlayan, nitel verilerle fonksiyonel eşlik böylece, aynı oranda artmadı saflaştırılmış proteinlerin fonksiyonel özelliklerini incelemek için. Bu nedenle, gelişme içerisindenicel ve genellenebilir fonksiyonel testlerin t membran proteini fonksiyonu mekanik temellerinin aydınlatılması yönünde önemli bir adımdır.

Kanal, taşıyıcı ^- Burada kantitatif saflaştınldı ve yeniden Cl anahtar işlevsel özelliklerini belirlemek için kullanılabilecek bir akış deneyi tarif eder. tahlil altında yatan ilkeler taşıma sistemlerinin çeşitli yanı sıra sigara iyon-taşıma proteinlerine jeneralize olabilir. Kanal / büyük Cl mevcudiyetinde taşıyıcıları ^{- -} Lipozomlar saflaştırılmış Cı ile yeniden degrade (Şekil 1A, B). Cı ^- akış bizim durumumuzda, karşı-iyon akışının izin vermek için bir iyonofor ilave edilerek başlatılır K ⁺ iyonoforu Valinomycin, Cl tarafından kurulan gerilim şant olan ^- gradyeni ve K denge potansiyeline ilk membran potansiyeli ayarlanmış ^{+ 6,7.} T olmadanBir transmembran potansiyeli nesil tarafından engellenir gibi akış oluşur, ^- o anlamlı net Cl iyonofor'un. ^- efflux, f _0, aktif protein içermeyen lipozomlar fraksiyonu τ, Cl zaman sabiti: Veri kantitatif iki ölçülebilir parametreler (Şekil 1C) ile tarif edilir. Τ ve f ₀ yekpare Cı kaynaktan ^- taşıma hızı, aktif protein fraksiyonu ve aktif kompleks moleküler kütlesi ⁸ elde edilebilir. Bilinen yapısı ve fonksiyonu değiştirici ^- tekniği CLC-EC1, iyi karakterize CLC-tipi H ⁺ / Cl ile yeniden proteoliposomes kullanarak burada gösterilmektedir. Bu tahlil kolaylıkla aktivite gerilimi ve / veya ligandların varlığına bağlıdır farklı iyonik seçicilik veya kanallar veya nakliyecilere genelleştirilmiş. Bundan başka, bu deney, küçük moleküller, doğrudan yeniden protein etkileyip etkilemediğini belirlemek için kullanılabilir,Bu bileşiklerin ve nasıl membran bileşimi veya lipid-modifiye reaktifler yeniden kanalların ve taşıyıcıların fonksiyonunu etkileyebilir etkilerini ölçmek için.

Protokol

1. Lipid Preparasyonu

1. Saydam bir cam tüp içine istenilen miktarda lipit bölmeyin. Kullanım E. E. coli kutuplu lipit özü, ama en lipit bileşimler kullanılabilir. Lipidler toz biçiminde ise, 20 mg / ml 'lik bir konsantrasyona kadar kloroform bunları yeniden süspanse edin. Bütün solvent buharlaşana kadar _N2 gazı altında oda sıcaklığında lipitler kurutun.
2. Pentan lipitleri tekrar ve kloroform kalan izleri kaldırmak için yeniden gaz N ₂ akışı kurutun. Kuru bütün solvent çekinceye kadar. Kurutma sırasında, lipid altındaki bir biçim verme yoğun kütle yerine borunun alt üçte birini örtmekte olan eşbiçimli bir film dağıtılır ve böylece tüp hafifçe döndürün.
3. Sulandırma tamponu içeren bir deterjan ekleme (300 mM KCI, 50 mM sitrik asit, 25 mM K ₂ HPO _4, pH 4.5, 35 mM CHAPS) lipidler eritin. Protein CHAPS'tan kötü hoşgörülü ise bu adım için diğer hafif deterjanlar kullanın.
4. ResuspenBir su banyosu sonikatör kullanarak netlik lipidler d. Kısa (30 sn-1 dk) ile kısa (30 sn-1 dk) bakliyat maksimum güçte su banyosunda sonikatör merkezinde tüp daldırın duraklar. Çözelti berrak hale gelmelidir.
   Not: açıklık son derece elde kullanılan spesifik yağ bileşimine bağlıdır. Da nominal olarak denk lipidler arasında bu adımda bazı partiden partiye değişkenlik, aynı zamanda mümkündür. Kalıntı bulanıklık santrifüjleme ile çıkarılabilir süspansiyonda büyük parçacıklar tarafından ışık saçılımı kaynaklanmaktadır.
5. 20-60 dakika boyunca oda sıcaklığında yeniden süspansiyon haline lipitler inkübe edin.

2. Proteoliposome Formasyonu

Not: birkaç strateji lipozomlara deterjan çözülmüş protein eklemek için kullanılabilir. CLC-EC1 için diyaliz iyi çalışır ve bu nedenle tercih ^6,9,10 bir yöntemdir.

1. Saflaştırılmış protein ekleyin istenen protein-to-lipid ug o ifade (P / L) oranı ( F proteinine mg / lipid). P / L oranının seçimi deney amacına bağlıdır.
   1. Amaç, ilgi konusu proteinin aktivitesini değerlendirmek yüksek P tekrar oluşturmak için, her lipozom proteininin birden fazla kopyasını içerdiğinden / L ile, sinyali en üst düzeye çıkarmak için. Her bir kesecik ortalama 1 protein ihtiva edecek şekilde aktivitesi ve / veya proteinin üniter nakil oranını ölçmek için, düşük P / L'nin de bir Poisson seyreltme rejiminde sulandırın. Her rejimi kullanmak için ne zaman bir daha derinlemesine analiz için Adım 7 ve Tartışma bakın.
2. Farklı tedavi rejimleri için uygun P / L değerlerini belirlemek için, protein konsantrasyonu ^8,11-13 bir fonksiyonu olarak aktivitesi tam bir titrasyon yapmak. Bununla birlikte, aktif biriminin moleküler ağırlığı (MW kDa olarak belirtilmiştir) için kullanılan herhangi bir protein için, aşağıdaki P / L değerleri ilk guesstimates olarak kullanılabilir bilinmektedir:
   pg "/>
   
3. Önceden ıslatılmış diyaliz tüp veya bir kaset protein ve lipit karışımı yükleyin. 500-1,000x lipit yeniden oluşturma tampon hacmi ihtiva eden bir beher içinde diyaliz cihazı yerleştirin (yani, yağ yeniden süspanse edilmesi için 1 ml 1 L tamponu) hafif karıştırma altında.
   1. Değişim tampon aralıkları> 3 saatte 3-4 kez. Her çözelti, değişiminde, kaset / boru ve damıtılmış su ile beher yıkayın ve taze tampon maddesi ile yeniden oluşturma beher doldurun. Çözelti değişikliği için 1-2 O / N aralıklarını ekleyin. çözüm değişiklikleri tam sayısı ve süresi kullanılan tam lipid ve deterjanlar bağlıdır.
4. Son adım tamamlandıktan sonra, diyaliz tekneden lipozomlar kaldırmak tüpler onları bölmeyin ve flaş -80 ° C'de sıvı N ₂ veya dondurularak onları dondurmak.

3. Kayıt Ayarı

NOT: Kayıt set-up (Şekil 2A) iki odadan (düz tabanlı silindir, ~ 3-4 ml hacimli), bir Cl oluşur ^- elektrot, bir analog bir pH metre (aşağıya bakınız) dijital elektrik çıkışı, bir sayısallaştırıcı ve uygun bir satın alma yazılımı ile bilgisayar veya.

1. PH metre elektrodu, bilgisayara bağlı olan sayısallaştırıcıya pHmetrenin çıkışını ^- Cl bağlayın. Bir odasında referans elektrot ve diğer (Şekil 2B) içinde recoding teli yerleştirin.
   NOT: ΔV _Cal pozitif (Adım 6.4 ve 7.2) ise tellerin kutuplarının doğru.
2. Kayıt odasına (Şekil 1B) ve bir karıştırma çubuğu olan bir karıştırma plakası üzerinde odaları yerleştirin. Karıştırma çubuğu elektrot temas etmediğinden emin olun.
3. Bir agar köprü (Şekil 2B) (100 mM KCI ve% 2 agar) ile ölçme cihazı. 100 mM KCl Agar köprüleri saklayın.

Cl 4. hazırlanması ^- Elektrot

1. Eski ve -possibly- çalışmayan pH elektrodu alın. Tamamen gümüş teller ortaya çıkarmak için cam kaplama kırın.
2. Dikkatlice neşter bıçak kullanarak gümüş teller kaplama çıkarın. _H2, O ve EtOH bol miktarda kullanarak telleri temizleyin.
3. Teller kadar _FeCl3 (ya da ağartıcı) bir doymuş çözeltisi içinde yer AgCİ muntazam bir koyu kaplama ile kaplanmıştır.

Tek tabakalı veziküller 5. N-

1. deneyler önceki gece, dış tamponu, 15 ml (1 mM KCI, SO _4, 25 mM sitrik asit, pH 4.5, 150 mM K _2), hafif sallama ile (kımıldamam) içinde Sephadex G-50 taneleri 1 g kabarma Kullanmadan önce oda sıcaklığında en az 3 saat. Her bir deney, şişmiş boncuk ~ 3 ml gerektirir. En fazla birkaç gün 4 ° C'de şişmiş boncuk tutun.
2. Lipozomlar oda sıcaklığında çözülmesi ederken, her sütun ~ 3 m dökmekşişmiş G-50 taneleri l. Oda sıcaklığında yerçekimi akışı ile onları kuru edelim; Bu genellikle 1-2 dakika sürer.
3. 0.4 m, teflon kesme kullanarak Mini-ekstruderinden proteoliposomes 11 kes ekstrude tek lamelli kesecikler hazırlanır.
4. Plastik yuvarlak dipli bir tüp içinde sütun yerleştirin. Fazla çözüm kaldırmak için sütunları Spin. Bir klinik santrifüj cihazında 1400 x g'de 20-30 saniye santrifüjleyin.
5. 13 x 100 mm cam tüpe akış yoluyla yer sütun atın ve kolona ekstrüde veziküller 100 ul ilave edin. Bir klinik santrifüj cihazında 500 xg'de 1 dakika için sütun dönerler.
6. Aşama 6.5 kayıt odasına eklenecek akış yoluyla ve ~ 200 ul toplayın.

6. akış ölçümü

1. Referans (toprak) bölmesi içinde 100 mM KCl 2 ml ve dış tampon 1.8 ml yerleştirin (1 mM KCI, 150 mM K ₂ SO _4, 25 mM sitrik asit, pH 4.5), kayıt odasına. İç arasındaki hafif ozmotik dengesizlikve dış çözümler etkilemez
2. Satın alma programını başlatın. Bu birkaç dakika sürebilir, temel muvazene edelim.
3. Sinyal istikrarlı bir temel (lipozomlar hazır ve sütunlar kurumaya) ulaştığında, (Şekil 3A) kaydetmeye başlayın.
4. Sistem (Şekil 2A) kalibre edilmesi için bir 10 mM KCI çözeltisi 15 ul ekle.
5. Lipozomlar ekleyin. Proteoliposomes (Şekil 3A) ^- küçük atlama nedeniyle dış Cl eksik çıkarılması için görünür olabilir. Bazal stabilize kadar bekleyin.
6. Valinomycin ekleyin (1 mg EtOH / ml 1 ul) akış (Şekil 3A) gerçekleştirmek için kullanılır.
7. Akış zamanı kursu bu yaylalar kadar (Şekil 3A) çalıştıralım.
8. Tüm lipozomlar (Şekil 3A), çözünmesi için dış tamponu içinde hazırlanmış 1.5 M β-oktilglükozit (β-RG) 40 ul ekle. Kaydı bitirmek.

7. Veri Analysis

1. Bir ASCII veya metin biçiminde gelen izleme dosyası dışa ve seçim analizi programına ithal.
2. Aşağıdaki noktaları (Şekil 3A) Gerilim ölçün:
   Kaydın başlangıcında (V _0);
   Ayarlama sinyali (V _cal) ilave edildikten sonra;
   Lipozomlar (V _lipo) ilave edildikten sonra;
   Efflux (V _kanat) sonunda;
   Deterjan (V _tot) ilave edildikten sonra;
   Temel gerilimler böylece V ₀ = 0.
3. Deneysel değerini belirlemek için, Nernst-Plank denklemi kullanın ölçülerek
   
   Nerede Cilt _Cal ul kalibrasyon nabız hacmi deneyi ifade başında odası hacmi, 1.800 olduğunu1; ^- kalibrasyon nabız ve mM dış tampon konsantrasyonları ve ΔV _cal kalibrasyon darbesi sonrasında ölçülen mV atlama l [CI] _{cal / Cl} vardır.
   NOT: α Bu ampirik belirlenmesi üç amaca hizmet eder: sistem düzgün yanıt olmasını sağlar, deneyler arasındaki enstrümanın tepki tutarlılık ölçüsü sunuyor yanı sıra hiçbir hata çözüm yapımında yapılmış olduğunu kontrol etmek.
4. Aşağıdaki gibi her adımdan sonra Cl konsantrasyonları hesaplayın:
   
   
   
   faktör 3/400 2000 ul nihai hacim içinde 15 ul kalibrasyon darbe seyrelmesi gelir.
5. CalculHer adımda, _fin ΔCl _{lipo / / tot} de [Cl] değişiklikleri _yedik.
6. Ile Cl (t) v (t) dönüştürme
   
   Doğrudan kritik noktalarda [CI] değerlerini belirlemek ve bir iç kontrol olarak hesaplanan değerler bunları karşılaştırmak.
7. Iz Normale Cl _rel = 0 ^lipo ve Cl _rel ^tot = 1 böylece
   
8. Aşağıdaki denkleme akış süresi kursu Fit:
   
   Deneysel olarak Cl ölçülerek belirlenir sızıntısı ^{- -} L Cl oranı olduğu durumda, aynı koşullar ve τ hazırlanan proteinsiz lipozomlardan akışını işleminin zaman sabitidir.
9. V, ilk hız hesaplayın:
   
   Nerede ΔCl _fin milimolar ifade ve V ul odasının hacmi olduğunu.
10. Taşıma hızı / iletkenlik hesaplayın
    
    P P / L olduğu durumda, molekül ağırlığı aktif kompleks molekül ağırlığı kDa olarak ifade edilen

Sonuçlar

Değiştirici, lipozomlar içinde yeniden ^- saflaştırılmış CLC-EC1, bir prokaryotik CLC-tipi H ⁺ / Cl aracılığı taşıma ^- Biz detaylı ve sağlam Cl ölçmek için protokol açıklar. Deneyin şematik bir temsili Şekil 3 'de gösterilmiştir, saflaştırılmış CLC-EC1 ve yüksek iç Cl ihtiva ile yeniden Proteoliposomes ^-., Düşük Cl ihtiva eden bir banyo çözeltisine daldırıldığı ^-. Bu koşullar, net Cl altında ^-

Tartışmalar

Saflaştırılmış anyon-seçici kanallar veya lipozomlar içinde yeniden taşıyıcıları aracılığı ile ulaşım ^- Biz detaylı Cl ölçmek için protokol tanımlanmıştır. CLC-EC1 eşanjöre ^- kullanılan örnek Prokaryotik H ⁺ / CI oldu. Söz konusu iyon için uygun biri ile AgCİ elektrot: Ancak, bu yöntemin hali hazırda ligandlar ^12,13,15, gerilim ^11,12, veya Ag değiştirerek farklı anyonik seçicilik ^15,16 spor geçitleri kanalları çal...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 Benchtop	Thermo Scientific
Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter			These can be found on Ebay.
Non-functional pH probe			Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.
DI-710 Data Logger	DATAQ instruments
WinDAQ acquisition software	DATAQ instruments
Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass	Kimble Chase	73500-13100
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids Inc.	610000
Computer